单次乳内灌注重组牛白细胞介素-8在干脱时诱导奶牛白细胞弹性蛋白酶、炎性乳铁蛋白衍生肽和白细胞介素-8的延长分泌

摘要

单次乳内灌注重组牛白细胞介素-8 (IL-8) 50μG /quarter/head，但不是10μ在4头奶牛中，有3头在干脱期引起临床乳腺炎，导致直肠温度升高，乳腺发红肿胀，广泛的多形核白细胞(PMNL)浸润，并在注射后1 - 28天形成乳凝块。在乳腺的乳腺分泌物中，高水平的IL-8从8小时持续到28天，在1-3天达到峰值。乳腺分泌物中白细胞源性弹性蛋白酶和炎性22和23 kDa乳铁蛋白源性多肽(LDP)水平也增加。除了实验性诱发乳腺炎外，奶牛乳腺分泌物还伴有自发分泌金黄色葡萄球菌与未受感染的乳腺分泌物相比，干期乳腺炎表现为乳凝块形成，其PMNL计数、弹性蛋白酶、LDP和IL-8水平显著增加。这些结果表明，乳糜泻注入IL-8引起炎症反应后，可诱导弹性蛋白酶、炎性LDP和IL-8的长时间分泌，长期的IL-8诱导的炎症反应参与了乳腺癌的发病机制金黄色葡萄球菌干旱时期乳腺炎。

1.介绍

白介素(IL)-8是一种炎性细胞因子，属于CXC趋化因子家族，由多种细胞产生，包括淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞和上皮细胞，响应炎症刺激，如病毒和细菌感染。IL-8在多形核白细胞(PMNL)的招募和激活中起关键作用，如中性粒细胞[1，2］．

据报道，IL-8在奶牛排出胎盘时，在体液和分泌物中被释放[3.]以及患有肺炎性巴氏杆菌病的牛只[4或乳腺炎[5- - - - - -11］．因此，参与胎盘排出的中性粒细胞[3.]及清除乳腺内的细菌[12，13，被IL-8招募并激活[14- - - - - -16］．此外，IL-8基因表达水平和IL-8受体的多态性α(CXCR1)基因与乳腺炎等疾病的发病率和严重程度有关[17，18］．

活化的中性粒细胞释放乳铁蛋白(Lf) [19]和蛋白酶，如弹性蛋白酶[20.，21］．后者产生炎性lf衍生肽(LDP)，包括22和23 kDa肽[22］．含有GQRDLLFKDSAL序列的炎性LDP，如22和23 kDa多肽，诱导牛乳腺上皮细胞中IL-8基因的表达[22，是乳突乳腺中产生IL-8的主要来源[23，24］．因此，这表明在牛中存在一个IL-8产生的阳性扩增环，包括IL-8从活化的中性粒细胞中连续释放Lf和蛋白酶。

我们最近证实，在奶牛干燥期将重组牛(rb) IL-8注入奶头池可诱导类似乳腺炎症状的炎症反应，包括PMNL渗入乳腺分泌物、酪蛋白浓度下降和直肠温度短暂升高[25］．然而，乳内灌注rbIL-8是否能诱导乳腺分泌物中弹性蛋白酶、LDP和新产生的IL-8的释放尚不清楚。为了澄清这些观点并获得关于rbIL-8乳内灌注的局部反应的进一步信息，我们以时间依赖性的方式监测了单次乳内灌注rbIL-8后这些物质的释放。此外，我们还观察了它们在临床上乳内引起的干期乳腺炎中的释放情况金黄色葡萄球菌感染。

2.材料和方法

2．1.重组牛引发

重组牛(rb) IL-8产生Brevibacillus choshinensis被分泌到培养基中．培养基中的rbIL-8通过两层过滤膜纯化(截取分子量分别为100,000和3,000)，然后进行SP-Toyo-pearl色谱(Tosoh, Tokyo, Japan) [26］．rbIL-8的浓度用Bradford法测定[27)使用牛γ-球蛋白作为标准。凝胶经SDS-PAGE密度计扫描，rbIL-8纯度超过90% [26，28］．rbIL-8的生物活性通过与牛中性粒细胞的趋化试验得到证实，并被单克隆抗牛IL-8抗体完全阻断[26］．

