文摘
十二个健康哺乳期默拉水牛相似的平价(3日)在90年和120年之间泌乳,从群中选择国家乳制品研究所(Karnal、印度)和维护管理实践研究所跟随他们包含在这个实验。动物们被分成两组基于先前的泌乳的生产水平。牛奶产量平均水平的组1和2是9.3和6 /天,分别。从这些水牛三次血液收集10天。淋巴细胞分离和培养的RPMI 1640中等PHA-P 24 h在37°C湿润有限公司2孵化器有限公司空气(95%和5%2)。淋巴细胞反应也在应对评估在活的有机体内热应力和在体外皮质醇。Mitogen-induced刺激指数不受生产水平()。刺激指数显著降低()在两组皮质醇增加了2.0 ng在文化水平。然而,在heat-stressed水牛刺激指数没有变化,尽管增加皮质醇的水平,因此表明淋巴细胞可能成为抗皮质醇时期急性热应激。结果表明,淋巴细胞增殖反应可以有效地用于研究水牛细胞介导的免疫反应在体外。
1。介绍
诱导的淋巴细胞增殖反应诱导抗原或有丝分裂原在体外已被证明是细胞免疫能力的代表。这种方法可以作为一个人的能力的指标免疫反应到特定的病原体或免疫调制剂。一系列的在体外在奶牛的研究已经证明暴露牛外周血单核细胞短和严重的热休克减少了响应能力促分裂原或可行的细胞的数量减少1,2]。这些作者建议暴露于高温在体外可以抑制淋巴细胞的反应;明显的诱导的自适应机制在活的有机体内高温热应力提供保护的影响在体外。但到目前为止没有验证进行了研究在体外免疫能力的水牛应对热应力。因此本研究设计评估使用的潜力在体外淋巴细胞增殖试验确定泌乳水牛的细胞免疫能力,以应对在活的有机体内热应力和在体外皮质醇。
2。材料和方法
十二哺乳期默拉水牛,显然是健康和类似的平价(3)之间的90和120天的泌乳从群中选择国家乳制品研究所(Karnal、印度),分为两组根据牛奶产量在先前的哺乳,哺乳平均产量±1 sd。在此基础上,集团I和II的生产平均与9.33和6.0 /天,分别。所有这些buffaloeswere保持在管理实践研究所。广告自由可用的饲料和水。
水牛的组作为淋巴细胞捐献者。血液(15毫升/水牛)是在无菌heparinised真空采血管管从颈静脉穿刺,对动物构成最小扰动在收集、三次10天,早上6.00点。水牛的高产群体也暴露在急性热应激(45°C, 55% RH) 3 h。血液样本采集前曝光和3 h的暴露后从这些热暴露水牛()。收集样品后立即被运送到了冰的实验室进行进一步处理。
血离心机在3000 rpm 30分钟;淡黄色的外套是收获和resuspended 1: 1 v / v杜尔贝科磷酸缓冲盐(DPBS)。总内容仔细分层在淋巴细胞分离介质(Histopaque 1077)的浓度4:1 v / v在无菌15毫升聚丙烯离心管,离心2500 rpm在室温下30分钟。淋巴细胞丰富层被,与DPBS洗两次。内容是离心机在1200 - 1500转了15分钟。每一次与DPBS洗涤。污染红细胞被细胞溶解,加入几滴蒸馏水和DPBS再次清洗。然后洗细胞resuspended RPMI 1640媒体(3 - 4毫升)补充用抗生素和10% FCS和离心机在1200 - 1500转了15分钟。最后洗后,淋巴细胞颗粒在5毫升resuspended丰富的培养基。
台盼蓝排斥法用于确定可行的细胞分离淋巴细胞的比例。
淋巴细胞悬液被调整至5×106住淋巴细胞/毫升文化媒体包含10% FCS (RPMI 1640)。200年μ细胞悬液稀释的L /一式三份是放置在一个96平的细胞培养板触底。本研究中使用的有丝分裂原的植物凝集素(PHA-P) 5的浓度μ克/毫升的最后文化卷(200μL)浓度,确定之前提供最大的刺激牛淋巴细胞(3]。允许细胞增殖有或没有分裂素(PHA-P)来确定那时细胞之间的区别。皮质醇,溶解在文化媒体测试浓度0,0.5,2,10 ng / mL。允许所有文化孕育在37°C湿润有限公司2孵化器有限公司空气(95%和5%2为24小时)。淋巴细胞的增殖反应估计使用比色MTT(四唑)根据Mosmann给出的程序(4]。淋巴细胞blastogenic反应表示为刺激指数(SI)和计算如下。 OD光密度在503 nm,参照630海里。所有分析都是使用Windstat 8.0软件包完成。来自不同实验的数据意味着±SE。方差分析的数据是使用RBD的阶乘设计看到牛奶产量的影响和不同水平的皮质醇在淋巴细胞胚芽生殖。回应都是关于如果相比细胞对不同实验涉及分裂素和皮质醇。交互作用包括动物×组,组×治疗,动物××治疗组也被计算。看到的效果在活的有机体内热应力和在体外皮质醇治疗淋巴细胞胚芽生殖热应力的影响,皮质醇的影响和交互效应(×治疗组)计算。
3所示。结果
