文摘

鸟型分支杆菌无性系种群副结核(地图)、慢性细菌性肠炎的病原体,有一个健壮的环境中的生存能力。然而,地图的能力通过土壤迁移到排水瓷砖或地下水,离开农场,泄漏到当地水域是记录不足。为了评估地图的能力通过土壤浸出,两个实验室实验。在第一项研究中,8列(30厘米)的砂质壤土土壤处理纯文化的映射。两个土壤水分水平和两个地图使用浓度。列是用500毫升的水淋滤一周一次三个星期,渗滤液收集,并进行了检测分析。在第二个实验中,粪便从地图-牛(控制)和高的工友牛(治疗)沉积在8类似列和列和500毫升的水淋滤每周为四个星期。地图在渗滤液样本用rt - pcr检测和计算和文化技术,分别。使用rt - pcr,地图可以被发现在两组实验的渗滤液几个星期但只能恢复使用文化技术实验。相结合,这些实验表明潜在的地图通过土壤由于降雨或灌溉后的应用程序。

1。介绍

鸟型分支杆菌无性系种群副结核(地图)、慢性细菌性肠炎的病原体(JD)家养和野生反刍动物是在奶牛场环境中无处不在的(1]。此外,地图一直牵连科恩的可能原因的疾病在人类2];然而,这仍然是强烈争议。一些报告显示,地图将各种下生存很长一段时间在体外物理和环境条件,控制大量的水,尿液,粪便,温度(3- - - - - -5]。结果表明,长期生存可能发生阴影动物管理位置和地点附近接受频繁的介绍的肥料6]。用大坝的水和沉积物列,一项研究[6)显示,地图可以存活48和36周置于阴凉处或semiexposed位置,分别在沉积物和生存是12到26周的时间比在水中生存列。在Map-inoculated液体肥料浆储存在厌氧条件下,地图显示生存252天在5°C和98天15°C (7]。一项研究[8)发现,地图可以生存175天Map-inoculated液体肥料存储。一个大型研究108年明尼苏达州奶牛场[1)发现一个可预见的位置地图恢复隔离在小巷和肥料存储区域。在另一项研究也获得了类似的结果,使用大约100个奶牛场在美国(9]。这很重要因为land-spreading牛的粪便是一个常见的做法在许多奶制品业务(10,11]。同时,地图的生存土壤中可能受到土壤存在的类型(11)建立了其他细菌(12,13]。地图通过土壤进入浸出的潜力的一个农场的环境或输入一个当地的分水岭是未知的。最近的一项研究调查了过程控制地图传输通过含水层材料和发现,与其他细菌相比,土壤中的地图交通较低(14]。是未知的另一个因素是地图在浸出过程中生存的能力。直到最近,地图吸收在土壤颗粒是研究和发现的生物添加到列估计83%是被保留在挤满了粘土的层析柱和硅土15]。赵等。(16]表明,粪便细菌可以迁移到渗流系统的地下和造成重大污染(地下土壤)尤其是当肥料反复应用。对于其他肠道细菌它了17),细菌浸出瓦片状排水可能超过71000生物100毫升⁻¹当驱动与高水渗透。本研究的目的是评估潜在的地图通过列在实验室条件下的土壤浸出。我们的假设是,地图有能力通过土柱浸出时引入纯培养接种体或通过粪便。

2。材料和方法

2.1。土壤

研究中使用的土壤类型是特雷西(Coarse-loamy、混合、活跃,介子的Ultic Hapludalfs),收集Pinney-Purdue农业中心位于县波特和LaPorte县、印第安纳州,美国。我们使用这个土壤,因为它在美国是最常见的土壤类型Midewest。一个聚合生成的样本结合土壤从10个不同的地方穿过田野。土壤样本来自地方没有畜牧生产,已筛(4毫米)在室温下储存在封闭的塑料袋,直到使用。特蕾西土的土壤参数包括pH值5.5,1.5%的有机物,6 ppm Na, 103 ppmP - n, 72 ppm(我奥尔森布雷),155 ppm K, 148 ppm毫克,787 ppm, 9 ppm年代,2.9 ppm锌。土壤分析是由哈里斯实验室(林肯,NE)。包装列之前,土壤是通过一个2毫米筛。土壤含水量是由干燥土壤在105°C的次级样本24小时并确定其水重量分析地损失。

