文摘

回顾本研究的目的是确定是否牛从密歇根州被归类为牛结核病反应堆,基于目前批准的现场和实验室测试方法,是公开的感染鸟型分支杆菌无性系种群。副结核(地图)。本研究纳入384名成年牛提交诊断中心人口和动物健康超过7年。牛利用标准方法进行测试,以确认所有的牛都不利于感染病灶和文化牛结核分枝杆菌在尸检。回顾性分析formalin-fixed、石蜡包埋的部分回肠和回盲肠的淋巴结被组织病理学评价,抗酸的染色和PCR检测检测地图。总的来说,只有1.04%的牛显示明显的感染地图视觉检查的部分回肠和/或ileo-cecal淋巴结。这可能略微增加到2.1%的牛感染地图使用PCR鉴定后额外的测试。基于这些结果,我们发现没有证据表明显性感染地图过程中起着重要作用假结核反应堆为牛在这项研究检查测试结果。

1。介绍

识别的牛结核病在1994年在密歇根州白尾鹿,以及随后的识别结核牛,导致一个长期的监测项目在牛结核病1]。到目前为止,已发现50牲畜在密歇根,包含一个或多个牛分枝杆菌被感染的动物(2]。成千上万的牛已经测试了可疑的核反应堆在尾折叠测试(钢管)和颈比较测试(CCT)或γ干扰素测定(γ干扰素),但是只有138头牛被发现感染牛分枝杆菌。牛发现的大量假阳性反应堆现场和实验室测试,而相对较少的牛最终诊断为结核病阳性,反映当前批准临死前的特异性的诊断程序,当疾病患病率较低。发展提高临死前的筛查检测牛和其他物种感染牛结核分枝杆菌(牛分枝杆菌)牛结核病的因果代理,最近的研究的主题(3- - - - - -10]。这个活动是由小于最佳目前批准的敏感性和特异性诊断测试临死前的检测结核病。

牛结核病诊断测试屏幕目前批准在美国包括钢管,有条件现金转移支付和全血γ从分析(11]。皮肤测试细胞介导免疫反应(过敏反应延迟类型)的注射刺激纯蛋白衍生物(产后抑郁症)从培养获得牛分枝杆菌。整个血γ负无穷到化验也细胞介导的反应(生产的措施γ从刺激与产后抑郁症后淋巴细胞)。产后抑郁症是列举了变量的内容复杂混合物的各种抗原组件准备文化分枝杆菌(6,12,13]。许多抗原在产后抑郁症之间共享各种品种的致病性和非病原的分枝杆菌。因此,有人担心之前曝光的牛,或并发感染牛分枝杆菌以外牛分枝杆菌将影响当前诊断的敏感性和/或特异性检测(6,12,14- - - - - -20.]。鸟型分支杆菌无性系种群。副结核(地图)是普遍在密歇根,与生物体可能影响和感染牛结核病(目前批准的测试的结果19,21,22]。

牲畜感染的患病率相对较高的地图和牛感染地图在密歇根,和牛结核病患病率低检查后期,促使我们进行回顾性研究,以确定是否公开感染假阳性反应堆的地图是一个重要的原因为结核病目前批准的测试。因为牛结核病是一个监管人畜共患潜在疾病,尸检怀疑的牛结核病是专注于集组织的目标牛分枝杆菌,和收集额外的组织使用其他比诊断结核病的不是标准的做法。用地图来确定感染的牛,我们仅限于formalin-fixed,石蜡包埋回肠末端和ileo-cecal淋巴结。我们的目的是检查那些可用组织微观损伤与感染图一致,确定抗酸的彩色生物组织内,并证实感染地图使用聚合酶链反应(PCR)检测。

2。材料和方法

2.1。牛选择标准

牛包含在本回顾性研究来自13个相邻县在密歇根半岛东北部的部分低。这个地区的国家正在积极为牛结核病监测项目,少量的定期检测到受感染的牛在这个领域(23]。牛指定了尸检从羊群中删除前一天尸检和运送到一个孤立的安全设施。研究后期检查所有牲畜牛结核病诊断中心人口和动物卫生(DCPAH),密西根州立大学,在6月7日,2001年和2008年5月1日。牛是成年动物(大于两岁),大多数女性(96%)。相比有一个明显的优势的奶牛肉牛(2:1)。最后,只有牛购买密歇根州的结核病监测的目的是包括在内。研究中所有的牛被发现为显性感染阴性牛分枝杆菌使用标准化的后期诊断方法(24,25]。淋巴组织从所有的牛都提交给国家兽医服务实验室(NVSL)在艾姆斯,爱荷华州的确认病理病变和文化牛分枝杆菌。主要的牛被分组,根据结果尾褶皱皮肤试验(钢管)和二次比较颈皮肤测试或全血γ干扰素测定牛结核病。组1包括假阳性的189头牛反应堆在初级和二级考试。第二组包括假阳性的122头牛只反应堆的钢管。组3包括的73头牛-钢管和后期检查没有二次测试执行;这群人被认为是消极的对照组。牛结核病组2和3中包括来自积极的牛群,被蹂躏或牛已经被暴露于动物,牛结核病和被研究了牛结核病的后期。

