达尔盐敏感大鼠ACEI治疗后活性氧与心肌纤维化的关系

摘要

比较了马来酸依那普利和抗氧化剂阿拉西普利对达尔盐敏感大鼠的心脏保护作用。为评价心脏纤维化与血压/氧化应激指标(组织TBARS)的相关性，计算相关指数。结果显示，大剂量阿拉西普利(30 mg/kg/d, H组)与马来酸依那普利(10 mg/kg/d, E组)心肌纤维化程度差异有统计学意义(p < 0.05)。纤维化更多的是受氧化应激的影响，而不是受血压的影响，我们不应仅根据降压作用选择ACEI，而应更多考虑ACEI的心脏保护作用。

1.介绍

心力衰竭是一种表现为收缩功能不全、舒张功能不全或两者兼有的综合征。诱发心力衰竭的机制有很多。然而，心脏重塑和连续的心肌纤维化似乎对心力衰竭同样有作用。虽然许多因素被认为是心脏重塑的致病因素，但肾素-血管紧张素系统(RAS)、交感神经系统和活性氧(ROS)被认为是相互复杂相互作用的主要因素。由于血管紧张素II (angiotensin II, Ang II)是由RAS产生并诱导交感神经系统的激活和ROS的增加，调控RAS被认为是防止心肌纤维化的重要措施。

两种类型的RAS，循环RAS和心脏RAS，其作用方式不同[1.–6.］．循环RAS是对心输出量减少的反应而被激活的，心输出量减少主要通过钠潴留收缩外周血管而使血压升高。心脏RAS直接刺激心肌细胞肥大和成纤维细胞增殖，导致左室肥厚、舒张和收缩功能障碍、心律失常、心力衰竭，最终导致心肌细胞死亡。为了维持心脏功能，抑制心脏RAS似乎很重要，许多类型的血管紧张素转换酶抑制剂(ACEIs)被用于这一目的[7.］．

各种类型的ACEIs具有非常相似的基本血管抑制作用;然而，它们的药代动力学略有不同。为了稳定治疗效果，减少不良反应，目前可用的acei均为前药形式，在发挥作用前需在体内转化为活性形式。此外，有些acei对组织中的ACE作用可能比对循环血液中的ACE作用更直接[8.]。目前，市面上有五种此类ACEI可供兽医使用；然而，这些药物尚未通过对比研究进行充分研究，以确定哪种药物在治疗心力衰竭方面更有效、更有利。例如，尽管阿拉西普利是一种长效、含巯基的ACEI，但关于其心脏保护作用的信息很少[9］．在本研究中，我们评估了阿拉西普利的心脏保护作用，并将其与另一种广泛应用于兽药的ACEI——依那普利进行了比较。

2.材料和方法

实验方法得到了东京农工大学动物保护和使用委员会的批准。三周龄达尔盐敏感大鼠（DS大鼠，埼玉实验动物供应，埼玉，日本）用低盐（0.3%氯化钠）饮食（BP 168.8±52）。 在7周大时，他们被切换到高盐（8%NaCl）饮食。然后他们被分成四个亚组，接受低剂量的阿拉西普利（10 mg/kg/天，L组），高剂量阿拉西普利（30 mg/kg/天，H组），依那普利（10 mg/kg/天，E组）和安慰剂（5%阿拉伯树胶溶液，P组）。从7周开始，每2周使用尾套法（MK-2000，日本东京Muromachi Kikai有限公司）进行一次无创血压测量。使用相控阵扇形扫描仪（SSD-5000，日本东京阿洛卡）进行超声心动图研究.全身麻醉下腹腔注射盐酸氯胺酮（60 mg/kg）和盐酸甲苯噻嗪（5 在乳头肌中，室间隔舒张厚度（IVSd，mm）、室间隔舒张厚度（IVSs，mm）、左室后壁舒张厚度（LVPWd，mm），用M型测量法测量左室后壁收缩厚度（LVPWs，mm）、舒张末期左室内径（LVIDd，mm）和收缩末期左室内径（LVIDs，mm），以及缩短分数（%FS）根据LVIDs和LVIDd计算。然后获得左胸骨旁心尖四腔视图记录二尖瓣流入。测量E和A峰值，计算A/E比率。每次超声心动图测量重复三次，并使用其平均值进行评估。

在19周大时，老鼠接受了戊巴比妥钠致死注射。从腔静脉采血，然后行中线开胸术，取出心脏并在乳头肌处横切。心脏根尖区用于测定氧化应激，基底区用于测定心脏纤维化。血液和心脏样本立即冷冻，并在−80°C保存，直到获得测量值。