2.2。土壤列设置

PVC管的底部(40厘米长度×8厘米直径)是金属丝网覆盖和奶酪布(图1)。管的低30厘米标记和足够的土壤添加到提供一个通用1厘米的最终体积密度⁻³基于土壤质量的放到一个特定的列。为了评估初始土壤含水量的影响在地图运动在浸出过程中,土壤是调整两个湿度:−0.1或−0.03 MPa(14和15.2%,分别地。),之前放置到列。之所以选择这两个土壤水分吸入,是因为它们支架的最佳土壤水势范围微生物过程(18]。土壤被带到两个土壤水分水平通过添加水一滴一滴地的方式缓慢而混合来达到尽可能均匀分布(19,20.]。

2.3。地图剂的制备

地图剂从自然感染的牲畜的粪便样本准备之前确认是正基于血清ELISA和液体粪便文化(程序被Whitlcok和罗森博格,1990)(21]。液体培养是孵化长达6周和酸快速染色法应用于样品在4.5和6周。执行特定PCR测试映射到样本用积极耐酸的结果。积极通过映射具体样品PCR被报告为积极的地图。液体培养阳性样本条纹在哈罗德的蛋纽约琼脂获得独立的殖民地,随后再次传递给液体培养基繁殖所需的浓度和用作股票培养液。

2.4。映射复苏列

模仿自然降雨,每个土壤列收到每周500毫升蒸馏和去离子水一滴一滴地方式实现均匀分布,也就是相当于大约150毫米的降雨。渗滤液收集每一列成100毫升无菌瓶放置在PVC列。24小时后水是补充道,渗滤液体积测量和离心机(7500克;10分钟)。上层清液倒出,剩下的沉积物在1毫升无菌水resuspended地图检测和枚举。

2.5。Preculture地图与PCR检测

球反弹1毫升无菌水在2500 g离心10分钟。上层清液被除去,颗粒被用于DNA提取和使用Tetracore映射提取系统实时PCR和DNA检测组件(位于马里兰州Rockville VetAlert, Tetracore, Inc .)。生产的程序。

2.6。细菌培养

长途跋涉ESP液体培养系统(迷航诊断系统,Inc .,西湖,哦,44145)是用于细菌培养。双孵化方法如前所述[21)被用来准备样品,修改,1毫升的样品替换2 g的粪便。样本被放置在30毫升无菌水,混合和允许30分钟。减少其他快速增长的细菌的数量,5毫升表面流体的净化与25毫升的0.9%氯化hexadecylpyridinium (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)半歇工脑心浸液BHI肉汤和允许站在37°C 24小时在900 g离心后30分钟,1毫升的颗粒是resuspended半歇工BHI汤与万古霉素(10μg / mL;(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)、萘啶酸(60μg / mL;(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)和两性霉素B (40μg / mL;(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)和孵化在37°C(24小时22]。准备使用ESP para-JEM文化土壤培养瓶和ESP的孵化机(长途跋涉的诊断系统,Inc .,克利夫兰,哦)。样本从ESP机在4、5、6周和评估抗酸的染色。这个过程是为了增加测试特异性,以确保地图与另一个积极抗酸的细菌的存在。文化结果记录为+ 2 + 3 +,相当于低、中等和高细菌负荷(< 10 colonies-per-tube (CPT), 10 - 50 CPT,和> 50 CPT,职责)。粪便文化敏感性估计40至80%取决于细菌负荷。使用粪便文化,测试特异性几乎是100%。然而,没有这样的信息可以在测试性能使用土壤渗滤液。抗酸的正被证实使用的样品900年PCR检测900年基因。从ESP par a-JEM文化中提取了DNA胍isothiocyanate-glass珠裂解方法(23]。Alcohol-precipitated DNA提取resuspended 40μL无菌水。IS900段引物用于放大以及PCR的程序执行之前被报道(24- - - - - -26]。简单地说,每个50μL反应包含了200μM d的ATP, dCTP dGTP;1μM dUTP;3.0毫米Mg Cl₂;10毫米Tris-HCl, pH值8.3;50 mM氯化钾;0.01%明胶;0.5μ米每个引物IS90/150C (5′-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG-3′)和IS900/921 (5′-AATCAACTCCAGCAGCGCGGCCTCG-3′);1 u urail -N -糖基化酶()、技术中心、麦迪逊、WI);2.5Taq聚合酶(PE应用生物系统公司,福斯特城,CA);和2μL DNA的提取。此外,每个批处理运行包括积极和template-negative控制,以及)控制(扩增子包含dU残留物)。