2．2．动物福利和细菌试验

本研究中使用的所有动物的护理和处理均由国家动物卫生研究所的实验动物机构护理和使用委员会批准。每天检测奶牛直肠温度2次，采用羊血琼脂和甘露醇盐琼脂平板进行微生物培养，测定乳腺细菌含量[29］．随后使用MicroSeq鉴定系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)对从培养中分离出来的细菌进行16S rDNA测序鉴定[30.］．用倾注平板培养法(营养琼脂)检测细菌细胞数。

2．3.IL-8-Induced乳腺炎

选用12头临床健康的5 ~ 6岁荷斯坦奶牛，在泌乳期220 ~ 233天进行il -8诱导乳腺炎试验。随机命名为A-L，分为3组(每组4头)。奶牛A-D注射rbIL-8 (50μ如前所述，在最后一次挤奶后立即将5ml无内毒素无菌生理盐水滴入右侧前乳头池[25］．E-H奶牛注射rbIL-8 (10μG)和生理盐水分别注入左、右前乳头池。I-L牛未接受任何处理，作为正常的干燥对照动物。在注射后-4、-1、0(攻毒前)和8小时、1、3、7、14、21和28天(PI)从注射部位收集乳腺分泌物(各10 mL)。所有的样本都进行了细菌学研究，但没有阳性培养，证实没有意外感染。

２.４.自发的金黄色葡萄球菌干燥期乳腺炎

从7头由乳内引起的自然发生临床乳腺炎的荷斯坦奶牛中获得四分之一的乳腺分泌物(每10 mL)金黄色葡萄球菌感染。所有的牛都保持健康，即在任何季节都没有任何乳腺炎症状或致病菌，至少在脱乳前一个月和脱乳后一个星期。在取样前2天(干燥后8-12天)，每头奶牛的一个乳腺部位出现肿胀和发红的乳腺炎。除取样前1 - 2天体温升高1 - 1.5°C的短暂发热外，牛无明显的全身临床症状，取样前未进行任何处理。受感染病人()及未受感染()，于干燥期开始后10 ~ 13 d采集，进行细菌学和生化分析。

2．5．乳腺分泌物标本的多形核白细胞计数及观察与治疗

在评估乳腺分泌物的大体外观后，通过两层外科纱布过滤以清除血块。滤液中体细胞的数量通过直接显微镜检查进行计数[31]，然后估计PMNL的数量[32］．制备脱脂牛奶及乳清样本[33]，置于−80℃下保存，直至使用。

2.6。牛IL-8的定量分析

如前所述，采用双份夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定乳腺分泌物中的IL-8浓度[26］．

2.7。白细胞弹性蛋白酶试验

根据Komine等人所描述的方法，用酶谱法检测乳清样品中的弹性酶活性[22，以人白细胞弹性蛋白酶(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)为标准。

2.8。Lf和LDP的定量

根据之前报道的方法，以牛Lf (Sigma-Aldrich)为标准，通过定量western blot分析确定Lf和LDP的浓度[22，34］．简单地说，用SDS-PAGE(13.5%聚丙烯酰胺凝胶)对脱脂牛奶样品进行分离，然后在聚偏二氟乙烯膜上印迹。用含0.15% (w/v) NaCl和2% (w/v)卵清蛋白的Tris-HCl (pH 7.5)缓冲液阻断膜的非特异性蛋白结合位点后，用兔抗牛Lf IgG (Life Laboratory, Yamagata, Japan)和马萝卜过氧化物酶(HRP)标记的驴抗兔IgG处理膜。使用试剂盒(ECL + western blotting检测系统)对结合的HRP进行可视化(GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)。

2.9。统计分析

在统计分析之前，PMNL计数和细菌菌落形成单位(cfu)数据进行对数转换以保持正态分布。当在乳腺分泌物中观察到乳凝块形成时，无法对PMNL计数数据进行统计分析，因为乳凝块涉及大量PMNL，这阻碍了细胞的准确计数。采用双向重复测量方差分析和Tukey多重比较检验，分析有无乳糜乳症状奶牛的样品差异及不同处理的效果。为了确定没有受到自然发生的干期乳腺炎影响和影响的乳腺之间的差异，使用学生的数据进行分析以及。所有数据均以平均值±SEM表示，与<0.05的值被认为是显著的。