2.2。尸体剖检,牛分枝杆菌诊断

牛被运到DCPAH活着,他们安乐死过剂量的静脉注射巴比妥酸盐。同样的诊断协议进行所有的动物。总值后期考试进行的注意力指向检查动物的肺、淋巴结和ileal-cecal-colic结。淋巴结被解剖地区收获(颅、胸和腹部),以及一段回肠末端。淋巴结是分段连续生产总值(gdp)考试。部分每个淋巴结和回肠组织病理学neutral-buffered福尔马林固定在10%,而其他部分相同的淋巴结被运来新鲜的冰袋结核病实验室,国家兽医服务实验室(NVSL),艾姆斯,爱荷华州、分枝杆菌分离和鉴定使用先前描述的技术(24,25]。Formalin-fixed淋巴结的样本和回肠末端是嵌入在石蜡,分段5嗯,经常处理苏木精和伊红染色())和Ziehl-Neelsen酸快。部分染色组织进行显微镜下为肉芽肿性炎症和抗酸的细菌的存在。

2.3。组织处理和DNA提取

三个系列的部分,20μ米厚,被从每个石蜡包埋块回肠末端。组织部分放入无菌1.5毫升微型离心机管和储存在室温下,直到加工提取的DNA。块之间的石蜡包埋组织切片机的刀片与吸收剂擦拭干净组织浸满0.01家用漂白剂溶液10%磷酸缓冲盐溶液(pH值7.2)。DNA提取,1部分石蜡包埋回肠ileo-cecal淋巴结从每个动物被放置在一个微型离心机管,使用无菌牙签。石蜡包埋组织的其余部分是储存在室温下使用。提取DNA, PCR进行使用先前描述的方法和PCR引物和轻微的修改(26,27]。简单地说,一个1.5毫升微型离心机管包含一个部分石蜡包埋回肠离心机在16000×g 1分钟24°C崩溃组织切片。大约有200μL 0.5%的解决polyoxyethylene-sorbitan单月桂酸酯(渐变20)DNase和核糖核酸酶自由分子生物学年级水被添加到每个微型离心机管。沸腾的管接受了2周期和快速冻结使用第一次10分钟孵化100°C跟随3分钟浸进干ice-ethanol浴。最后,管是孵化一个额外的10分钟在100°C和离心机在3000×g在4°C颗粒组织碎片和熔化的石蜡表面浮动。石蜡层被无菌牙签,和5μL液相的吸气和接种到200μ包含PCR引物和20 L PCR管μL PCR反应混合物。归档formalin-fixed DNA提取方法进行了测试,石蜡包埋的部分回肠和ileo-cecal淋巴结从25牛没有提交DCPAH结核病尸检和证实感染由细菌培养地图。组织块从5到8年归档时DNA提取、和抗酸的生物的数量从众多不同没有观察到这些部分。只有部分的组织从一个文化积极的PCR试验动物产生消极的结果。来自动物多个石蜡包埋的组织块进行显微镜下,和块测试- PCR分析缺乏明显的抗酸的生物。

2.4。聚合酶链反应(PCR)检测

从IS900地图使用的PCR引物序列,5′-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG和5′-AATCAACTCCAGCAGCGCGGCCTCG,并取得了229个碱基对的产物。PCR是在所有384个样本的回肠和ileo-cecal淋巴结。随后,271年代表样本的回肠3组牛(包括所有组织阳性地图)受到PCR试验检测而设计的m . avium群有机体。PCR引物,用于测定来自16 s rrna的基因,5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和5′-ACCAGAAGACATGCGTCTTG,并取得了193个碱基对的产物。PCR反应混合物包括PCR缓冲,1.5毫米MgCl2,0.2毫米每dATP dGTP dCTP, dTTP, 1.25单位HotStar Taq 0.4 pmol /μ每个引物L IS900或1.0 pmol /μ我的每个引物m . avium组和5μL的DNA样本。PCR反应条件1 95°C的循环15分钟,50周期为1分钟94°C, 65°C(地图)或61°C (m . avium为15秒),72°C 2分钟,其次是1 72°C的周期10分钟。PCR扩增产物进行了分析,用1.5%的琼脂糖凝胶电泳凝胶在硼酸钠缓冲0.5毫克/毫升的溴化乙锭到熔融混合凝胶(28]。