以尿8-羟基-2 '脱氧鸟苷(8-OHdG)、血浆和组织硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)作为脂质过氧化和氧化应激的指标。8-OHdG水平的测定方法以前曾使用商业试剂盒(8-OHdG高敏感ELISA试剂盒，JaICA, Hukuroi，日本)，适用于人、小鼠、大鼠、兔、狗、牛和马的样品[10]。培养和洗涤后，使用与辣根过氧化物酶结合的抗小鼠二级抗体测定结合的单克隆抗体。显色率与分析物浓度成正比。通过四参数logistic曲线拟合进行数据缩减。通过先前的方法测定TBARS水平报告使用商业分析试剂盒（TBARS分析试剂盒，美国密歇根州开曼化学公司）[11].简而言之，血清样品和均质组织样品与TBA工作溶液一起孵育，并在532测定有色复合物 然后使用由1,1,3,3四乙氧基丙烷构建的校准曲线计算TBARS浓度。尿8-OHdG和血浆/组织TBARS以浓度（ng/mL、nmol/mL和nmol/mg蛋白质，分别）表示。

进行左室组织学检查，量化心肌纤维化。石蜡包埋心室，切薄切片(厚度:3μM)以通常的方式。然后用苏木精-伊红和小天狼星红染色。测定左心室胶原密度百分比。在×200放大的10个随机区域用小天狼星红染色后评估每个区域。采用计算机形态学测量系统(Mac Scope Ver 2.69.1, Mitani Co.， Fukui, Japan)计算胶原密度百分比，所有天狼星红染色阳性区域之和除以每只大鼠所有心肌区域之和。

使用商业软件(PRISM 5 for Mac, GraphPad software Inc.， CA, USA)进行统计分析。结果用均数±标准差表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Bonferroni’s multiple comparison test评估组间特定阶段的差异。的概率值被认为具有统计学意义。

3.结果

本实验共选用DS大鼠40只，每组10只。给药前平均血压为 在19周龄时，各组均观察到显著增加（P组：毫米汞柱;L:毫米汞柱;H组: mmHg；E组： 毫米汞柱，数字1.）．H组表现出抑制作用，但组间差异无统计学意义。两组之间的心率没有显著差异。

表中总结了超声心动图研究的详细数据1.．19周龄时，E组的IVSd、IVSs和LVPWd显著降低;而在L、H、p组中，上述结果无明显变化。此外，ACEI给药组(L、H、E组)间差异无统计学意义。

有关尿液8-OHdG、血浆和组织TBAR和纤维化的详细数据总结在表中2.．除了心肌纤维化外，两组之间没有差异。左室组织学检查，H组心肌纤维化最低， E组间差异有统计学意义(）．E组与P组差异无统计学意义。

心脏纤维化与血压(mmHg)/组织TBARS (nmol/mg蛋白)的相关系数如图所示2.．P组和L组组织tbar与左心室心肌纤维化及血压无显著相关性(和和,分别地。,for cardiac fibrosis and和和H组和E组的组织TBAR与左心室的心肌纤维化显著相关(和,，而心脏纤维化与血压之间无显著相关性(和,、职责)。

4.讨论

据报道，DS大鼠的血压随盐摄入量的增加而急剧升高[12,13].在4至5周时观察到血压升高和进行性左心室肥厚，在大约19周时导致明显的舒张性心力衰竭[14］．在目前的研究中，ACEI从第7周到第19周进行，预计这个时间范围包括高血压心力衰竭的早期到末期。但高盐食物引起的高血压差异较大，比较各组药物疗效存在一定难度。

两组之间未观察到血压差异。在19周龄时，ACEI给药开始降低血压，尤其是在H组。在高剂量阿拉西普利组中观察到的血压降低可能是由于药物效力；或者，抗肾上腺素或抗氧化作用，仅在acepril具有，可能具有协同作用以促进降压作用。

观察阿拉西普利的抗肾上腺素作用，观察心率。两组之间没有显著差异，阿拉西普利的直接抗肾上腺素作用尚未得到证实。清醒DS大鼠的心率约为500次/分，本研究中血压测量的压力可能导致心率升高。因此，以心率作为评估抗肾上腺素作用的方法似乎不令人满意;另一种方法，如测定血液去甲肾上腺素浓度，可能提供更准确的选择。