3.结果

３．１．对il -8诱导的乳腺炎的反应

4头牛中的3头(a - c)给予单一高剂量(50μg/ 1 / 4 /头)干性时乳内灌注rbIL-8显示直肠温度升高1 - 1.5°C，在32或48小时达到峰值，乳腺发红和肿胀分别在1 - 7天和1 - 14天(数据未显示)。注射了高剂量rbIL-8的D牛没有出现这些症状。此外，给牛低剂量(10μg/quarter/head) rbIL-8 (E-H)单次乳内输注无临床体征，乳腺外部无变化(数据未显示)。

有临床症状的奶牛(A-C)的乳腺分泌物中含有大量PI第1天的PMNL和PI第3天的凝块，细胞浸润和凝块形成持续28天(图)1(一)）．从未受影响的腺体(A-D)的乳腺分泌物显示增加高达2.2 × 10⁶在未形成血块的情况下，7天PI时PMNL细胞的数量为细胞/mL(图)1(一)）．未受影响的奶牛(E-H)和未受任何处理的奶牛(I-L)的乳腺分泌物中PMNL细胞数量也有所增加，说明这种PMNL细胞数量的逐渐增加可能是由于正常干燥期乳腺的复归(图)1 (b)和1 (c)）．无临床症状奶牛(D-H)的受影响腺体的乳腺分泌物最初趋向于PMNL数量增加，但PMNL数量未超过10⁷细胞/毫升之后(数据1(一)和1 (b)）．

在8小时内给予高剂量和低剂量rbIL-8，受影响腺体的乳腺分泌物显示IL-8浓度pg / mL和分别pg / mL。此外，无临床症状的奶牛(D-H)的受影响腺体的乳腺分泌物在1天或之后不含IL-8(图)2(一个)和2 (b)）．由于8小时PI检测到的IL-8浓度与rbIL-8输注剂量大致成正比，IL-8随后消失，因此可能在分泌物中短暂出现的IL-8来自输注。相比之下，有临床症状的奶牛(A-C)的乳腺分泌物在PI第1天时含有高水平的IL-8，并持续PI第28天(图)2(一个)）．这些结果提示IL-8在乳腺炎症过程中持续释放。

临床症状(A-C)奶牛乳腺分泌物从1天开始呈高水平弹性蛋白酶活性，持续28天(图)3(一个)）．乳腺腺体分泌物的影响(a - c)包含22和23 kDa炎症肽(自民党),这是由低频通过弹性蛋白酶的消化,从3到28天π,而一个影响奶牛的乳腺腺体的分泌物(D)和牛的影响腺模拟没有(图3 (b)）．在后期的乳腺分泌物中，从PI的3天到28天，Lf的浓度显著增加，在正常的干燥期观察到[35，36］．然而，在前乳腺分泌物中，Lf的浓度略有增加(图3 (c))，且在7 ~ 28天时显著低于后者，说明在此期间Lf被蛋白酶消化产生LDP。

３.２．自发反应金黄色葡萄球菌乳腺炎

7头奶牛在一个季度内患有临床干期乳腺炎由乳内引起金黄色葡萄球菌感染被招募。未感染部位的乳腺分泌物中PMNL含量较低，22和23 kDa LDP浓度较低，有少量Lf;但未检测到弹性蛋白酶和IL-81）．感染部位的乳腺分泌物金黄色葡萄球菌含有血块和较多的PMNL。此外，乳腺分泌物中含有高水平的弹性蛋白酶和IL-8，而LDP和Lf的浓度分别显著升高和降低。

4.讨论

我们已经证明单次高剂量(50μ乳内灌注rbIL-8可诱导奶牛在干燥期白细胞弹性蛋白酶、炎性LDP和IL-8的延长分泌。这些现象显然与rbIL-8诱导乳房反应有关，如PMNL的广泛浸润和乳腺分泌物中的凝块形成，因为给予高剂量rbIL-8的四头奶牛中有一头没有发生临床乳房炎或分泌弹性蛋白酶、LDP或IL-8，这也适用于4头注射低剂量(10μg /季度/ rbIL-8头)。同样的，我们之前的研究表明rbIL-8在25μG，但不是5μG，诱发性乳腺炎症状[25，表明阈值存在于10到25之间μg rbIL-8，引起显著的局部和/或全身炎症反应。此外，这些结果表明，rbIL-8在乳腺内灌注反应中存在个体差异，因为在脂多糖反应中产生炎症细胞因子的个体差异甚至可以在奶牛皮肤成纤维细胞中观察到[37］．