2.5。统计分析

之间的关联PCR-confirmed地位和地图牛分枝杆菌测试状态(主要和次要测试反应堆,反应堆主(钢管),和初级测试-牛)测量的优势比牛分枝杆菌测试反应堆相比,牛分枝杆菌测试-牛,确切概率法被用来确定这些联系是统计学意义( )。

3所示。结果

3.1。组1牛

这群牛被发现可疑结核病在顺序主要和次要牛结核病的筛查。第二顺序的筛查,有条件现金转移支付或γ干扰素测定,旨在减少假阳性的数量反应堆可能归因于先前感染的动物m . avium分枝杆菌。积极的反应堆的189头牛牛结核病的初级和二级测试,只有一头牛是积极采用聚合酶链反应对地图(表1和2)。总值或微观损伤符合慢性细菌性肠炎中,并未观察到组织从牛或组织从任何其他动物在组1(表2)。同时,酸的快速生物没有发现部分回肠或ileo-cecal淋巴结组1的任何动物。PCR检测的检测而设计的m . avium群有机体是阴性牛在这组(表进行测试1和2)。

表1
总结各种筛选测试的结果对牛结核病和PCR检测的结果。
表2
总结病理和PCR结果在地图上被感染的动物。
3.2。组2牛

牛在这组假阳性反应堆在钢管和二次测试呈阴性。牛反应堆的钢管和负在第二次感染的筛检试验牛分枝杆菌可能是分枝杆菌感染的吗m . avium团体或环境分枝杆菌,而不是牛分枝杆菌。因此,牛在2组应该在更高的感染风险地图或与其他的成员m . avium在组1组比牛分枝杆菌。三组2的122头牛被PCR阳性感染地图(表1和2)。两个3牛有严重病变的慢性细菌性肠炎、轻度至中度组成的增厚的回肠末端墙(表2)。这两只动物也有微观肉芽肿病变符合慢性细菌性肠炎包括可见酸快速生物在回肠和ileo-cecal淋巴结肉芽肿性淋巴腺炎。此外,组织部分从这些动物被PCR阳性m . avium群细菌(表1和2)。第三个地图使用PCR检测阳性动物缺乏总值或微观损伤符合慢性细菌性肠炎和缺乏可见酸快速生物部分回肠或ileo-cecal淋巴结。这头牛被PCR为负m . avium分枝杆菌。没有剩余的122头牛在2组病变符合慢性细菌性肠炎,在部分的组织,可见酸快速生物或PCR检测阳性的地图m . avium分枝杆菌。

3.3。组3牛

这个群体主要包括牛来自TB-infected牛群,但也包括一些牛,从TB-infected牛群其他群落之前检测结核病的群起源。动物被宰杀的原因包括不节俭,残废,乳腺炎或其他慢性疾病的条件。牛在这个组由钢管但没有积极的反应堆的钢管。四个73头牛被发现通过PCR检测阳性地图,和两个牛也积极的PCR检测m . avium组分枝杆菌(表1和2)。这些4牛总损伤与慢性细菌性肠炎一致,但耐酸的生物中发现的部分回肠从一个牛积极为地图和PCR检测m . avium组分枝杆菌(表1和2)。没有剩余的69头牛在这个组病变符合慢性细菌性肠炎,在部分可见抗酸的生物组织,或者是由PCR阳性化验的m . avium分枝杆菌。

3.4。统计分析

没有统计上的显著差异之间的客运假阳性牛组2和钢管-牛组3。此外,初级和中级测试反应堆组之间的差异(组1)和钢管-牛(组3)接近统计学意义( )(表3)。

表3
优势比为牛分枝杆菌测试反应堆相比,牛分枝杆菌测试-牛,PCR-confirmed地图状态。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们试图确定是否公开感染牛的地图是假阳性反应的常见原因为牛结核病目前批准的现场和实验室测试。这是一个回顾性研究,利用样本384牛后期检查和诊断牛结核病的自由。我们使用一系列诊断化验,包括总检查回肠的增厚,显微镜检查的苏木精和伊红染色部分回肠末端和ileo-cecal淋巴结的组织细胞的或肉芽肿性浸润,显微镜检查抗酸的彩色部分回肠和ileo-cecal淋巴结染色检测生物,最后PCR。这种诊断方法类似于当前的建议检测慢性细菌性肠炎后期(29日]。

我们的结果是类似于最近的研究,评估formalin-fixed,石蜡包埋组织为明显的慢性细菌性肠炎监测在随机选择牛屠宰(30.,31日]。很少有牛( %)在当前的研究中有损伤和/或酸的快速彩色生物会被认为符合公开感染地图。因为牛结核病是一个监管疾病和样品的新鲜组织运往NVSL最终诊断,从粪便细菌培养或组织并没有试图在当前DCPAH研究。很可能使用新鲜组织培养技术和PCR检测会导致识别额外的牛感染地图没有明显的病变(30.,31日]。

