文摘

为了实现seroprevalence差距鸟型分支杆菌无性系种群。副结核感染绵羊的奶牛场马尔凯地区(意大利中部),进行了分层研究在2086成年女性羊随机选择来自38个Macerata牛群在安科纳,选择省份。羊群造成感染73.7%商业ELISA试验(Pourquier、法国),平均seroprevalence采样羊在两省的6.29%。更多的地图血清反应阳性的母羊被记录在大群比中小群一致性的一致性(),获得了更大比例的受感染的羊在女性中比在峰值哺乳阶段(早/晚)。地图由粪便感染证实12.6%的受感染的农场文化。真正的sheep-level seroprevalence为15.1%±7.3%。

1。介绍

副结核,称为慢性细菌性肠炎(JD),是一个普遍和经济上重要的慢性、nontreatable炎性肠道疾病的家畜和野生反刍动物以及全球其他哺乳动物,包括灵长类(1- - - - - -4]。在“多个物种疾病”的列表应报告向世界动物卫生组织作为反刍动物疾病的关注(5]。以来的绵羊的副结核是一个对象的担心阴险的进化和疾病的严重程度总是伴随着太晚了临床诊断。它代表了卫生和畜牧学的显著比例的问题由于其发病率,缺乏一个有效的治疗和预防策略,以及临床和亚临床疾病造成的经济损失2,6,7]。

鸟型分支杆菌亚种副结核(地图),也被认为是克罗恩病的病原学的代理,人类肠道的慢性肉芽肿性感染(8- - - - - -10]。细菌隔绝了很高比例的克罗恩病的患者11- - - - - -13]虽然人畜共患潜在的生物仍存在争议8,14]。最近,它的参与是假设人类I型糖尿病的发作(15,16]。人们接触到地图通过直接接触被感染的材料和零售牛奶供应(17]。反刍动物奶被描述为一个潜在来源,人类可能被感染18,19]。可行的地图已经从牛奶和孤立的临床和亚临床感染的牛初乳(20.),乳腺感染已经被记载在小反刍动物(21]。地图已经证明了PCR的山羊奶大部分坦克在农场在英国22),细菌可以存活巴氏灭菌法,和奶酪生产过程已被证明没有效果的可行性地图(18,23]。此外,可行的细菌已被证明在困难和半硬质奶酪生产后120天(24]。

亚临床感染的诊断地图在反刍动物物种仍然JD控制的最大挑战之一,在个体动物(4,25和群体水平26]。

高棚友地图和动物的临床体征副结核负责大部分的污染环境,被感染的牛群的经济损失,和牛奶中细菌的存在27]。监控控制项目的进展,牛群需要测试。血清学是最实用的方法用于这一目的。酶联免疫吸附试验(ELISA)是一个合适的诊断工具来检测血清抗体地图大规模的,因为它是可以测试大量的样品高重现性(25,28]。一般来说,商用ELISA-kits副结核有低灵敏度(29日- - - - - -31日]。然而,化验有一个合理的良好的灵敏度来确定扑杀重棚友处于临床前阶段(32,33),减少受感染的牛群感染的压力,从而提高疗效的预防措施34,35]。控制程序已建立慢性细菌性肠炎在许多国家。在意大利,强制性的计划没有执行在绵羊的人口与其他国家。当前的知识群,sheep-level今天流行是有价值的,但更重要的是作为基准的评估控制程序可以发生。

高地Macerata和安科纳马尔凯地区(意大利中部)相当多的乳制品绵羊的数量产生大量的牛奶,奶酪每年生产和羔羊肉。这个地区的农民已经表明焦虑增加了解地图流行的牛群尤其是那些参与使用未消毒绵羊的牛奶和奶酪生产的农民观察一个意想不到的羊群的牛奶产量下降。很少是流行病学的绵羊的副结核在意大利中部,和地图阳性率下降马尔凯地区是未知的。

本研究的目的如下:(1)评估个体,herd-level seroprevalence地图在绵羊的乳制品Macerata安科纳群和省马尔凯地区,意大利和(2)观察流行病学因素和检查他们的协会地图seroprevalence成年绵羊的牛群在意大利中部的两个省。

2。材料和方法

2.1。研究设计

分层研究设计在意大利中部的马尔凯地区。的流行病学单位关心的是群。

2.2。目标人群和样本量

在研究的开始,2008年7月,在安科纳绵羊的群体一致性和Macerata省份在意大利注册Anagrafe重回Zootecnica档案(36)(http://statistiche.izs.it/Zootecniche/据报道在表1。