在正常的早期干燥期，中性粒细胞通过基底膜和细胞外基质的降解参与组织重塑，其中一些细胞渗入乳腺分泌物[38，39］．在本研究中，rbIL-8输注诱导的乳腺炎导致大量PMNL浸润到乳腺分泌物中。PMNL的招募，特别是中性粒细胞的招募，预计将引发进一步的事件。中性粒细胞同时释放Lf [19]和蛋白酶，如弹性蛋白酶[20.，21]，导致产生了LDP [22］．炎性LDP，特别是含有GQRDLLFKDSAL序列的多肽，如22和23 kDa多肽，作用于乳腺上皮细胞，增强IL-8基因表达[22)和生产。在本研究中，从第1天到28天，在受累腺体的乳腺分泌物中发现了广泛的PMNL浸润和高水平的弹性酶活性。22 kDa和23 kDa LDP水平的升高和Lf水平的降低持续了28 d，表明Lf裂解持续产生LDP。此外，检测到高水平的IL-8，并持续28天。由于乳腺分泌物中IL-8的高水平不可能被注入rbIL-8的喷射所解释，我们假设由弹性蛋白酶产生的22和23 kDa LDP诱导IL-8的合成和分泌。此外，输注的长期影响，如IL-8分泌的延长，可以通过假设新合成的IL-8反复触发这些连续事件的新周期来解释。尽管IL-8在牛乳腺分泌的主要来源被认为是乳腺上皮细胞[23，24，浸润腺体的白细胞可能是另一个来源。为了更好地了解IL-8在乳腺炎发病机制中的作用，需要检测乳腺炎组织中表达IL-8的细胞。

在正常的牛乳腺复合过程中，特别是在干脱后3 ~ 14天，Lf的mRNA表达和蛋白产量增加，其进入乳腺分泌物的量也增加[40］．在il -8诱导的乳腺炎中，由于弹性蛋白酶破坏了乳腺退化过程中产生的Lf，乳腺分泌物中的Lf浓度可能在干脱后28天内无法恢复。据报道，完整的牛Lf增强了内在化链球菌uberis和凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)进入牛乳腺上皮细胞[41，42]，而由弹性酶、乳铁蛋白等蛋白酶产生的Lf消化产物具有抗菌作用[乳铁蛋白由22 kDa和23 kDa LDP中Lf的不同部分衍生而来[22］．因此，在牛乳腺中，IL-8可能是宿主防御系统的关键因子，有助于中性粒细胞的募集和弹性蛋白酶的释放，完整的Lf的消化和LDP的产生。

乳牛在泌乳期间可通过乳内接种乳腺炎试验诱导大肠杆菌，支原体宝，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，美国epidermidis，美国simulans，粘质沙雷氏菌,或链球菌uberis［5- - - - - -11］．在所有病例中，牛奶中都发现了IL-8，尽管IL-8的数量和出现时间取决于所使用的病原体。有趣的是，在大多数情况下，IL-8会在一周内消失，金黄色葡萄球菌接种可导致相对持久的IL-8水平升高[6，10］．金黄色葡萄球菌乳腺炎是非哺乳期和哺乳期牛乳腺炎的主要类型之一[43］．这种形式的乳腺炎通常很难治愈，尤其是慢性的[43- - - - - -45］．由于rbil -8诱导的乳腺炎表现出长期的症状，因此从急性乳腺炎向慢性乳腺炎的过渡可能导致IL-8水平的持续增加金黄色葡萄球菌乳腺炎。此外，在本研究中，乳腺分泌物来自受感染腺体的干燥期金黄色葡萄球菌乳腺炎奶牛PMNL、弹性酶、LDP和IL-8水平升高;Lf降低;血栓形成的迹象金黄色葡萄球菌乳腺炎(46］．因此，rbIL-8-和金黄色葡萄球菌提示上述IL-8触发连续事件的重复循环导致长期炎症的观点也可能适用于临床干燥期的发展和进展金黄色葡萄球菌乳腺炎。

除了金黄色葡萄球菌乳腺炎，在哺乳期中枢神经系统感染引起的乳腺炎中观察到IL-8向乳汁中释放的延长[11］．然而，中枢神经系统感染引起的乳腺炎很少引起严重的临床症状或乳块，相反金黄色葡萄球菌乳腺炎(47］．临床特征的差异金黄色葡萄球菌CNS乳腺炎表明，乳腺IL-8分泌的延长并不总是导致相同的发病机制。尽管IL-8无疑参与了各种乳腺炎的发病机制[5- - - - - -11，48]，影响乳腺炎发病机制的其他病原相关因素和条件必须在今后的研究中阐明。

