利用群体特征确定密歇根奶牛群中牛白血病病毒的年龄特异性流行率

摘要

Enzootic牛白血病是由逆转录病毒，牛白血病病毒（BLV）引起的牛的传染病，并且是牛中最常见的恶性肿瘤原因。为了促进乳制品牛群的这种疾病的监测，我们开发了一种将在常规生产测试中收集的牛奶ELISA的方法，并规定与每种哺乳期内的奶牛比例的规定的奶牛采样。在113个密歇根乳制的牛奶牛群中，牛奶ELISA的抗牛白血病病毒（BLV）抗体中的每一个来自十头奶牛的牛奶样品。对于每个群体，将BLV群落概况（BHP）计算为四个哺乳基团中的每一个的BLV阳性奶牛百分比的平均值。所有牛群的平均BHP分别为32.8％，分别为18.5,28.8,39.2和44.8％的18.5％，分别感染的≥4次哺乳动物的44.8％。在八个牛群中，我们确定了BHP与真正的牧群之间的相关性，通过测试整个哺乳群（）．必和必拓允许区分奶牛群中哺乳特异性BLV的流行情况，以帮助识别可能对BLV传播重要的风险因素和管理计划。

1.介绍

牛地方性白血病是由Δ-retrovirus，牛白血病病毒(BLV)引起的牛传染性疾病。该疾病以持续性淋巴细胞增多为特征，可最终发展为b细胞淋巴瘤。虽然blv诱导的淋巴瘤是牛最常见的肿瘤疾病，但大多数感染的牛并不表现出疾病的外在症状，这些动物被称为无症状或aleukemic [1］．约30-40%的BLV携带者会发展为持续性淋巴细胞增多症，而少于5%的人会发展为恶性淋巴肉瘤[1］．欧洲以外地区的调查报告显示，成年奶牛群内BLV患病率从23%至46% [2-5.］．

由血清学检测到的BLV感染，更典型的较年轻的牛而不是较年轻的牛[1那6.]在加利福尼亚州的一家大型奶牛场，据报道，患病率从第一次泌乳的43%增加到第二次泌乳的72%[7.].年龄分布对群体水平BLV流行的影响非常强烈，以至于不同泌乳期牛群之间的比例差异混淆了BLV流行的任何群体间比较。本研究调查了BLV群体概况（BHP）的使用使用市售牛奶ELISA试验，独立于每次哺乳期内奶牛的比例，确定与胎次相关的群体BLV感染率。该方法提供了一种新的、经济的、实用的方法来确定群体水平的BLV感染状况，按哺乳期分层，有助于评估传播风险因素和风险建议奶牛群中控制BLV的管理策略。

2.材料和方法

2.1. 群体选择

密歇根州的乳制品牛群，经常参与乳制品改善协会（DHIA）测试，并在前12个月的测试中平均≥120奶牛，分为119个小型牛群的相等队列（120-174奶牛），119名中等大小的牛群（175-295奶牛）和119名大牛群（298-6,738母牛）。在这些地层中的每一个内，畜群被分配了一个随机数，这些数量确定了他们联系并邀请参加我们的研究的顺序。每个队列都寻求四十牛群，但由于无法安排畜群的访问，或者在牧群中缺乏数据，导致总共113个参与牛群。每个群体测试的平均值（±SEM）奶牛数量为407.7±67.0，范围为113至6,492。105牛奶挤奶了荷斯坦奶牛，2只畜群棕色瑞士，4只畜群球衣，2只牛奶挤奶了繁殖的混合物。

2.2。选择奶牛的抽样

为了估计奶牛的数量每群抽样,我们计算,由二项的比例标准,如果这样within-herd患病率为10%,有5%的概率,没有积极的牛会在28牛、样品的概率是95%,我们会发现至少有一个积极的牛。我们选择理论BLV患病率为10%进行计算，因为这远低于几项研究报告的平均群体患病率[2-5.]，并因此试图考虑难以普遍存在牛群中的受感染的奶牛。为了提高精确度，并从牛选择的时间到实际牛奶样品收集，每群的目标样品尺寸增加到40牛。因此，在每个畜群内，我们根据当前DHIA测试确定了最近几分表最近的第一个，第二个，第三和≥Fourth哺乳期的10个母牛。在每个畜群的下一个测试日，（六月至2010年8月），DHIA技术人员从幸存的选定奶牛中收集了牛奶样品，以提交给实验室（Antel Biosystems，Inc.，Lansing，MI）的BLV抗体的ELISA测试。