使用下列公式计算样本群大小:(37),=无限总体样本容量;预计感染患病率(作为一个十进制:0.04 (4%));=置信度(95%的信心);=最大区别观察和真正的流行,我们愿意接受(作为一个十进制:0.10 (10%))。然后,估计所需的样本量()为一个有限的人口(),转换完成后:。随机抽样的绵羊的牛群进行使用随机数发生器和考虑到群体进步数量列表。

2.3。研究人群

在这项研究中使用的数据来自2086年乳制品和混合,牛奶和肉,解决生产羊随机选择和饲养38农场代表群人口的两个省的马尔凯地区:十八牛群在安科纳省和二十牛群Macerata省。

进行了分层随机抽样。人口分为子组根据地理区域(省),群体一致性,品种,羊目的、泌乳阶段,临床症状。一个随机样本来自这些地层。

绵羊的品种饲养是:“Comisana”、“Fabrianese”,“马萨斯”,“Sarda”,“Sopravvissana”,和十字架。大部分的牛群是牛奶产量,而mixed-purpose羊主要在其他群落。

农场由小(≤500只羊),中等(500 <羊≥1000),和大型(≥1000只羊)大小一致性和都是半精耕细作的牛群。系统抽样是采取血清样本用于这项研究。群抽样代表了10%的一致性。从单独收集血清样本确定女羊年龄超过两岁。

2.4。调查设计

农民们招募了研究2008年9月至2010年7月。争取38乳制品羊农场,四十八所有者通过电话联系但十不同意参与采访问卷和农场访问收集血液样本。流行病学形式是基于三个主要议题:动物/群管理和设施、健康状况和卫生措施在羊群和引入新的动物粪便排泄的手续。在研究过程中每一个农场有一个访问。血清反应阳性的母羊发现时,他们提交给一个粪便取样的第二次访问。

3所示。实验室工作

3.1。抽样

在一年一度的官方布鲁氏菌病根除运动,2008年9月至2010年7月,血液样本收集从2086年随机选择育种母羊在哺乳期,年龄在38个两年,饲养农场有或没有副结核的历史。在农场参观,10%的动物受到颈静脉穿刺使用无菌anticoagulant-free真空采血管管。所有样本被送往传染病实验室的大学的兽医医学科学franco rollo曾经研究学校,离心后,血清收获和储存在−20°C到实验室分析。收集的粪便样本血清反应阳性的羊在所有积极的群细菌培养和Ziehl Neelsen染色。腹泻和浪费在一些羊在取样观察。

3.2。血清学调查

所有血液样本被商业分析间接ELISA遵循制造商的指示(ELISA副结核设备;Pourquier研究所、法国)。这个测试增加了preabsorption的特异性分枝杆菌phlei抗原(38]。完成了一个自动洗衣机清洗步骤。Double-positive和单一的负面控制样本包含在所有ELISA的系列;除了正面和负面的控制制造商所提供的样品,两个内部控制血清样本在每个板上运行。截止由制造商定义的是样本阳性比大于或等于0.350和之间的比例意味着积极控制OD和消极控制OD大于或等于3。简单,控制和血清样本稀释1:20和preincubatedm . phlei提取的协助绑定未指明的抗体。洗后,稀释antiruminant辣根过氧化物酶是分发/为了检测的抗体的存在。然后Tetramethylbenzidine(三甲)酶底物使用。反应停在1 m盐酸溶液,与光密度测量在450 nm ()使用Multiskan提升ELISA读者(Labsystem、芬兰)。所有样本测试单一和光学密度读数在450 nm用于分析。制造商建议的70%作为正样本的截止。60 - 70%的范围内的血清列为可疑,而样本低于60%被认为是负面的。生成的正/负二进制结果用于本研究中所有统计分析。可疑样本归类为负,并不包括在结果的统计分析。

为了评估真正的患病率,Rogan-Gladen [39]估计量用于转换明显流行价值观,P = True患病率,美联社=明显的患病率,SP =测试特异性和SE =测试灵敏度。估计以前Pourquier ELISA的表演在绵羊的血清的敏感性为34.9%,特异性98.8%被认为是40]。

3.3。细菌学(显微镜和文化)

