文摘

更高的干扰素-γ分枝杆菌抗原反应观察牛(母牛)比Bos indicus(瘤牛)牛可能由于抗原识别档案两品种间的差异。本研究评估分枝杆菌抗原进行识别的两个品种。23分枝杆菌抗原检测在46皮肤试验阳性(24个瘤牛和22黑白花牛)使用酶联immunospot试验有关酶联免疫斑点)(打印和多个抗原免疫测定(MAPIA)。成群的牛获得了小束检测抗体的研究。两品种承认大多数的T细胞分枝杆菌抗原频率较低和可比性。ESAT-6,然而,抗原如CFP-10 Rv0287, Rv0288, MPB87, Acr-2, Rv3616c, Rv3879c被公认在更高的频率在瘤牛更高频率的T细胞反应观察到Hsp65品种。此外,类似的抗体反应观察在这两个品种;MPB83 sero-dominant抗原在这两个品种。小束抗体的患病率为81%,相似的两个品种。这一块的工作不可能导致一个明确的结论如果有分枝杆菌识别档案两品种间的差异需要进一步使用声音相似的研究样本量的两个品种。

1。介绍

历史报告表明,牛(母牛所属集团)更容易牛结核病(TB)Bos indicus(瘤牛)[1]。实验研究也表明牛结核病易感性之间的差异牛和Bos indicus品种(1]。最近也发现有荷斯坦牛结核病的发病率高于瘤牛保持在相同饲养条件下在埃塞俄比亚(2]。此外,病变的严重程度在荷斯坦牛结核病明显高于瘤牛在类似领域的牛管理在埃塞俄比亚中部[2]。同样,这是发现干扰素-γ反应比瘤牛黑白花牛分枝杆菌抗原较高(3]。一个可能的原因降低干扰素-γ瘤牛反应可能不同的抗原识别资料黑白花牛和瘤牛之间。人类和小鼠的研究也表明,特定的分枝杆菌抗原的免疫应答的遗传背景不同所涉及的科目(4,5]。这个假设是在这项研究中解决。评估剧目黑白花牛和瘤牛的区别,外周血单核细胞(PBMC)和两个品种进行了血清的特异性和强度在应对不同的分枝杆菌抗原。

2。材料和方法

2.1。研究动物

评估的t细胞反应30-skin-test-positive牛(14黑白花牛和16瘤牛)在同一领域条件下使用管理。这些动物是从牛群招募的两个品种类型在相同饲养条件下保持传统的农民。他们被应用筛选单一皮内比较皮肤试验使用禽流感产后抑郁症(整除的0.1毫升的2500国际单位/毫升;英国兽医实验室机构)和牛产后抑郁症(整除的0.1毫升的2500国际单位/毫升;英国兽医实验室机构)和阳性应用的标准解释这个测试(反应牛产后抑郁症超过4毫米大比鸟类产后抑郁症)。血液收集6周后皮肤测试。抗体反应评估、16牛(8黑白花牛和8个瘤牛)相似的年龄和有强烈反应结核病StatPak侧流试验(美国纽约Chembio)被multiantigen打印测试免疫测定(MAPIA)如前所述6]。虽然抗体的牛用于评估不同于牛被评估的t细胞反应,两组相同的牛在牧场保持同质的传统农民在同一地区。

2.2。分枝杆菌抗原

禽流感和牛产后抑郁症被用于皮肤测试在体外免疫学检测。此外,23日分枝杆菌抗原。关于这些抗原呈现在表的详细信息1。

表1
列表使用的分枝杆菌抗原免疫反应之间的比较研究b . indicus(阿尔西品种)和b .金牛座(黑白花牛)在埃塞俄比亚。
2.3。有关酶联免疫斑点)酶联Immunospot(化验