2.3。BLV群剖面(BHP)的计算与验证

对每113头牛，计算每个泌乳组的blv阳性奶牛的百分率，并取4个泌乳组的百分率平均值(等重)计算BHP。为了验证的准确性的必和必拓抽样相对于总群BLV流行,我们分层113群必和必拓导致四分位数(发病率很低,低于平均发病率,患病率高于平均水平,和非常高的患病率)和随机选择的两个群进一步BLV测试加载的每个四分位数。采用BLV酶联免疫吸附试验()来计算BHP(以40头牛为基准)。然后通过简单的相关分析，将BHP与哺乳特异性患病率(来自全群测试)和总患病率的平均值进行比较。

2.4.BLV ELISA

牛奶样品立即用0.2%溶液保存 布龙波尔和7.8毫克/毫升 μg/mL纳他霉素(D&F Control Systems, Inc.， Dublin, CA)。样本被运送到DHIA实验室(通用实验室服务公司，东兰辛，MI)，随后按如下方法分析BLV抗体(Antel生物系统公司，兰辛，MI)。样品的运输和储存均在环境温度下进行。所有对BLV抗体的分析均在最初采集日期的5天内进行。我们先前确定了抗-的稳定性鸟型分支杆菌无性系种群。副结核在室温下14天，通过类似于牛奶BLV ELISA的商业检测方法(Byrem，未发表的数据)，牛奶中抗体的储存和检测是一致的。BLV抗体的检测使用了一种超纯的病毒裂解液，该裂解液使用的是一种用于散装牛奶分析的常规抗体捕获ELISA (IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine)。在分析之前，单个DHIA牛奶样品在样品稀释剂中以1:30稀释，以减少DHIA取样过程中发生的残留污染(<1%)的影响。简单地说，对于ELISA，稀释牛奶样品中的BLV抗体与先前被病毒裂解液包裹的微滴板孔结合。通过辣根过氧化物酶(HRP-)标记的单克隆抗体与牛免疫球蛋白(IgG)反应检测来自牛奶的结合抗体。通过添加酶底物检测结合的酶标抗体。反应时间标准化为阳性对照的显色(纳米)，加入0.5 N H后停止₂所以_4.．样本评分(样本OD阴性对照OD)≥0.1视为阳性。

2.5.统计分析

BLV患病率之间的相关性表达为Pearson相关系数（）．采用单因素方差分析评估哺乳组BLV患病率。使用SAS- pc (SAS Institute Inc, Cary, NC)对频率分布进行描述性统计，以及上述所有其他测试。

3.结果

3.1.BLV指数

从所有113个畜群中收集了4300个牛奶样本，平均来自于那那,分别来自第1，第2，第3和≥4次乳沟的母牛。所有测试动物的牛奶中的平均日子是天，中位数为66天，范围为8 ~ 357天。第1、2、3和≥4次泌乳取样时的平均泌乳天数为那那,天数分别。所有牛群的平均bhp是（中位数为30.0，范围为0至80.6；图1）．第1、2、3和≥4哺乳期动物感染的平均百分比为那那,，分别（图2），并有显着不同（通过单因素方差分析)，无论是否假设4个泌乳组的方差相等。对8个泌乳牛群进行了BLV检测，发现BHP与实际ELISA流行率高度相关(那)，并与平均泌乳率高度相关(那；数字3.）．

