用PPA-ELISA法检测感染牛群中约翰氏病的IgG同型

摘要

约翰氏病或副结核是一种影响反刍动物的慢性肉芽肿性肠炎疾病。亚临床感染动物的检测困难，阻碍了该病的控制。本工作的目的是评价在PPA-ELISA检测IgG同型的性能，以提高自然感染牛的识别地图在不同的阶段。共108只来自无结核病畜群的动物被分组如下:)、亚临床感染()、临床感染()，以及健康对照组(）.构建同型/ ppa - elisa的受试者工作特征(ROC)曲线，比较曲线下面积以评价各试验的性能。我们的研究表明，传统的PPA-ELISA(检测IgG)方法对临床感染动物的鉴别效果最好，敏感性高(92.9%)，特异性高(100%)。同时，与常规IgG/PPA-ELISA相比，IgG2/PPA-ELISA提高了亚临床感染牛的检出率(53.8 vs 23.1%)。此外，考虑所有因素，其敏感性最高(65.0%)地图来华的牛)。综上所述，IgG与IgG2/ ppa - elisa联用可提高鉴定效果地图-不同疾病阶段的受感染牛。应进一步评估IgG2检测在约翰病血清学诊断中的有用性。

1.导言

约翰氏病(JD)或副结核是一种影响反刍动物的慢性肉芽肿性肠炎疾病[1，2].这是由于鸟型分支杆菌无性系种群。副结核（地图)，并导致全球奶业遭受重大经济损失[3.］.地图克罗恩病是人类的一种慢性肉芽肿性回肠炎。然而，它在这种病理中的作用仍有争议[4- - - - - -6］.

犊牛在出生后的头几个月里是最易受感染的种类，通过食用这种食物而感染地图-受污染的初乳、牛奶或粪便[2，7］.当水坝被感染时，胎儿传播也是可能的地图［7，8］.

在最初感染期间，免疫反应主要由细胞介导的免疫谱(Th1)主导。亚临床感染的动物通常很少地图粪便脱落，并且有无法检测到的地图-特异性血清抗体和增加特异性γ干扰素(IFN-)反应9］.经过长时间的潜伏期(数年)，部分受感染动物发展到临床阶段，其特征是慢性腹泻、蛋白质丢失性肠病、恶病质，并最终死亡。此外，在JD的这一阶段，粪便中细菌脱落量和血清抗体滴度的增加已被描述，表明免疫反应对体液谱(Th2)的转移[1，10，11].针对分枝杆菌感染的体液免疫反应被认为是非保护性的[1，2］.然而，已经证明抗体在地图感染在体外．地图免疫血清或纯化的特异性抗体增强细菌与巨噬细胞的相互作用，提高被感染细胞中核因子NF-kB的激活，并影响巨噬细胞地图细胞内生存能力(12- - - - - -14］.

由于几个原因，JD的控制一直很困难。在传统固体培养基上进行粪便培养成本高、费力且缓慢（需要6个月的时间才能结束检测），且灵敏度低[15- - - - - -17］.通过皮肤试验或IFN-检测细胞免疫反应生产有助于感染的早期诊断，但这些检测具有高变异性和低特异性[18，19］.疫苗已经被证明可以减少地图脱落，防止发展到临床阶段，减少对产奶量的影响。然而，它们不能防止细菌的感染和脱落，并干扰结核病和JD诊断[20.］.

虽然常规ELISA(检测IgG)在感染亚临床阶段的敏感性较低，但由于其低成本、高通量、标准化方案和相关性，是最常用的JD对照检测方法地图粪便排出量[21- - - - - -23］.各种抗原的地图包括原浆抗原(PPA)、脂多糖甘annan (LAM)、p34蛋白羧基端(p34 -cx)、纯化蛋白衍生物(PPDp)、热休克蛋白(Hsp)等，其中PPA是最常用的诊断蛋白[21- - - - - -23］.的生产地图-特定的同型在疾病过程中转换[10，24，25]， Th1反应与IgM和IgG2有关，Th2反应与IgG1和IgA有关[26].同样，在来自中国的血清中检测到针对几种抗原的高水平特异性IgG1地图-在疾病临床阶段受感染的牛只[13，14，24，25］.在之前的研究中，我们发现地图-特异性IgG2在JD的亚临床和临床阶段[25］.