综上所述，本研究表明，单次乳内灌注rbIL-8可使奶牛在干燥期PMNL长期浸润和凝块形成，白细胞弹性蛋白酶、炎性LDP和IL-8分泌时间延长。临床干期乳腺炎的乳腺分泌物也有类似的变化金黄色葡萄球菌感染。这些发现提示了上述假设，但为了更好地了解IL-8在发病机制中的作用金黄色葡萄球菌干期牛乳腺炎，进一步研究各阶段金黄色葡萄球菌并与中枢神经系统感染性乳腺炎进行比较。

致谢

作者感谢千山幸男提供的技术援助。他们感谢Petr博士Sláma(捷克布尔诺孟德尔大学)对这篇论文的评论。这项工作得到了科学研究资助(C) (no。22580347)。

参考文献

1. B. Moser, M. Wolf, A. Walz，和P. Loetscher，《趋化因子:白细胞迁移的多水平控制》，免疫学的趋势，第25卷，第2期2，页75-84,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. M. Baggiolini, B. Dewald，和B. Moser，“白介素-8和相关趋化细胞因子- cxc和CC趋化因子”，免疫学的发展，第55卷，第97-179页，1994。视图:谷歌学者
3. K. Kimura, J. P. Goff, M. E. Kehrli和T. a . Reinhardt，“中性粒细胞功能下降是奶牛胎盘残留的一个原因，”乳品科学杂志第85卷第1期3，页544 - 550,2002。视图:谷歌学者
4. J. L. Caswell, D. M. Middleton，和J. R. Gordon，“白细胞介素-8作为一种中性粒细胞趋化剂在患有肺炎性巴氏杆菌病的牛肺中的重要性”加拿大兽医研究杂志，第65卷，第5期4，页229 - 232,2001。视图:谷歌学者
5. C. Riollet, P. Rainard，和B. Poutrel，“牛乳腺炎性分泌物中的细胞和细胞因子”，实验医学与生物学进展， 2000年，第480卷，第247-258页。视图:谷歌学者
6. D. D. Bannerman, M. J. Paape, J. W. Lee, X. Zhao, J. C. Hope, P. Rainard， "大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起乳腺内感染后的不同先天免疫反应临床和诊断实验室免疫学，第11卷，第5期。3，页463 - 472,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. D. D. Bannerman, M. J. Paape, J. P. Goff, K. Kimura, J. D. Lippolis，和J. C. Hope，“先天性免疫反应对乳内感染粘质沙雷氏菌和链球菌uberis”,兽医研究第35期6，页681-700,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. D. D. Bannerman, A. Chockalingam, M. J. Paape, and J. C. Hope，“实验诱导的牛先天免疫反应铜绿假单胞菌乳腺炎,”兽医免疫学和免疫病理学，第107卷，第2期3-4，页201 - 215,2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. A. C. W. Kauf, R. F. Rosenbusch, M. J. Paape，和D. D. Bannerman，“乳内固有免疫反应支原体宝感染。”乳品科学杂志，第90卷，第5期。7, pp. 3336-3348, 2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. P. Rainard, A. Fromageau, P. Cunha和F. B. Gilbert， "金黄色葡萄球菌脂磷壁酸会引发泌乳牛乳腺的炎症。兽医研究第39卷第3期2008年第52条第5款。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. H. Simojoki, T. Salomäki, S. Taponen, A. Iivanainen，和S. Pyörälä，“先天免疫反应在实验诱导的牛乳内感染葡萄球菌simulans和美国epidermidis”,兽医研究，第42卷，第2期1，页49-58,2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. M. Paape, J. Mehrzad, X. Zhao, J. Detilleux, and C. Burvenich，“通过多形核中性粒细胞白细胞防御牛乳腺”，乳腺生物学与肿瘤杂志，第7卷，第5期2，页109 - 121,2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. C. Burvenich, V. Van Merris, J. Mehrzad, A. Diez-Fraile, and L. Duchateau，“严重的大肠杆菌乳腺炎主要由奶牛因素决定。兽医研究第34卷第3期5，页521-564,2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. G. B. Mitchell, B. N. Albright和J. L. Caswell，“白细胞介素-8和粒细胞集落刺激因子对牛中性粒细胞启动和激活的影响”，感染和免疫，第71卷，第71期4，页1643-1649,2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. M. R. Barber和T. J. Yang，“非乳糜乳和乳糜乳分泌物中的趋化活动:乳糜乳而非乳糜乳分泌物中存在白介素-8，”临床和诊断实验室免疫学，第5卷，第5期。1, 1998。视图:谷歌学者