水牛Mitogen-induced刺激指数表现出不同程度的牛奶产量已经呈现在图1。Mitogen-induced淋巴细胞胚芽生殖显著()在两组不同的在不同的水牛。两组之间没有显著差异。观察到的变化独立于这些水牛的牛奶产量潜力。
Mitogen-induced刺激指数在不同群体的不同水平的皮质醇水牛已经呈现在图2。刺激指数在我组明显不同(皮质醇之间)的治疗方法。的交互作用组×治疗()也是重要的。刺激指数第二组倾向于治疗之间的显著差异()。交互效应如前所述也显著(这一组。但是,当两组比较对blastogenic反应,发现差别不明显。这表明,两组的动物并不相同,不同水平的皮质醇反应。而皮质醇水平的0.5 ng / mL并不影响淋巴细胞胚芽生殖,这显著降低胚芽生殖2 ng / mL的组。由于动物的变化,反应在不同水平的皮质醇补充没有发现是线性的。
水牛的blastogenic响应进一步测试组我为了应对实施在活的有机体内急性热应激和在体外皮质醇(图3)。有显著的()减少淋巴细胞blastigenic反应后曝光的热应力。刺激指数前暴露治疗之间明显不同()。在接触前淋巴细胞胚芽生殖降低显著(ng) 2水平的皮质醇和保持不变的皮质醇水平的增加。急性热应激的暴露后淋巴细胞胚芽生殖跟着曝光之前类似的趋势,因此,它表明,在接触热应力抗淋巴细胞会停止响应或皮质醇,因此不应对exogneous皮质醇(图4)。
4所示。讨论
淋巴细胞刺激被广泛用于测量(i),刺激淋巴细胞免疫能力phytomitogens [5,6(2)由混合白细胞histocompatbility文化[7)和(3)接触传染性病原体通过与特定抗原的刺激淋巴细胞(8]。齐默尔曼et al。9)相关的有丝分裂原刺激淋巴细胞胚芽生殖在羊寄生虫引起的宿主免疫抑制。在这个调查,细胞介导免疫评估通过测量mitogen-stimulated淋巴细胞增殖的水牛在不同实验。响应不存在与这些水牛的牛奶产量潜力。这是意识到从淋巴细胞胚芽生殖率相似的水牛有潜在的6.0和9.33 /天。胚芽生殖率的变化从原来的动物,动物也被报道为远系牛的数量和哺乳期母牛(10]。这些变化也有报告称,受季节和牛的年龄3]。
糖皮质激素抑制各种淋巴细胞的功能。在过去的几年里,大量的研究表明,糖皮质激素抑制淋巴细胞功能在体外当在药理水平(11- - - - - -15]。·席格et al。16)发现抑制人类淋巴细胞胚芽生殖只有当次优PHA的皮质醇水平。陈纳德,(17]表明,皮质醇浓度增加抑制Con-A-induced胚芽生殖,这样从10到104纳米小反应可以以荷斯坦牛,但并不影响胚芽生殖PHA-P时使用的一个。在目前的研究中,皮质醇水平的0.5 ng / mL,然而,并不影响PHA-P诱导淋巴细胞胚芽生殖;它显著降低2 ng / mL的胚芽生殖群体的水牛。
Mitogen-induced淋巴细胞胚芽生殖在暴露在急性热应激显著降低了调查。一系列的在体外研究已经证明,暴露的牛外周血单核细胞短和严重热休克反应降低到有丝分裂原或减少可行的细胞的数量(1,2]。nicola Lacetera et al。18)报道,不同的孵化温度模拟高热受损的DNA合成mitogen-stimulated PBMC在体外。研究在活的有机体内提供了相互矛盾的结果对于上层空气温度高于临界温度的影响在牛免疫细胞的功能。一些作者报道有所改善(3)一些描述损伤(1,2)和其他人表示没有影响(19热暴露对淋巴细胞的功能。各种各样的实验条件(例如,在活的有机体内与在体外、字段和控制环境,动物不同品种或不同年龄、持续时间和强度的热接触,淋巴细胞功能研究)可能解释结果之间的差异。热增生性反应的微分效应mitogen-stimulated PBMC从瑞士褐牛和荷斯坦奶牛。nicola Lacetera et al。18]进一步表明,体温增加热应力条件下可能不会与相同程度的变更的相关免疫细胞的效率两个品种。泛化的概念表明,损伤的细胞功能可以在不同级别的身体开始高热也在该研究中发现不同的动物。此外,长时间暴露于严重的热应力[18)负责减少免疫细胞的活性,这可能导致更高的一些感染发生在夏季(20.]。
5。结论
目前调查的主要结果允许我们得出这样的结论:淋巴细胞增殖试验可以作为一个默拉水牛的措施来确定细胞介导免疫在体外。动物之间的刺激指数显著不同,但不影响生产水平。刺激指数的影响在体外皮质醇。胚芽生殖是显著减少2.0 ng水平。Mitogen-induced淋巴细胞增殖反应显著降低水牛暴露在热应力。然而,皮质醇在不同添加水平在体外产生淋巴细胞增殖反应因此没有进一步的变化,表明在接触热应力淋巴细胞可能成为抗皮质醇。