本工作的目的是评价在PPA-ELISA检测IgG同型的性能，以提高自然感染牛的识别地图在疾病的不同阶段。

2.材料和方法

２.１.动物

使用来自阿根廷潘帕斯地区无结核病认证奶牛群的108头荷斯坦牛的血清来评估IgG、IgG1和IgG2/PPA ELISA的性能。

JD诊断如前所述[25］.简单地说，我们检查动物的临床症状和地图通过PCR鉴定乳汁和粪便分离菌落中是否存在IS900片段。牛奶样品用地图-特异性免疫磁珠（美国马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室NEB）[27，28］.在Herrold蛋黄培养基中进行粪便培养，培养基中含有mycocoactin J (Allied Monitor Inc.， Fayette, MO, USA)和丙酮酸(Sigma-Aldrich Corp.， St. Louis, MO, USA)。

动物分组如下：(我)公开(E,n= 30):从地图无JD临床症状，IS阴性900-PCR（来自粪便和牛奶）；(2)亚临床感染(SC,n= 26):地图无JD临床症状，IS阳性900-PCR(从粪便、牛奶或两者);(3)临床感染(C,n= 14):地图感染了慢性腹泻和IS阳性的牛群900-PCR(从粪便、牛奶或两者);(iv)健康的控制(Hc,n= 38):从地图自由的畜群和消极的IS900-PCR（来自粪便和牛奶）。

２.２.elisa

用108头牛血清检测IgG、IgG1和IgG2/ ppa - elisa。交叉反应抗体被预先吸附分枝杆菌phlei［29在37°C条件下，在含有10%白蛋白-葡萄糖-氯化钠的Middlebrook 7H9培养液(DifcoTM, BD biosciences, Franklin Lakes, NJ, and USA)中培养，然后在85°C下热灭活30分钟。为了预吸附，用含有热灭活的PBS稀释血清1:5分枝杆菌phlei(光密度(OD) 600 nm为1)在37℃摇匀孵育1 h，然后在4℃孵育16 h。

平底96孔聚苯乙烯板(4°C, 16 h)涂2g/well的PPA (Allied Monitor Inc.L/0.05 M碳酸钠缓冲液pH值9.6．用漂洗缓冲液(0.05% Tween 20在PBS中)冲洗3次，用10%脱脂牛奶在PBS中封闭。所有后续孵育均在37℃下进行1小时，每次孵育后，用漂洗缓冲液冲洗3次。50卷在PBS中加入5%脱脂牛奶中最终稀释1:5(用于IgG2分析)或1:100(用于IgG和IgG1分析)的预吸附血清。使用的抗体是:酶标山羊抗牛IgG (KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.， Gaithsburg, MD, USA)，酶标绵羊抗牛IgG1 (Bethyl Laboratories Inc.， Montgomery, TX, USA)，小鼠单克隆抗牛IgG2 (Sigma-Aldrich Co.)，然后是酶标山羊抗小鼠IgG (KPL)。平板使用邻苯二胺二盐酸盐(OPD, Sigma-Aldrich Co)在柠檬酸缓冲液(Sigma-Aldrich Co)中开发，并在OpsysMR分光光度计中读取(Dynex Technologies, Chantilly, VA, USA)。结果以490 nm处的平均OD值表示。

2.3.数据分析

所有实验都是重复或重复的，并且至少重复两次。

STATISTIX 8.0（分析软件，美国塔拉哈西）用于分析针对PPA的体液免疫应答数据。各组之间比较获得的平均OD值的对数。IgG和IgG2水平采用方差分析，然后采用Tukey试验进行研究，而IgG1水平采用Kruskal-Wallis试验进行分析，然后进行配对比较。

采用比利时Mariakerke公司的CurvMedCalc软件版本12对感染牛IgG、IgG1和IgG2/ pa - elisa进行评价，并构建receiver operating characteristic (ROC)曲线。每项试验的敏感性估计为在选定的截止点感染牛(亚临床感染、临床感染或两者)检测阳性的百分比。每项试验的特异性以健康对照组在选定的截点处检测阴性的牛的百分比计算。亚临床和临床感染牛IgG、IgG1和IgG2/ ppa - elisa的ROC曲线被构建为每一个可能的截止点的敏感性与100减特异性的曲线[30.，31］.采用不同的方法评价各酶联免疫吸附试验的截止点。分析健康对照组平均OD值±2标准差及感染牛的ROC曲线。从ROC曲线中选择截止点，以获得对亚临床感染牛的最高敏感性，特异性至少为90%。估计各ROC曲线下面积(AUC)，并使用DeLong等人描述的方法对AUC进行比较[32］.

显著性水平设为P值< 0.05。

3.结果

健康对照牛、暴露牛、亚临床感染牛和临床感染牛血清的同型/ ppa elisa结果如图所示1和表1．各组血清中ppa特异性IgG均显著升高地图-感染群(暴露、亚临床感染和临床感染)与健康对照组进行比较。此外，临床感染组的检测值最高。当用IgG1/PPA-ELISA对各组进行评价时，只有临床感染组表现出高水平的该同型。与此同时，各组血清特异性IgG2水平均显著升高地图来华的群(P< 0.05)。

亚临床和临床感染组IgG、IgG1、IgG2/ ppa - elisa曲线如图所示2．正如预期的那样，临床感染组的AUCs高于亚临床感染组(表)2）.