2.7。实验1

在这个实验中总共8列。前接种过程土壤样本每一列培养了地图和造成负面的。地图的纯培养菌株被引入的前5厘米的八列。细胞悬液是统一应用到顶层通过注射器注入。这些细胞被应用在两个细胞浓度(10⁸和10⁷细胞毫升⁻¹:10毫升/管)。土柱和500毫升水淋滤如上所述一周一次三周(图1)。渗滤液是收获如上所述。实验是在重复做除了控制列。

2.8。实验2

两头奶牛粪便已知自然感染从先前的测试被用于映射Map-positive粪便接种体。这些样本都被冻结(−70°C)收集了牛的直肠给药后在样品的一个子集培养评估细菌负荷使用固体媒体所描述的其他地方(27]。结果初始文化表明粪便细菌负荷在> 100 CFU / g。一旦映射示例和土壤中浓度确定列准备接种,粪便样品在室温下解冻了2小时。粪便从第四个泌乳奶牛获得已知被重复粪便负面文化和血清ELISA作为消极的粪便标本接种体控制。这些样本冷冻和解冻如上所述。

2.9。实验过程

在这个实验中我们使用了八个PVC列满30厘米的特雷西土壤容重的通用1厘米⁻³在一个起始含水率对应−0.03 MPa。治疗组,50克的肥料混合好,均匀分布在顶部2厘米的土壤(没有每个4治疗的列。5 - 8)以类似的方式。同样,50克的地图-粪便是均匀分布在4控制列和混合到2厘米的土壤农业模拟粪便传播。24小时后的肥料是存款,列被淋溶与500毫升蒸馏水如上所述。此后这个过程收获样品是7周每周重复一次。样品收集周0、2、4、5、6和7是地图检测处理。其余为实验描述的过程是一样的。

2.10。统计分析

地图数据表示为−,+ 2 + 3 +表1排名1、2、3、4分别为目的的统计分析。队伍被受到nonparameteric单向方差分析分析(卡方和Wilcoxon测试)调查的统计意义前期土壤湿度的影响,初始地图接种体大小和时间leachats地图上的水平。渗滤液体积数据也受到单向方差分析测试的统计学意义前期土壤湿度的影响水平。在SAS统计分析都做了(2002 - 2003年,SAS研究所有限公司,北卡罗莱纳)的显著性水平。

3所示。结果

3.1。实验1

平均322毫升和345毫升渗滤液收集从土壤中列的初始土壤含水量−0.1 MPa和−0.03 MPa,分别。leachat体积的差异之间的两个治疗无统计学意义。rt - pcr结果、细菌培养和PCR-IS900显示地图的渗滤液收集的样本中检测出治疗列与浓度的地图(10⁷和10⁸CFU(表1在三周的时间。每周的数据统计分析表明,初始接种体大小没有任何重大影响渗滤液PCR和培养地图级别(例如,第一周PCR;,星期2 PCR;和,星期3 PCR)。同样适用于前期土壤水分水平除了第一周的文化水平明显高于渗滤液的地图从列的前期土壤水分水平为0.03 MPa。培养地图水平随时间减少渗滤液,这减少在统计学上意义重大。pcr映射的水平,然而,随着时间的推移,没有任何明显减少()。

