文摘
本研究的目标是适应商业人类蛋白C (PC)比色测定用于狗和调查各种贮藏条件的影响。人类试验修改通过使用混合的犬血浆校准和通过增加激活时间了。电脑活动测量新鲜犬血浆和等离子体在不同条件下储存。电脑活动的一些存储样本明显不同于新鲜血浆;然而,差异较小。中检测出样本存储在类似条件下没有区别,但在不同的实验室使用类似的方法进行了分析。本研究的结果表明,人类比色测定适用于犬类样本如果混合的犬血浆用于校准,临床和实验室标准协会样本存储指南开发测试人类对狗狗来说是合适的,而比较的结果从实验室使用类似的方法是合法的。
1。介绍
蛋白C是一种维生素K-dependent糖蛋白,主要是在肝脏合成(1]。它循环血浆丝氨酸蛋白酶的发酵菌和激活thrombin-thrombomodulin复杂(2]。活化蛋白C产生灭活凝血因子Va和VIIIa抗血栓形成的作用;此外,据报道pro-fibrinolytic,抗炎,抗凋亡属性(2]。许多条件是公认的导致减少蛋白质C活动的人,包括肝脏疾病、败血症和炎症(2,3]。狗,蛋白C活性却降低了各种肝胆的疾病,特别是肝衰竭和先天性门体静脉的分流术,和被用来区分先天性门体静脉的分流术从微血管发育不良继发于门户发育不全(4- - - - - -6]。蛋白C活性也降低与脓毒症的狗,充血性心力衰竭,自然获得食源性黄曲霉毒素中毒(7- - - - - -10]。
canine-specific蛋白C测定不是商用;因此,蛋白质C活动测量狗与人类化验,采用比色或凝血的原则。几个报告引用的使用混合的犬血浆测定校准,而不是一个商业人类标准;这些研究已经使用各种仪器和实验试剂的组合表现,包括clotting-based和比色(显色substrate-based)化验4,6,8,9,11]。其他报道的变化方法包括不同活化时间、抗凝剂的浓度,为分离和离心设置等离子体(8,11,12]。然而,详细描述测试方法测量蛋白C浓度狗稀缺。最详细的解释修改人类试验的狗(11)描述clotting-based试验(11]。然而,大多数的研究蛋白质C活动狗报告使用比色测定。适应人类比色商用蛋白质C测定(STA-Stachrom蛋白质C比色测定,Diagnostica Stago,河曲法国)用于狗用狗血浆校准,一个至关重要的步骤是等离子体的稀释100%作为标准规定这些信息不是,据我们所知,任何地方的兽医文学。准确,完整描述如何适应这个试验用于狗会对任何的兽医实验室感兴趣添加蛋白质C测定的测试产品。
因为目前一些兽医实验室提供蛋白质C化验,大多数兽医必须船样品为了获得结果。根据临床和实验室标准协会(CLSI)指南13)开发出的实验室检测,样品测量的人工蛋白质C活动是稳定的(变异<±10%)为24个月冻结在−24°C (74°C或−13]。然而,相对较少的已发表在犬的稳定性在不同时间和温度条件下蛋白质C。一项研究[11)发现样品稳定至少1年−80°C,但样本量太小(),没有详细的数据报告11]。另一项研究[14)没有发现显著差异在结果使用等离子体冻结在−41°C 12到24天,获得使用存储在类似条件下等离子体,但经历了一个额外的冻融循环;这项研究不包括新鲜(解冻)等离子体控制集团(14]。
本研究的目标是适应人类蛋白质C商业比色测定用于狗,然后确定各种存储条件对结果的影响。我们的假设是,不同储存条件下将会对结果产生重大影响。次要目标是比较结果从我们实验室与实验室在另一个国家,并建立初步的犬类蛋白质C我们实验室的引用值。
2。材料和方法
2.1。动物
该项目涉及使用28临床正常成年狗由教员,职员或学生。所有生活动物工作事先批准由一个机构的动物保健和使用委员会(田纳西大学、协议# 1498)。汇集血浆使用样本15只狗(年龄中位数= 7年;9混合品种,6不同的纯品种;9个女生,6阉割男性)。实验阶段1和2是通过使用样本来自13个不同年龄的狗(第一阶段,范围= 3 - 9年,中位数= 8年;第二阶段,范围= 3 - 9年,中值= 6.5年),品种,和性;样本2狗都包含在这两个阶段。
2.2。蛋白质C测定
样品进行了分析使用一个自动化的仪器(STA紧凑),和商用试剂(STA-Stachrom蛋白质C比色测定,STA-Owren-Koller缓冲区,STA-System控制)来自同一制造商(Diagnostica Stago,河曲法国)。试验包括两步反应的试剂(纯化蕲蛇c contortrix毒液)激活蛋白C,另一个试剂是激活酶的显色底物,而由此产生的颜色强度测量spectrophotometrically作为光密度(OD)。