Ziehl-Neelsen(锌)染色涂片的粪便显微镜下检查和诊断副结核是当小团强烈抗酸的细菌被发现。

进行文化个体粪便样本,一个标准化的基本方法是用作OIE陆地手册中描述(5与一些修改)。

简单地说,2 g整除与35毫升无菌蒸馏水混合,动摇了30分钟。大的碎片被允许在室温下45分钟。水层被除去,离心20分钟的2500克。由此产生的颗粒通过净化处理过程(41]。首先,小球在0.9%氯化hexadecylpyridinium (resuspended HPC;Sigma-Aldrich,意大利)一半的力量(0.5×)脑心浸液肉汤(BHI;正欲),孵化一夜之间在37°C,然后在2500转离心20分钟形成颗粒。颗粒resuspended在1.2毫升0.5×BHI含有萘啶酸(100g / mL),万古霉素(100g / mL)、两性霉素B (50g / mL) (Sigma-Aldrich、意大利)和孵化一夜之间在37°C。Herrold的蛋黄中含有抗生素(HEYM)琼脂斜面接种0.2毫升的净化培养液。所有文化都在37°C长达20周,孵化与周期性的视觉评估。的识别地图殖民地是基于文化、微观和增长依赖mycobactin J。典型的细菌形态学证实了ZN-staining PCR (900年)[42]。

4所示。结果变量和统计分析

一群被定义为血清反应阳性的,当一个或更多的绵羊群被血清ELISA检测血清反应阳性的测试。的群seroprevalence地图计算从血清反应阳性的羊的数量除以总数量的羊在访问测试。群平均群seroprevalence之上和之下的一分为二。调查问卷的数据,血清学分析、锌染色、粪便文化,和分子的调查被存储在一个数据库和分析使用统计软件(占据版本5;占据公司,大学城,德克萨斯州,美国)。血清学结果被省相比,群体大小、品种和生产,泌乳阶段,临床症状。

描述性统计计算确定明显地图患病率在动物和群体水平。在95%的置信区间的集群计算样本Thrusfield[概述43]。ELISA结果的统计差异被x平方分布检验评估。值小于0.05被认为是重要的。

5。结果

血清学调查进行总数的2.24%绵羊饲养两个省的马尔凯地区。38个随机选择的农场517奶制品和混合羊农场代表总数的7.35%绵羊的农场领域的研究:7.14%和7.27% Macerata安科纳和省份,分别进行评估。总共有2086动物超过2年的年龄从38个绵羊的羊群血清学筛查分析取样。均值和中位数群大小是549年和400年的动物,分别从110年到1500年的动物。描述性统计研究的人口在两个省在桌子上2。

群羊水平和描述性统计地图seroprevalence乳制品和混合群展示在表3。

地图抗体检测在28个农场(CI等于73.7%_95年59.0 - -88.3,)总群的评估。特别是,11群(28.9%)有一个血清反应阳性的羊,剩下的17个群(44.7%)(图2个或更多的血清反应阳性的动物1)。

总共129血清反应阳性的羊被发现在两个省的一个明显的患病率(CI值6.29%_95年5.23 - -7.34;)。

在分析地图seroprevalence herd-level的省、一致性、群类型,和临床症状,显著差异之间的观察:乳制品(88.2%;CI_95年71.2 - -105.3,)和混合生产牲畜(33.3%;CI_95年110.1 - -176.5,:,(图)Macerata省2),早/晚(90.0%;CI_95年67.4 - -112.6)和峰值哺乳牛群(37.5%;CI_95年5.8 - -80.8:,)之间在安科纳省和明显的疾病血清反应阴性的血清反应阳性的群()。与品种群阳性率下降图所示3。

9与小12群一致性被发现阳性地图(75.0%;CI_95年在两省46.3 - -103.7),而不同的seroprevalence值记录介质牛群:80% (CI_95年24.5 - -135.5,Macerata)和0% (CI_95年1.0 - -1.0,;,在安科纳领土。抗体反应的频率地图不同感染绵羊的农场一致性,品种和省列于表4。

一个高度显著差异揭示了比较血清阳性的地图感染的大群和小群(,)(图4)。

Macerata省群阳性率下降在峰值更高(88.9%;CI_95年63.3 - -114.5,)比在早期和/或哺乳期结束时(72.7%;CI_95年41.3 - -104.1,;,)。相似的价值观被观察到在安科纳的绵羊的农场9 10 (90.0%;CI_95年67.4 - -112.6)导致积极的哺乳时间的早/晚,而3 8 (37.5%;CI_95年在高峰哺乳−5.8 - -80.8)。这种差别十分明显(,)。

当临床症状被认为,群体seroprevalence显著差异被发现。Macerata省只在血清反应阳性的临床症状观察农场(),而11种血清反应阳性的成群的安科纳领土(91.7%;CI_95年73.3 - -110.0)饲养羊至少一个显示腹泻和/或减肥(,)。