16. J. L. Caswell, D. M. Middleton，和J. R. Gordon，“重组牛白细胞介素-8作为一种特异性中性粒细胞激活剂和趋化剂的生产和功能特性”，兽医免疫学和免疫病理学，第67卷，第5期4, pp. 327-340, 1999。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. K. N. Galvão, G. M. Pighetti, S. H. Cheong, D. V. Nydam, and R. O. Gilbert，“白细胞介素-8受体-之间的关联α(CXCR1)多态性与荷斯坦奶牛发病率、产量、繁殖和存活率的关系乳品科学杂志，第94卷，第94期4, pp. 2083-2091, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. M. G. H. Stevens, L. J. Peelman, B. De Spiegeleer等，“早期和中期泌乳奶牛toll样受体-4级联和中性粒细胞功能的差异基因表达”，乳品科学杂志，第94卷，第94期3, pp. 1277-1288, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. R. J. Harmon和F. H. S. Newbould，“中性粒细胞白细胞作为牛奶中乳铁蛋白的来源”美国兽医研究杂志号，第41卷。10，页1603-1606,1980。视图:谷歌学者
20. L. Brandolini, R. Bertini, C. Bizzarri等，“IL-1β诱导il -8激活的人中性粒细胞释放弹性酶、磷脂酶D活性和钙通量，”白细胞生物学杂志，第59卷，第59期3，第427-434页，1996。视图:谷歌学者
21. B. Korkmaz, T. Moreau，和F. Gauthier，“中性粒细胞弹性蛋白酶，蛋白酶3和组织蛋白酶G:物理化学性质，活性和生理病理功能，”Biochimie，第90卷，第5期。2，页227-242,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. 牛乳铁蛋白弹性蛋白酶对葡萄球菌性乳腺炎的炎症作用兽医科学杂志第68卷第2期7，第715-723页，2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. 牛乳上皮细胞白细胞介素8 (Interleukin 8)对脂多糖刺激的反应美国兽医研究杂志，第59卷，第59期12，页1563-1567,1998。视图:谷歌学者
24. M. R. Barber, A. G. Pantschenko, L. S. Hinckley, and T. J. Yang，“诱导性和结构性”在体外乳腺上皮细胞和肌上皮细胞的中性粒细胞趋化因子表达临床和诊断实验室免疫学，第6卷，第2期6，页791-798,1999。视图:谷歌学者
25. A. Watanabe, Y. Yagi, H. Shiono, Y. Yokomizo, and S. Inumaru，“乳内注射白介素-8对奶牛乳腺衰退期间乳蛋白组成和急性期蛋白诱导的影响”，加拿大兽医研究杂志第72卷第2期3，页291-296,2008。视图:谷歌学者
26. J. Hirota, S. Shimizu, a . Watanabe等，“用新开发的单克隆抗体建立牛CXCL8三明治定量ELISA”，欧洲细胞因子网络第22卷第2期1, pp. 73-80, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
27. M. M. Bradford，“利用蛋白质染料结合原理的一种快速、灵敏的微量蛋白质定量方法”，分析生物化学第72卷第2期1-2，页248-254,1976。视图:谷歌学者
28. 菲什拜因，“1-50的定量密度测定法μ"考马斯亮蓝丙烯酰胺凝胶板中的G蛋白"分析生物化学第46卷，第46期2，第388-401页，1972。视图:谷歌学者
29. K. L. Smith, J. H. Harrison, D. D. Hancock, D. A. todd hunter和H. R. Conrad，“维生素E和硒补充对临床乳腺炎发病率和临床症状持续时间的影响”，乳品科学杂志，第67卷，第5期6、1984年。视图:谷歌学者
30. V. D. Bhatt, M. S. Patel, C. G. Joshi, A. Kunjadia，“牛乳腺炎相关微生物的鉴定和抗生素图”，动物生物技术第22卷第2期3，页163-169,2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
31. 国家乳腺炎委员会:筛查试验小组委员会，"牛奶中直接显微体细胞计数"，牛奶与食品技术杂志，第31卷，第350 - 354,1968年。视图:谷歌学者