标准曲线建立了使用商业载人标准(STA-Unicalibrator, Diagnostica Stago, Asniers,法国)根据制造商的指示,或混合的犬血浆如下所述。在常规化验过程中,110%的人类标准校准器是稀释的1/3,和所有测试样本自动稀释1/3(个人通信,Diagnostica Stago技术支持);犬类的另一个兽医实验室使用相同的试验样品使用1/3稀释混合的犬血浆的100%标准,和一个激活时间10分钟而不是默认的5分钟(个人沟通,康奈尔大学动物健康诊断中心)。根据这些信息,和我们自己的经验使用人类标准校准器,我们建立了一个canine-specific标准曲线使用混合的犬血浆稀释后,和一个10分钟的激活时间(稀释=蛋白质C活动):1/3 = 100%,1/4 = 75%,1/6 = 50%,1/10 = 30%,1/20 = 15%,纯缓冲= 0%。评估精度,两个单独的曲线生成直接继承同日,都在重复运行。使用这些曲线的第二,血浆样本随机选择从一个正常的狗和6整除测量作为一个单一的运行来确定intra-assay精度。一个新的canine-specific曲线生成一周后(曲线2)是用于所有后续分析。
2.3。样品采集和处理
2.3.1。混合等离子体
收集血液样本(6毫升)从15狗颈静脉穿刺到3.2%柠檬酸钠抗凝(BD真空采血管,正欲、迪金森和有限公司,富兰克林湖NJ)。样本离心机为120年代两次13700 g (StatSpin StatSpin, Inc .,诺伍德MA),然后在30分钟内等离子体是收获的收集,放置在2毫升螺旋帽管(Sarstedt,牛顿数控),冻结在−80°C在60分钟的收获,并保持冷冻12至28 d。样品在室温下解冻,让管站,偶尔打开手掌之间。汇集血浆成立于250年μL整除总值的等离子体自由脂血、溶血;任何剩余的等离子体在−refrozen 80°C。
阶段1。从9狗收集血液样本,进行集中描述等离子体等离子体。每个血浆样品分析在60分钟,其余立即被冻结在−80°C。4天后()或7天(),样本解冻,分为5整除(0.5毫升/整除)。整除的立即进行了分析,在不同条件下和其他人都被立即refrozen以后测试(表1(a))。
阶段2。从6狗血液样本收集,如上所述等离子体。每个等离子体样本分为5整除(0.5毫升/整除)。立即分析了整除之一,后来的人立即冻结在不同条件下测试(表1(b))。
2.4。统计分析
蛋白质C测定的精度是由计算变异系数(CV,定义为标准偏差/的意思)。结果使用不同类型的样本(新鲜诉不同储存条件)比较使用商业软件(SAS 9.2版SAS系统的窗口,卡里,NC)。分析包括:皮尔森的相关性,学生的t以及成对比较,重复测量方差分析Shapiro-Wilk测试正常的残差和列文的野生方差相等。一个P值<。05年被认为是显著的。没有差异的零假设控制样品和治疗,为多个Bonferroni调整来调整t测试(第一阶段比较,α/n= 0.05/5 = 0.01;阶段2的比较,α/n= 0.05 / 4 = 0.0125)。没有差异的零假设治疗,图基因果法调整的多重比较。初步的犬类蛋白质C参考我们实验室是基于最小值和最大值控制样本数据集相结合的阶段1和阶段2。
3所示。结果与讨论
3.1。蛋白质C测定
基于4数据分稀释(2标准曲线,运行一式两份),CVs的OD测量< 5%(低简历= 2.0%,高CV = 4.8%)为每个稀释除了纯粹的缓冲区;纯粹的缓冲区,3读数是0.000和1是0.001。基于6个独立的测量相同的样本作为单个试验运行的一部分,简历是1.4%。标准曲线生成非常相似(表1周分开2);的仪器输出第二曲线如图1。蛋白C活性值使用商业载人标准都低得多,而不是混合的犬血浆校准试验(数据没有显示)。
阶段1。第一阶段结果总结在表3(一)。
相关性比较新鲜的样品与样品存储范围从5个不同的条件下来。相关性的比较与其他储存条件范围从一个存储条件来。
样品存储4 - 7 d−80°C,然后解冻refrozen−80°C的一个额外的4 d或7 d,蛋白C活性明显高于控制样本。样品冷冻4 - 7 d−80°C,然后解冻refrozen−20°C的额外的2 d和内部衡量,蛋白C活性高于控制样本;这种差异略大()。
没有显著性差异的结果由两个不同的实验室使用样本存储在相同条件下(4 - 7 d−80°C,然后解冻和refrozen−20°一个额外的2 d C)。样本存储在−4到7 d 80°C,然后解冻refrozen−20°C的额外的2 d和实验室测量的另一个状态,蛋白C活性明显低于样本存储在−4到7 d 80°C,然后解冻refrozen−80°C的一个额外的4 d。样本存储在−4到7 d 80°C蛋白C活性低于样本存储在−4到7 d 80°C,然后解冻refrozen−80°C的一个额外的4 d;这种差异略大()。
阶段2。阶段总结在表2的结果3(b)。