与采样的周期,增加积极的牛群的注意到在春天和秋天,但差异不显著()(图5)。此外,通过考虑今年两个时期,68.2%的农场抽样春夏装血清反应阳性的结果与81.2%的血清反应阳性的牛群在秋季和冬季测试(,)。

抽样分布均匀的季节性被曝与省和群体大小(表5)。Comisana品种是最代表的四个季节采样。

考虑到完全检查动物(),129血清反应阳性的羊被发现,等于一个总体sheep-level seroprevalence 6.29% (CI_95年5.23 - -7.34)调查的省份。在羊层面,记录之间的显著差异地图seropositives Macerata (7.51%;CI_95年5.93 - -9.08,)和安科纳省(4.93%;CI_95年3.57 - -6.30,;,)、混合(1.82%;CI_95年0.04 - -3.60;)和奶制品羊(6.82%;CI_95年5.67 - -7.98,;,);在早/晚泌乳羊(5.16%;CI_95年3.86 - -6.47;),和那些在高峰泌乳(7.59%;CI_95年5.90 - -9.28,;,)、小(4.33%;CI_95年2.88 - -5.77;)和中型或大型农场一致性(,)。

地图感染确诊11(12.6%可信区间_95年3.9 - -21.7;)和13(14.9%可信区间_95年4.6 - -25.2;)粪便标本细菌学的文化和Ziehl Neelsen染色,分别。23羊没有检测到的第二次访问,因为销售或死亡,其余19细菌学的文化造成了污染。地图IS900基因组PCR证实了对殖民地获得执行的每个粪便细菌阳性样本。

真正的流行地图感染绵羊和群体水平在两个省估计为15.1%±7.3%。(95%可信限);在安科纳省Macerata 18.7%和11.1% [39,40]。

6。讨论

血清学调查被认为是有效的工具建立的患病率地图一群感染,筛选并确认副结核的诊断在动物存在兼容的临床症状44]。一个全面的了解地图在绵羊的患病率、发病率和流行病学模式群是有形价值促进预防的设计,控制项目旨在减少或最好是消除地图从农场。在这种情况下,测试的选择是至关重要的控制规划等的设计。测试选择当前的研究是相对快速和容易执行与培养方法是费力而需要一个分裂到8 - 16个星期的潜伏期或更多。此外,血清学分析将提供疾病的诊断和预后。在这项研究中,一个整体sheep-level和herd-level seroprevalence调查获得6.29%和73.6%的领土。

明显的患病率在绵羊的乳制品羊群采样在这项研究中(6.29%)支持先前的报道进行研究在牛6,45)即seroprevalence地图观察动物随着年龄的增加,相对于群体的大小。环境因素和密度制约的影响可以帮助地图猖獗的传播。

在这项研究中,群体大小与血清反应阳性的群状态密切相关。在大群更高比例的羊比那些/ 2岁小群饲养。因此更有可能样品和测试积极母羊由于更高的成人产生抗体或因为群大小或管理的效果。在牛群的变化地图seroprevalence,观察在不同的群一致性在这项研究中,可能归因于宿主抗体生产的可变性和蛋白质肠病在回应地图感染。

可能在群动态的传播地图可以通过连续发生新的吗地图感染羊羔和高seroprevalence最终污染环境或从大坝传染给羊羔羊肉和羊肉。高seroprevalence羊群可以作为永久的水库地图可能感染其他羊群通过运动和广泛的放牧。

seroprevalence观察到在这个研究是不同的,在羊意大利翁布里亚地区和特拉帕尼省人口真正和明显seroprevalences (4.8%46)和3.4% (47),分别。在澳大利亚,患病率估计在2.4% - -4.4%的范围48),而在希腊北部,群体普遍存在的地图感染绵羊群估计为21.1% (49]。Seroprevalence研究地图感染山羊奶制品的羊群在法国透露一个明显和估计真正的患病率在群体水平的55.2%和62.9%,而在个体动物水平分别为2.9%和6.6%,分别为(50]。然而,在我们的研究中获得远低于高seroprevalence观察到的主要是一群群的绵羊和山羊在西班牙马德里地区,一个明显的患病率为11.7%,估计真患病率44%是观察到的51]。