IgG/PPA-ELISA对临床感染牛的特异性(100%)和敏感性(92.9%)最高3.）.然而，在亚临床感染动物中，仅检测出6/26的阳性，在暴露动物中检测出8/30的阳性1）.

IgG1/PPA-ELISA检测灵敏度低，为27.5%地图-感染的牛(亚临床和临床感染)，图2、表2和3.）.

与IgG/PPA-ELISA (AUC = 0.719)和IgG1/PPA-ELISA (AUC = 0.526)相比，IgG2/PPA-ELISA的特异性为92.1%，对亚临床感染组(AUC = 0.812)的检测效果最好，亚临床感染动物的检测率为53.8%，暴露动物的检测率为63.3%(图)2和表1- - - - - -3.）.此外，IgG2/PPA-ELISA的敏感性最高(65.0%)地图被感染的牛)，并且能够检测到26/40的地图来华的牛。IgG/PPA-ELISA检测结果仅19/40。

4.讨论

同型反应地图-曾对受感染的牛进行研究[10，13，14，24，25］.我们已经描述了地图-特异性同型检测血清中高水平的IgG2地图-处于亚临床和临床阶段的受感染牛只[13，25].考虑到PPA是地图最广泛使用的抗原[13，22，33]在本研究中，我们开发了同型/PPA ELISA，以评估其在牛JD诊断中的应用。

据描述地图感染的动物在临床阶段是粪便中细菌脱落率高的，因此具有最大的传播潜力地图向兽群中的其他动物[7，34］.与此同时，亚临床感染的牛通常脱落较低水平的地图它们是最大的一部分地图因此，对这些动物的检测对控制JD具有重要意义[35］.

在这项工作中，我们检测到从临床感染动物的血清中ppa特异性IgG的水平增加。相似的反应地图抗原以前曾有报导[10，13，25］.我们还检测到亚临床感染组的特异性IgG水平升高，与我们之前使用的研究相比地图-作为抗原的全细菌[25］.IgG/PPA-ELISA检测特异性100%;这与已发表的研究一致，这些研究描述了从94到100%的特异性[21，36］.

虽然IgG1对地图-抗原已被描述为临床感染动物的特征[13，14，24，25]，在本研究中，ppa特异性IgG1的检测并不能提高该阶段疾病的诊断。

有趣的是，IgG2/PPA-ELISA能够检测到大多数亚临床和临床感染的动物，证实了我们的初步研究[13，25］.

虽然对血清进行了预吸附，但健康对照组3只动物的OD值高于IgG2/PPA-ELISA的截止值(图)1和表1）.这可能与特异性较低(92.1%)有关。

我们的研究表明，IgG/PPA-ELISA是鉴别临床感染动物的最佳方法，具有较高的敏感性和特异性，与传统elisa主要鉴别这类感染牛的公认说法一致[21，23］.

另一方面，与传统IgG/PPA-ELISA相比，我们的IgG2/PPA-ELISA提高了检测到的亚临床感染牛的数量（53.8对23.1%），保持了高水平的特异性。然而，这种敏感性略低于Paolichi报告的敏感性[33，尽管这可能与所包含的动物数量有关(26只vs 8只)。

粪便培养的敏感性已被报道过低，以确定缺乏地图居住在已知受感染畜群内的动物受感染[21］.事实上,地图-受感染的牛在早期可能会脱落细菌，使用目前的方法，包括培养和聚合酶链反应[35］.同样，尼尔森[37最近强调了研究的重要性地图-受感染的脱落动物和非脱落动物评估基于免疫的诊断测试。因此，在目前的工作中，我们纳入了一组暴露于地图将其排除在特异性和敏感性分析之外。在该组中，使用IgG2/PPA-ELISA检测到的阳性动物比其他同型检测到的阳性动物更多(63.3 vs 26.7或3.3%)。Huda等人使用IgG/PPA-ELISA检测，发现11%的暴露动物呈阳性[31］.

提出了新的抗原，以提高IgG/ELISA诊断JD的敏感性[34，36，38］.因此，在IgG2/ELISA中评估这些抗原可能是有趣的。

总之，我们的结果表明，IgG2/PPA-ELISA可提高亚临床的检测地图-感染JD各阶段动物的牛或牛群，并与IgG/PPA-ELISA结合，可提高疾病临床阶段的区分。应进行更多研究，以更好地探讨IgG2/PPA-ELISA的效用，其中应包括自然和实验感染的牛，并应包括感染状态此外，还应进一步评估IgG2检测在约翰氏病血清学诊断中的有用性。

致谢

作者要感谢Claudia Morsella的宝贵技术支持，以及VMD Soledad Barandiaran和Maria Laura Fortuny在现场取样方面的合作。这项工作得到了国家机构Promoción Científica y Técnica (BID PICT 2010-2672)和布宜诺斯艾利斯大学(UBA-SeCyT 20020100100912)的资助。

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