有关酶联免疫斑点试验后进行的其他研究人员所使用的程序(早些时候7]。简而言之,外周血单核细胞(PBMCs)被孤立使用聚蔗糖- histopaque - 1077 (Sigma-Aldrich,普尔,英国)梯度离心法在800 g×45分钟。PBMCs洗2次在哈佛商学院(Gibco,佩斯利,英国),补充了肝素(狮子座、Ballerup、丹麦)在500×g离心5分钟。这些细胞被resuspended cell /毫升RPMI) 1640中补充10%胎牛血清(FCS)、青霉素、链霉素、2-mercaptoethanol,不必要的氨基酸(所有Sigma-Aldrich)(完全培养基)。聚乙二烯二氟化物(PVDF)微型板块涂层与100年在4°CμL / (10μg / mL) anti-bovine干扰素-γ捕捉单克隆抗体(mAb) 5 d10(生物科学,惠特利,英国)稀释1:600年无菌涂层缓冲区。盘子被洗两次与rpmi - 1640和阻塞RPMI-1640/10% FCS为2 h 37°C。在100年消除阻塞的解决方案μL ( 细胞/毫升)PBMC在完全培养基添加到每个100和刺激μL的抗原的浓度表示在表1。板块在37°C和5%孵化有限公司224 h和洗两次蒸馏水和三次磷酸盐缓冲溶液的渐变20 (PBS PBS-T, 0.05%渐变)。此后,100年μL兔子anti-bovine干扰素-γ稀释1:100年的血清白蛋白(BSA Sigma-Aldrich)添加到每个好,室温下孵化1 h。与PBS-T盘子然后洗了四次,其次是增加100μL单克隆anti-rabbit免疫球蛋白碱性磷酸酶共轭链霉亲和素(σ克隆R696稀释1:2000年PBS-T / BSA)在室温下和孵化1 h。Bromo-4-chloro-3-indolyl磷酸(BCIP)氮蓝四唑(电视台)基质是由涡流缓冲BCIP /电视台6衬底片(Sigma-Aldrich) 10毫升蒸馏水2 - 3分钟。这是紧随其后的100年μL底物溶液,在黑暗中孵化10分钟。此后,衬底轻晃过,塑料歧管摘除,盘子是用水洗在正面和背面。然后,盘子被风干,阅读有关酶联免疫斑点读者使用自动化的援助(德国援助,Strassberg)。

2.4。Multiantigen打印免疫测定(MAPIA)

如前所述(执行MAPIA616)血清牛。一组12个分枝杆菌抗原固定在硝化纤维膜(基恩Schleicher & Schuell NH)蛋白质浓度为0.05毫克/毫升使用半自动的airbrush-printing设备(Linomat四世Camag科学公司,威尔明顿DE)。膜是垂直于抗原垫切成4毫米宽条。条被封锁在PBS 1 h和1%脱脂脱脂牛奶0.05%渐变20然后孵化1 h和血清样本稀释1:50阻塞的解决方案。洗后,他们将孵化1 h和G(σ)稀释辣根peroxidase-conjugated蛋白质1:1000年与peroxidase-labeled抗体免疫球蛋白检测或牛IgM (Kikegaard和佩里实验室)稀释1:500年,其次是另一个清洗步骤。牛肯定会打印抗原的抗体与三甲可视化膜过氧化物酶底物(科克加德佩里实验室,马里兰州)。结果评估的视觉观察带的形成与所使用的抗原。

2.5。抗体检测小束

小束seroprevalence估计随机选择263(67皮肤试验阳性和196皮试阴性)牛。血清样本提交兽医实验室机构(VLA)考试的存在抗体Fasciolosis使用酶联免疫吸附试验后射电望远镜的标准操作程序。

3所示。结果

3.1。分枝杆菌的T细胞表位识别模式放牧瘤牛和母牛

ELISPOT分析评估的特异性和干扰素-强度γ生产T细胞反应中列出的分枝杆菌抗原定义表1。图1显示了动物个体的t细胞反应。同时hasp65是公认的最频繁、最强烈,许多附加抗原T细胞也承认在类似频率的两个品种。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
干扰素- 产生T细胞。酶immunospot测定有关酶联免疫斑点)(用于干扰素-的评估 在应对生产T细胞novelmycobacterial抗原在30牛。23分枝杆菌抗原被用来评估每个品种的响应。水平线=截止积极性(25证监会/百万PBMC)用于计算响应器频率图。

当反应根据品种(图分层2),尽管这两个品种识别大多数抗原频率可比,抗原,如CFP-10 ESAT-6, Rv0287, Rv0288, MPB87, Acr-2, Rv3616c, Rv3879c公认比荷斯坦在瘤牛更高频率。