32. R. H. Miller, M. J. Paape, R. R. Peters, M. D. Young，“乳腺分泌物中总和差异体细胞计数和n -乙酰- β - d -葡萄糖苷酶活性在干燥期，”乳品科学杂志，第73卷，第2期7，第1751-1755页，1990。视图:谷歌学者
33. L. Bouchard, S. Blais, C. Desrosiers, X. Zhao, P. Lacasse，“内毒素诱导的乳腺炎中一氧化氮的产生”，乳品科学杂志，第82卷，第2期12，页2574-2581,1999。视图:谷歌学者
34. A. Watanabe, I. Uchida, K. Nakata, Y. Fujimoto, S. Oikawa， "牛的分子克隆(牛)编码94-kDa葡萄糖调节蛋白的cDNA及其在乳腺中mRNA和蛋白质含量的发育变化。B号，第130卷。4，页547-557,2001。视图:出版商的网站|谷歌学者
35. B. J. Nonnecke和K. L. Smith，“乳腺消退和分娩时牛乳腺分泌物的生化和抗菌特性”，乳品科学杂志，第67卷，第5期12，第2863-2872页，1984。视图:谷歌学者
36. W. L. Hurley，《退化期间的乳腺功能》乳品科学杂志第72卷第2期6，页1637-1646,1989。视图:谷歌学者
37. S. Kandasamy, B. B. Green, A. L. Benjamin，和D. E. Kerr，“在炎症的解决过程中，皮肤成纤维细胞对脂多糖反应的奶牛差异大肠杆菌乳腺炎,”乳品科学杂志，第94卷，第94期12, pp. 5963-5975, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
38. 翁敏慧，余廷春，陈淑娥等，“乳业动物急性和渐进式退化过程中乳腺明胶酶B的区域增加”，乳制品研究杂志，第75卷，第5期2，第202-210页，2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
39. 苏耿赋。Yu C.-J。常,学术界。Ho等人，“乳停滞奶牛乳腺内牛中性粒细胞的防御和重塑功能的修改接受了商业干牛治疗，”兽医免疫学和免疫病理学第144卷第1期3-4，页210-219,2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
40. F. L. Schanbacher, R. E. Goodman，和R. S. Talhouk，“牛乳腺乳铁蛋白:与其他乳蛋白相反的信使核糖核酸(mRNA)序列和调控的含义”，乳品科学杂志，第76卷，第76期12，第3812-3831页，1993。视图:谷歌学者
41. D. Patel, R. a . Almeida, J. R. Dunlap, and S. P. Oliver，“牛乳铁蛋白作为内化的分子桥梁链球菌uberis进入牛乳腺上皮细胞，”兽医微生物学第137卷第1期3-4页，297-301页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
42. P. Hyvönen, S. Käyhkö， S. Taponen, A. Von Wright，和S. Pyörälä，“体外条件下牛乳铁蛋白对凝固酶阴性葡萄球菌内化到牛乳腺上皮细胞的影响”，乳制品研究杂志，第76卷，第76期2, pp. 144-151, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
43. H. W. Barkema, Y. H. Schukken，和R. N. Zadoks，“邀请评论:牛、病原体和治疗方案在牛治疗成功中的作用金黄色葡萄球菌乳腺炎,”乳品科学杂志，第89卷，第89期。第6页，1877-1895,2006。视图:谷歌学者
44. P. Gruet, P. Maincent, X. Berthelot, V. Kaltsatos，《牛乳房炎与乳内药物输送:综述与展望》，先进的药物递送评论，第50卷，第5期。3，页245 - 259,2001。视图:出版商的网站|谷歌学者
45. P. M. Sears和K. K. McCarthy，《葡萄球菌性乳腺炎的管理和治疗》，北美兽医诊所第19卷第2期1，页171 - 185,2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
46. L. Sutra和B. Poutrel，“毒力因素涉及发病机理的牛乳内感染由于金黄色葡萄球菌”,医学微生物学杂志，第40卷，第5期。2，第79-89页，1994。视图:谷歌学者
47. S. Taponen和S. Pyörälä，凝固酶阴性葡萄球菌作为牛乳房炎的原因-没有太大的不同金黄色葡萄球菌?”兽医微生物学第134期1-2，第29-36页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
48. A. M. Alluwaimi，“牛乳腺细胞因子:诊断和治疗的前景”，兽医科学研究第77期3，页211-222,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者

版权

版权所有©2012渡边淳史等。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。