通过血浆和尿液中的8-OHdG和心肌组织中的TBARS三个参数来评估抗氧化作用。当脱氧鸟嘌呤受到氧化损伤时，8-OHdG被释放到细胞质中。释放的8-OHdG不代谢;它在血液中循环，然后作为滤液从尿液中排出[15].由于8-OHdG在血浆和尿液中易于测量，因此其存在被认为是可重复测量的氧化应激标志物。然而，8-OHdG在各组之间没有差异。事实上，8-OHdG具有动态生理变化，尤其是在尿液中，并且不能反映心脏状况。因此，不能将其视为确定ACEIs心脏效应的指标。另一方面，与E组相比，H组的组织TBAR显著降低。TBAR是当细胞膜中的磷脂被脂质过氧化物氧化时产生的；因此，它被用作细胞膜氧化损伤的参数[16]。但是，TBAR也可以通过其他方式生成。为了准确测量，我们应该在相似的基础上测量样品，并以相对的方式比较结果[17]。由于本研究中TBARS的样本仅限于从DS大鼠心脏基底部获得的组织，且样本采集和测量采用相同的条件，因此TBARS的结果表明自由基的相对水平。与E组相比，H组观察到的自由基减少为cau由于去乙酰拉普利和卡托普利中巯基的抗氧化作用，以及压力负荷的降低，这有助于减少氧化应激。通过这些机制，高剂量的阿拉西普利可以减少心肌组织中ROS的产生，并提供心脏保护作用。

左心室纤维化的测量代表心脏暴露于高血压12周后的心脏重塑量。虽然在H组降低ROS水平观察,没有明显减少心脏纤维化和血压之间的观察组P .这个结果的一个原因是组P显示高分散的药物,这可能是有关在salt-sensibility分散,压力过载,ROS和反应。此外，各组的心肌纤维化率均较低，故除H组与e组之间存在显著性差异外，不认为存在显著性差异。在我们之前的研究中，我们认为12周足够诱发心力衰竭;然而，可能需要更长的观察时间[18］．左心室纤维化H组与e组差异有统计学意义，P组与H组差异无统计学意义。因此，我们无法确定这一结果是由于E组的纤维化增加还是h组的纤维化减少。为了在个体水平上将心脏纤维化与其他因素联系起来，我们计算了与血压和组织TBARS的相关系数。E组和H组心肌纤维化与组织tbar之间存在强相关性;而P组和l组心肌纤维化与血压、与组织TBARS均无显著相关。在自发性高血压大鼠中，假定心肌纤维化和血压之间没有因果关系。心肌纤维化与组织TBARS的相关性在各组间存在较大差异。氧化应激参与了ang - ii相关高血压的发病机制，并调节干细胞和祖细胞的更新或衰老[19］．因为TBARS也可以被ACEIs或血管紧张素受体阻滞剂通过抗血管紧张素II机制抑制，而不依赖于血压降低[20–22]，去乙酰拉普利所具有的巯基的抗氧化机制很难估计。尽管需要更详细的研究来阐明阿拉西普利的确切抗纤维化机制，但有人认为，在ACEI给药的情况下，活性氧对心脏纤维化的影响比血压更大。

19周龄时，超声心动图观察到左心室后壁和室间隔的心脏增生。压力过载是增生的主要原因，ACEIs对其发展有抑制作用。P组和E组之间存在显著差异，而g组之间没有显著差异两组给予ACEIs。据报道，DS大鼠的肾素系统不受盐诱导高血压的影响，交感神经系统更多地参与了该模型[23］．由于%FS在此期间没有改变，因此收缩功能通过给药程序得以维持。根据与心脏纤维化相关的发现，没有发生重构，这导致严重的收缩功能障碍。由于DS大鼠左心室后壁厚度仅为2mm，心率高达200次/分，单凭超声心动图结果难以判断心脏纤维化程度。

5.结论

本研究报道了本研究中使用的DS大鼠心肌纤维化水平相对较低，本研究模型似乎不适合评价ACEI对纤维化的抑制作用。然而，通过对纤维化率、ROS和血压的单独分析，我们可以证明这些因素之间的关系。结果表明，ROS在心肌中的重要性，提示我们在使用ACEIs治疗心力衰竭患者时应更加重视这一因素。在本研究中，我们采用压力超载模型更清楚地评价了交感神经的直接抑制作用和自由基清除作用;然而，在兽药中使用阿拉西普利的一般适应症是容量超载，如二尖瓣反流。我们也应该从清除自由基的角度来评价阿拉西普利的体积超载模型的作用。

缩写

ACEI：	血管紧张素转换酶抑制剂
拉:	肾素-血管紧张素系统
ROS:	活性氧物种
8-OHdG:	8-羟基-2′-脱氧鸟苷
TBARS:	硫代巴比妥酸活性物质
IVSd mm:	室间隔的舒张厚度
IVSs，毫米：	室间隔的收缩期厚度
LVPWd mm:	左室后壁舒张期厚度
LVPWs，毫米：	左室后壁收缩厚度
LVIDd mm:	舒张末期左心室内径
LVIDs mm:	收缩期左室内径
% FS:	部分缩短。

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