图2
干扰素的比例, 生产t淋巴球黑白花牛和瘤牛。酶immunospot测定有关酶联免疫斑点)(用于干扰素-的评估 在应对新的分枝杆菌生产T细胞抗原。应答器频率为黑白花牛和瘤牛计算使用截止积极性> 25证监会/百万)。虽然两品种识别大多数抗原研究类似的频率,抗原,如CFP-10 ESAT-6, Rv0287, Rv0288, MPB87, Acr-2, Rv3616c, Rv3879c公认比荷斯坦在瘤牛更高频率。
3.2。分枝杆菌抗体的抗原识别模式瘤牛和黑白花牛吃草

为了调查可能的抗体剧目瘤牛和母牛牛之间的差异,MAPIA。荷斯坦和瘤牛表现出相似的抗体识别资料;随着MPB83 serodominant抗原在这两个品种(图3)。


图3
抗原抗体识别模式的母牛和瘤牛继续牧场组织。血清学反应,结核分枝杆菌复杂的抗原是由MAPIA两个品种。抗原是显示在右边距,而底部的数字表明动物(8动物从每个品种)。牛分枝杆菌培养滤液(MBCF)和16 kDa alpha-crystallin / MPB83融合蛋白(16/83)serodominant抗原在这两个品种。E6P10指ESAT6: CFP10融合蛋白;PPDb指牛分枝杆菌产后抑郁症。

4所示。讨论

在这项研究中,T细胞的反应和抗体在母牛分枝杆菌抗原比较和瘤牛保持在相同的牛管理。有关酶联免疫斑点试验中,母牛和瘤牛表现出类似频率的t细胞反应的分枝杆菌抗原包括在本研究;一个更强大的t细胞反应是观察到Hsp65品种。先前的研究[7)表明,疫苗接种的小腿Hsp65导致与Hsp65增强淋巴细胞增殖的刺激。相同的工人称PBMC未接种疫苗的小腿增殖和干扰素-发布γ后在体外与Hsp65刺激,同时实验牛分枝杆菌来华的牛显示反应这种抗原(8,9]。然而,Hsp65属是一个广泛表达抗原分枝杆菌后,这也可能导致大暴露于环境分枝杆菌。然而,高反应的一些特定抗原(ESAT-6、CFP-10 MPB70)瘤牛的观察比荷斯坦。然而,这个实验是初步的,它需要进一步确认使用足够数量的牛品种。

此外,可比识别两黑白花牛分枝杆菌抗原的抗体和瘤牛品种也观察到。牛分枝杆菌培养滤液(MBCF)和16 kDa alpha-crystallin / MPB83融合蛋白(16/83)是serodominant抗原在这两个品种。MBCF是一个复杂的蛋白质和脂肪的混合物,MPB70主要蛋白质的组成部分。后者是分泌抗原牛分枝杆菌序列同源性高MPB83 [10,11]。MPB70、ESAT-6 CFP-10较少被两个品种。一项研究[12)也报道了sero-dominance MBCF和16/83抗原的牛感染牛分枝杆菌实验。水域等。12]进一步增加报道的强度随着时间的推移,这些抗原抗体反应后接种牛分枝杆菌。同样,在獾的研究中,MBCF和MPB83是最常感染期间识别抗原牛分枝杆菌(13]。

然而,在这两个品种对分枝杆菌抗原的t细胞反应的强度一般较低,这可能是由于单独合并感染导致Th2偏见反应从而表达下调t细胞反应(14]。在我们的研究中,我们发现高的小束seroprevalence放牧牛,导致代Th2反应导致抑制Th1反应(14]。因此,小束血清阳性被发现在81% ( )在牛的人口研究的动物被选中。当这些结果分析根据牛品种,小束抗体相似的肥胖盛行程度( ; )在荷斯坦(82.4%, )和瘤牛(78.8%, )牛。即使在放牧牛干扰素-越高γ反应是在母牛瘤牛[相比3]。这可能归因于牛结核病的更高程度的病理学母牛相比瘤牛早些时候在我们观察的观察(2]。之间的正相关关系已经报道的强度干扰素-γ分枝杆菌抗原反应和严重程度的病理学实验条件下的牛结核病(15- - - - - -17]。但是,ELISA读出被用在先前的研究中,并有可能更多的反应透露有关酶联免疫斑点试验更敏感,我们在目前的研究工作。

这样的作品不可能导致最终的结论是否有差异在黑白花牛分枝杆菌识别资料和瘤牛,进一步研究细胞因子概要文件和t细胞分布在这两个品种推荐子集。

确认

这项工作是财务威康信托基金会的支持。Surane Gemeda和Nega Nigussie承认了他们的技术支持。