相关性是高()所有比较新鲜的样品与样品存储在各种条件下,所有比较的一个存储条件和其他存储条件。
样品存储7 d−20°C蛋白C活性明显高了,和样品存储28 d在温度(20°C或−−80°C)蛋白C活性明显降低,比控制样本。
样品存储7 d蛋白C活性明显高于样本存储28 d,无论存储温度。
3.2。初步的参考价值
基于联合控制样本数据集的阶段1和阶段2,蛋白C的最大和最小值活动分别为80%和115%,分别。我们使用这些作为初步上下参考范围,分别在我们的实验室。
3.3。讨论
这项研究是出于我们的欲望来衡量犬类蛋白质C活动在我们的实验室,并学习更多关于不同贮藏条件对测试结果的影响。研究的局限性包括相对比较小的样本大小和分裂成两个实验阶段储存的影响进行调查。尽管有这些限制,我们希望这个报告有用建立犬蛋白质C分析感兴趣的人在自己的实验室或寻求更多信息的影响不同的储存条件(包括船样到另一个机构进行分析)。
在我们的实验室中,人类试验标准校准结果不可接受的低(表2),类似于他人所报道的(11]。这种现象可能会发生,因为蛋白质C-activating试剂,高纯度提取的毒液蕲蛇c contortrix蛇,不能有效地工作,在犬类蛋白质。调查人员评估的影响类似提取使用clotting-based化验发现犬类样本明显hyporesponsive样本人类相比,牛,和马(15];精确的原因减少效应还不清楚,但狗只是部分同源蛋白质C(72%)与人类形态(15]。然而,我们的研究结果和他人的暗示蕲蛇c contortrix毒液作品充分对犬类的样本,使蛋白C的测量活动如果混合的犬血浆用于校准分析。使用这种方法,我们初步参考价值的80 - 115%,基于最小值和最大值,因为样本量相对较小,符合这些报道Toulza et al . (75 - 135%)4)和鲍尔et al . (76 - 119%)4,11]。测定的精度是可以接受的:我们的变异系数被他人低于报道(4,8,11),在人类遇到了诊断应用程序的性能目标(4,8,11,16]。
我们研究了贮藏条件不同于之前报道的影响。在之前的一项研究中,血浆样本存储在20°C 2个月或−−60°C为10个月前分析(15]。在另一项研究中,样本存储最多3周−80°C,尽管整除3标本的分析也为13个月存储−80°C没有发现变化的结果(11]。在第三个研究中,犬血浆存储2个月前在−70°C批次的样本被运到一个外部实验室进行分析(8]。我们用传统的统计方法来检测蛋白质C活动的显著差异。其他调查人员17,18)分析物的稳定性定义为改变初始值<±10% (17,18]。使用我们的数据,存储一些样品的蛋白C活性是不同于新的等离子体。此外,一些差异在统计学上没有显著意义,但低P值,这表明缺乏意义可能是由于小样本大小。然而,所有治疗组的平均值都在参考范围内的差异,即使具有统计学意义,是小;此外,只有样品,进行了两个冻融周期超过10%变异,然后略微。
基于这些发现,我们解释的差异结果实验后储存条件没有临床意义。这个解释是一致的结果调查人员研究了不同贮藏条件的影响人类和犬类蛋白质C活动(11,14,17- - - - - -20.]。临床和实验室标准协会指南(13]为实验室开发的测试表明,蛋白质C测试标本的人应该保持在室温和离心机和测试时间4小时内收集,或者,如果测试是在4小时内未完成,platelet-poor等离子体应该冻结在−20°C长达2周或长期存储−70°C (13]。基于我们的研究结果和他人的,我们相信CLSI样本存储指南开发测试在人类身上也适用于测试的狗。CLSI指南不包括任何具体建议反复冻融蛋白C活动周期的影响。我们的建议是为了避免反复冻融循环,除非未来的工作解决这个问题更加明确地表示。
蛋白C活性没有明显不同的样本存储在相似的条件下,但在不同的实验室进行分析。这两个实验室在这项研究中使用相同的工具和化验,但不同批次的混合的犬血浆校准分析。缺乏显著性差异表明,生成的数据从实验室使用基本相同的方法可以合理地比较。可变性在蛋白质C结果和实验室之间的主题研究在人类实验室,但据我们所知,没有在兽医实验室21]。
4所示。结论
总之,这份报告描述了我们如何适应人类比色蛋白质C测定用于商业狗。我们的初步参考价值是一致的与其他调查人员使用比色或clotting-based化验,并测定的精度优于其他报告和性能目标为人类建立实验室。此外,我们报告以前未报告的存储条件对测试结果的影响。我们相信新的样本之间的差异和存储的研究条件下几乎没有临床意义,CLSI指南开发测试在人类身上也适用于狗,和比较的结果从实验室使用基本相同的方法可能是有效的。
确认
这部分工作是支持UTCVM卓越中心的暑期学生研究项目,UTCVM天使基金研究和治疗先天性门体静脉的分流术的狗。