的seroprevalence地图感染被指出在Macerata高于安科纳省羊和牛的水平,和很重要的区别。群管理实践和动物介绍检查可以观察到的差异的最可能的原因。畜牧业练习好,清洁的农场,肥料处理,小羊羔保健和限制接触羊羔和成熟的动物中观察到更多的农场在安科纳省Macerata比省农场的访问(52- - - - - -54]。此外,一个更高比例的羊采样在安科纳省在这项研究在哺乳的早期或晚期阶段,而多数的羊采样Macerata省处于哺乳期的高峰阶段。因此,考虑的假设假设降低血清中免疫球蛋白浓度和增加免疫球蛋白浓度相比,牛奶在早期或晚期哺乳与峰值哺乳(55),哺乳阶段的差异可能是另一个可能的原因地图在两个省seroprevalence观察。内部进行比较研究牛奶和血清样本提出实质性协议血清和牛奶ELISA结果(kappa值= 0.67),在早期和晚期(高)比峰值(与免疫球蛋白G)泌乳,在协议(免疫球蛋白)在开始和结束时的牛奶哺乳(未公开的数据)。

我们提倡严格的生物安全措施在适当的控制感染的农场。同时,应该创建足够的住房空间的大型农场一致性防止动物传动物亲密和降低密度制约的影响通常导致传染性疾病的传播。我们也强烈推荐的实现两者的结合畜牧业和test-and-cull方法变化地图亚临床感染绵羊的羊群没有明显的疾病控制策略消除病原体的绵羊的农场,防止疾病蔓延到其他农场。在地图来华的农场有明显的疾病,疫苗接种是主张将阻止更多的临床情况下,改善动物的健康状况表现出临床症状,大大减少细菌脱落,从而控制污染风险,最后可能导致增加生产高利润的这种比率。

7所示。结论

这是第一次大规模的研究地图阳性率下降马尔凯地区的绵羊的人口在意大利中部尽管到目前为止只有两个省份进行了研究。血清学调查被认为是有效的工具建立的患病率地图一群感染,作为一个有用的技术,动物群体所有者可以使管理决策(32),和在动物身上证实副结核的诊断存在兼容的临床症状(56,57]。目前的研究可能是有用的作为一个确认发现确定风土性的JD在马尔凯地区绵羊的奶牛种群。省调查和畜牧学的农村历史农场采样地区分布均匀。在几乎所有的牛群,原料奶生产奶酪用于消费者在自己的实验室接近农场。

结果显著尤其是考虑到辩论的可能性地图扮演一个角色在克罗恩病的病因学8,14和人类的I型糖尿病15,16]。摄入受污染的绵羊的牛奶和奶酪制造从原始绵羊的牛奶可能导致传播地图给人类。此外,意大利规范性(联合商业银行Stato Regioni 25/1/2007),定义了标准的可接受性的原料奶直接卖给消费者,塑造了分析参数最重要的细菌性食源性疾病的代理人,但这些不包括病原体地图。因此预防性的方法从公共卫生当局应保证,还需要进一步的调查来评估潜在风险对消费者的健康。

一个全面的了解地图在绵羊的患病率、发病率和流行病学模式群是有形价值促进预防和控制方案的设计旨在减少或多个最好是消除地图从农场在马尔凯地区。

当前的知识群sheep-level患病率是今天的价值,和预计这些信息将有助于优化和直接在该地区未来的研究和控制程序,此外,将集成到任何国家控制运动。

Macerata安科纳的集群分布绵羊的副结核和意大利中部的省份可以管理和消除从羊羊与严格的管理加上频繁的测试和扑杀,或通过粪口传播的疫苗结合管理。测试的频率和级别的管理干预应该由每个农场的能力,优先级和财政。此外,应该通过适当的政府机构和绵羊育种协会承认的羊群没有被感染的感染或在低风险的历史使用标准化的国家认证的指导方针。测试-农场将作为重要来源获得羊建立低风险的羊群。

此外,生物安全措施的重要性应该强调避免一群感染通过购买一只羊。飞行员自愿控制程序开发奶牛农场旨在逐渐减少疾病的患病率参与群。在绵羊的人口,程序可以先评估、风险评估与管理策略的实现,然后为了防止感染的传播,通过测试动物在分娩前。基于似然比的方法,农场应分类在不同的类别。羊肉喂初乳和牛奶应该允许只从负面母羊:分娩后的怀疑和弱负羊测试分子技术。血清是最可靠,最适合作为最快,最简单的方法筛查检测的绵羊的羊群地图感染,但进一步的研究是必要的,以确定如果ELISA对个人和散装箱绵羊的牛奶样品可以创造机会更便宜、更可行的测试方案在绵羊的慢性细菌性肠炎诊断。