3.2。实验2

平均410毫升和425毫升的渗滤液收集从土壤的控制和治疗列,分别列淋滤后24小时500毫升蒸馏水。这种差异无统计学意义,但源自于一个事实:尽管努力保持同样的土壤密度在所有列,列没有。6小渗滤液产生的治疗组平均的研究(< 100毫升)。

rt - pcr结果表明粪便后应用程序的表面处理列,所有的渗滤液负了地图。在两周后应用程序的三个四列是积极的治疗,但检测的极限附近35周期阈值(Ct)。产生的三列Ct值为34.9,34.81和34.43。在四个星期后肥料应用,治疗组的一列是正面的()。在周5、6、7治疗后,所有列rt - pcr阴性。在所有时间点,当与液体媒体文化测试,未发现粪便细菌地图在渗滤液从任何八列中恢复过来。

4所示。讨论

从动物粪便污染的食物和水微生物已成为关注的话题在过去十年中,特别是在氨氮肥料污染的结果只动物或粪便故意传播到字段作为肥料或浪费28]。我们第一次实验的结果使用地图培养液显示可以恢复从土壤淋溶与水的列。然而,我们没有一个解释为什么两个样品水分含量都-在两个正面和每周3。一个可能的解释是,地图后才被保留在土壤和充足的水倒可以洗的底部列。趋势映射到丛和间歇检测并不少见。第二个实验评估了地图的浸出能力源于一个包含粪便细菌肥料矩阵和可能的其他抑制剂,如有机和无机材料迁移在列。这个实验的结果表明,肥料作为地图的来源,只有少数细胞可以通过30厘米的土壤柱浸出。然而,我们不能评估如果这是可行的细胞。临床流行病学作者深知,这是一个关键因素的地图是否牲畜传染给人类。尽管rt - pcr结果非常接近推荐截止值,我们相信他们是准确的,因为这些结果是常数在几个采样周期治疗3的4列。 Hexadecylpyridinium chloride (HPC), alone or in combination with the antibiotics vancomycin and natamycin, is used in the decontamination process during the sample preparation for culture [21]。一些研究报道,HPC净化导致培养阳性的数量显著减少牛奶样品(12,29日]。这个过程可能死亡的一些可行的细胞显示在rt - pcr,因此文化结果均为阴性。结果表明,肠道细菌与土壤环境之间的相互作用可以不同于没有肥料的组件,这可以通过土壤影响保留和运输(30.]。肥料应用程序,改变土壤的有机和无机成分,它有一个很大的影响土壤中细菌的生存和流动性(30.]。由于细菌的数量增加了通过粪便低于纯培养的应用程序中,这两种方法之间的比较是很困难的。它似乎是合理的,然而,映射两个实验之间的浸出能力的差异在一定程度上是由于粪便环境与生物和非生物组件。敏感性和特异性PCR测试之前粪便文化相比,固体或液体媒体是否(31日- - - - - -34]。在一项研究中,然而,测试灵敏度是直接与粪便细菌负荷(33]。专门使用的PCR方法在当前的研究中Alinovi et al。34)评估测试的敏感性和特异性为60%和97%,分别。在这个最初的研究中,我们已经证明,地图可以移动环境中这一发现表明,大规模的调查是必要的。地图可以通过土壤浸出的可能性可能进入地下水或退出系统在瓷砖水可能进入供水系统用于人类消费尤其令人担忧的相当多的证据表明,地图可能参与人类克隆氏病的病因和病理生理学(35]。是很重要的考虑,我们只使用一种类型的土壤(Tracy),但是这种土壤是最常见的印第安纳州的附近发现乳制品操作。地图的运动通过土壤也可能受到物理、化学和生物性质建立了土壤的其他细菌(12- - - - - -15]。进一步了解地图的浸出和生存在不同土壤类型将使我们能够更好地解释的空间集群映射血清阳性发现与淤泥肥沃的土壤或沙子有关内容在印第安纳州(11]。因此,从我们的研究结果表明,这还需要进一步的研究来确定地图可能通过环境,特别是在土壤渗滤液。