进一步测试的组织样本,使用IS900 PCR鉴定,取得了积极的结果从一个额外的4牛没有显示病变或抗酸的生物组织。这一发现并不令人惊讶,因为PCR可能更早些时候感染的敏感指标地图比总值或组织学病变(32]。PCR分析是基于IS900,多个复制转座因子常用的目标检测地图(33]。这个插入序列已被确定在分枝杆菌以外的地图(34,35]。因此,它是可能的,一些积极的8牛在PCR可能同时感染了结核分枝杆菌以外的地图。试图在当前的研究中确定了牛分枝杆菌感染除了地图,使用一个与PCR检测,可以检测的多数成员m . avium组,包括地图。然而,PCR试验时才产生了积极的结果抗酸的彩色生物组织中发现,当地图的PCR试验取得了积极成果。因此我们目前未能最终确定动物感染了结核分枝杆菌以外的地图。以前的研究也发现的PCR检测m . avium群有机体产生积极的结果用福尔马林fixed-tissue少于的PCR分析地图(26]。

基于临死前的实验室测试中,地图的患病率在密歇根的奶牛种群最近估计大约50%的感染的个体牛估计5 - 15%对于大多数牛群和感染率高于15%在一些群21,22,36]。地图的患病率在密歇根的肉牛群被认为是大大低于奶牛的患病率。大约三分之一的牛肉牛在当前的研究中,并没有一个牛怀疑是感染了地图在当前的研究中是牛肉。包含大量的牛肉可能降低感染的比例地图发现在当前的研究中。

组1和2的牛是反应堆1或多个领域和/或为检测牛结核病的实验室测试。如果感染地图现场或实验室测试的结果影响结核病通过增加假阳性的数量反应堆,牛在组1和/或2可能有更高的利率比牛感染地图在3组,由消极的牛结核病的钢管测试。这样的结果并没有观察到。相反,地图,感染或其他生物拥有IS900,被发现在5.5%的牛组3,相比之下,2.5%的牛组2和0.5%的牛组1(表1)。最近的报告表明,以前或现在分枝杆菌感染非结核组分枝杆菌不利影响目前批准的检测牛结核病的现场和实验室测试,导致更高的假阴性率测试(14,15,34]。由于牛结核病是一个监管的疾病,我们没有试图检测牛分枝杆菌在接触的群牛TB-infected牛,但检测结核病在客运测试为阴性。

福尔马林固定是导致DNA降解可以妥协的PCR检测。推荐使用PCR引物集放大短序列(少于200个基点)当formalin-fixed组织化验(37]。PCR引物组在当前研究中使用放大目标约200个基点的长度,所以我们的化验formalin-fixed推荐上限目标探测的组织。这可能会影响我们的结果,减少了牛的数量被发现感染了地图。然而,福尔马林固定的组织的影响将发生在所有的牛。相对较低的初级测试-牛在这项研究中减少了统计力量,我们不能确认组牛之间的统计学意义。每年的牛结核病尸检指定测试-密歇根的牛结核病很小;因此,扩大那群牛是不可能在当前研究的时间框架。

哪些因素可能会导致大量的假阳性皮肤试验牛?这只回顾性研究评估一个可能分枝杆菌sp.及其出现在一个特定的区域性站点(回肠末端和ileo-cecal淋巴结);接触动物的其他环境分枝杆菌种虫害位于其他解剖网站是一个可能的因素(18]。另一个原因可能是nonmycobacterial感染牛、测试等诺卡氏菌属spp。18]。免疫牛慢性细菌性肠炎或与实验牛分枝杆菌这些疫苗接种BCG vaccines-neither也允许在密歇根或许还导致假皮肤测试结果(18]。最后,这个错误反应堆率可能只是内在皮肤测试使用。当牛人这么远先进沿路根除疾病如在美国的现状特别是在通用和密歇根州,使用筛选试验和非常高的灵敏度可能需要住特异性较低剩不多的感染者我们试图检测(18]。虽然没有争论,希望增加当前的特异性皮肤测试方法来检测牛分枝杆菌在牛、交叉反应与地图似乎没有一个主要限制因素基于本研究测试的工具。

在结论,本研究中使用的方法发现一些牛感染地图,未能找到一个积极的感染之间的联系与地图和假阳性反应领域和/或牛结核病的实验室测试。

确认

作者感谢莎拉·福克斯博士援助与性能的一个子集的PCR检测样品测试。作者还要感谢他们的合作者在密西根州农业部的实地测试和援助的尸体剖检牛包括在这项研究中,美国国家兽医服务人员实验室、动植物Heatlh检验服务,美国农业部对他们的援助在实地测试这些牛和执行牛结核分枝杆菌文化和国家合作研究、教育和推广服务,美国农业部的部分资金支持本研究。