4.讨论

牛奶中BLV抗原的ELISA检测被认为是确定感染状态的可靠方法[8.］．我们选择牛奶酶联免疫吸附试验作为一种有吸引力的方法来协调大规模的畜群监测，因为DHIA检测期间的样品采集需要很少的额外劳动力投入，而且比血清检测更具成本效益。在初步研究阶段，我们比较了来自两个牛群(分别为76头和66头)的142头奶牛的牛奶和血清中BLV抗体的ELISA检测能力。在57头血清阳性的奶牛中，49头也是牛奶阳性(敏感性= 86%)。所有85份血清阴性样本在牛奶中检测均为阴性(特异性= 100%)。因此，尽管用乳酶联免疫吸附法检测BLV抗体不如血清酶联免疫吸附法灵敏，但试验之间的总体一致性为>94%。由于即时围产期的BLV抗体滴度可能存在变异[9.]，为了便于DHIA技术人员对登记奶牛进行鉴定，我们将产犊后第二次检测日期作为我们取样的目标奶牛群体。在我们的研究中，75%的奶牛在100天的牛奶中取样，90%在150天的牛奶中取样。每头奶牛取样的平均泌乳天数随着泌乳量的增加而增加。这可能是由于年龄较大的奶牛的磨损，导致在哺乳阶段更大的分散，以获得必和必拓牧群剖面所需的奶牛数量。取样时牛奶中天数的进一步变化是由于每两周或少于一个月检测一次的少量牛群，以及由于发情同步导致的成群结队的动物分娩而引起的。随着牧群规模的增加，取样时哺乳期的一致性一般更强。考虑到相对于牛奶天数的额外样本差异是我们排除较小牛群的主要原因。

BHP与八个不同规模和流行率的牛群中BLV阳性奶牛的实际流行率之间的相关性非常好。因此，我们的研究表明，BHP提供了一个实用且具有代表性的牛群概况，可以在牛群之间进行BLV流行率的比较。此外，通过对最近产下的10头奶牛进行取样，我们发现e BHP使乳制品生产商能够确定进入挤奶牛群的小母牛是否已经是BLV阳性，这表明了小母牛饲养行为特有的传播因素。

在奶牛水平上，BLV患病率与泌乳量呈正相关(图)2）．年龄很可能是BLV感染的原因和结果。因此，很难对不同年龄分布的牧群进行公平比较，也很难对年龄分布变化的牧群进行BLV监测。通过4个泌乳组内的采样方案，BHP的优点是不受牧群年龄分布的差异或变化的影响。

在我们的研究中，较大的牛的BLV患病率更高。这与较年轻的牛相比，这与淋巴瘤淋巴瘤发生率和阳性血清学的发病率更高的报告[6.那7.那10.］．最近的一项研究，在一个高感染率(85%)的奶牛群中使用血清PCR，确定新生犊牛、育龄母牛和27月龄母牛的BLV分别为11%、15%和24% [11.］．此外，61%的动物在36个月大时被感染。老年动物的BLV血清转化比例较高，可能是因为与年龄相关的接触与疾病传播相关的危险因素的时间较长，例如使用普通针头、触诊套筒，以及受感染和未受感染动物之间的密切接触[10.］．然而，如果通过ELISA测试检测BLV的存在的能力相对于实际病毒载荷有限，则在我们和其他研究中观察到的抗体患病率的一部分相关的抗体患病率可能是由于预先存在的血清可感染在较年轻的母牛，后来Seroconvert到积极状态，而不是最近暴露于BLV病毒。这种概念通过先前的实验性BLV感染研究驳斥，该研究确定了在接种后3至14周内发生的血清态转化为BLV阳性状态[12.-14.］．然而，实验感染可能不能解释病毒的遗传多样性或所遇到的感染颗粒的广泛范围，即在自然挑战中所经历的暴露剂量。有几份报告已通过PCR确定存在持续的blv感染，但血清阴性的动物[15.-17.］．此外，real-time qPCR在检测受感染牛的BLV前病毒载量方面可能比以前报道的巢式pcr方法更敏感[18.］．如果PCR通过PCR用于BLV的经济性方法，则可以在牛奶样中使用，这可以提供ELISA的替代品。

5。结论

总的来说，随着哺乳次数的增加，BLV感染的平均患病率增加，这可能是由于畜群管理、病原体暴露和通过牛奶ELISA常规筛查检测所有受感染动物的可能限制之间的复杂相互作用引起的。牛奶ELISA的使用，加上BHP的使用，使得用于确定奶牛群中BLV感染的年龄分层流行率的工具。我们建议将BHP作为标准，以帮助奶牛生产者管理其牛群中的BLV感染，因为BHP（1）表明哪些年龄组正在受到感染，从而表明哪些疾病控制干预可能最有效，（2）提供了一种监测疾病控制干预措施影响的方法，（3）允许与其他畜群进行比较，或在同一畜群内进行历史比较，而不考虑年龄分布的差异，（4）高度相关()，并流行粗群BLV。

致谢

作者非常感谢Elwood Kirkpatrick乳制品科学研究基金会对该项目的资助和Antel BioSystems，Inc.的技术支持。

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