文摘
本研究的目的是血清学、细菌和分子诊断、以及分子表征鸟型分支杆菌无性系种群。副结核(Map)在成年牛的五个哥伦比亚的奶牛。血清样本检测的间接吸收酶联免疫吸附试验(ELISA-C)。通过文化汇集所有粪便样品进行测试。之后,粪便样本地图积极池测试单独的文化和聚合酶链反应(PCR)。在一个群,泥浆和组织样本从一个动物也被PCR和测试和文化。地图分析了隔离的茎短序列重复(MLSSR)和分枝杆菌点缀重复Units-Variable串联重复序列的数量(MIRU-VNTR)方法。ELISA产生积极的结果在1.8%(6/329)的动物和40%(2/5)的牛群。四个粪便,两个组织,和两个泥浆样本一群被文化和PCR地图积极。MLSSR MIRU-VNTR显示两种不同的应变资料中八地图隔离恢复。该研究报告的第一个分子描述映射在一个奶牛在哥伦比亚,限制个人的诊断亚临床感染牛、地图和合用的粪便样本的有效性和环境采样图诊断。
1。介绍
鸟型分支杆菌无性系种群。副结核(地图)是一个缓慢的增长,mycobactin-dependent耐酸的细菌类结核或慢性细菌性肠炎在牛1]。副结核牛行业产生了巨大的经济影响,特别是牛奶产量和身体条件。地图也一直与人类慢性肠炎称为克罗恩氏病,但这种关系仍然是有争议的2]。
酶联免疫吸附试验(ELISA),粪便样本细菌培养,聚合酶链反应(PCR)是广泛用于临死前的诊断测试(副结核的牲畜3- - - - - -5]。另一方面,细菌学的文化汇集粪便样品和环境采样具有成本效益的方法分类群地图感染(6,7]。此外,抽样所有成年牛在每一个群,环境采样,连续测试,使用两到三个诊断测试已经推荐群筛选和增加地图诊断的准确性5,8]。
应变微分的地图是非常有用的理解的起源感染和疾病传播动力学,设计适当的控制措施,以提高诊断速度和疫苗的发展9]。尽管副结核是一个法定传染病在哥伦比亚,缺少一个正式的国家控制程序和诊断测试的一些局限性导致了减少当地疾病的信息。
本研究的目的是血清学,细菌,和分子诊断的地图在成年牛五哥伦比亚奶牛,以及地图分离的分子鉴定和比较结果与类似的研究。
2。材料和方法
2.1。选择群
2009年11月和12月之间,五个奶牛被选为地图(表检查1和图1)。这五个群,四个群(群1、2、3、4)ELISA试验和PCR阳性但文化负面的地图在2007年之前的横断面研究10]。在这项研究中,13个群没有以前的历史类结核和一群(群1本研究)与先前诊断慢性细菌性肠炎(11)检查。在每一个群,只有一个样本(19至29日随机选择成年奶牛,根据群人口)进行了测试。血清学测试最初进行采样所有动物使用商业lipoarabinomannan——(LAM)建立间接ELISA试验没有preabsorption (Svanovir Para-TB Ab酶联免疫试剂盒,乌普萨拉,瑞典)(ELISA-A)。ELISA-A确认阳性样本的商业间接ELISA测试基于原浆地图抗原抗体的检测,包括pre-absorption一步分枝杆菌phlei(m . phlei)(ELISA副结核抗体确认、Pourquier研究所蒙彼利埃法国)(ELISA-B)使用。PCR诊断,两种方法针对F57和Mav2,是900年分别应用(10]。
之前测试的四群,2007年在本研究中选择(群1、2、3、4)从来没有遵循任何结构化或一致的副结核控制项目预防或控制在2007年第一个研究之前,或在这两项研究之间的时期。然而,扑杀动物停止响应的疾病(包括动物兼容慢性细菌性肠炎的迹象群1)或低效率或繁殖性能是永久地完成的。剩下的群(群5)与减肥和牛停止响应腹泻兼容副结核,但没有慢性细菌性肠炎或先前的历史地图的诊断。
成群的测试,只有群2购买动物在2007年第一个研究之前,两国的研究。群5购买动物采样前的最后两年的学习。群3和群4之间,属于同一农民,牛通常发生交换。所有牛群提高自己的替代小母牛(表1)。
2.2。收集的样本
血清和粪便样本取自所有成年奶牛(≥2年)在每个群。在群2,110头奶牛粪便样本,但只有53人血清样本,因为农民不愿样品所有的动物。在一个群(群1)泥浆坑收集液体肥料和污水从群的挤奶厅,另外泥浆样本来自三个不同的地方。从一个动物相同的群体(群1),部分厚肠(结肠)和肠系膜淋巴结得到安乐死和验尸后由于先进的临床症状与慢性细菌性肠炎兼容。年龄是信息收集与除了六个动物,所有的动物的农民目前没有可用的数据采样。
2.3。ELISA
血清样本()检测抗体的ELISA测试基于检测图提取(法国蒙彼利埃ID屏幕副结核间接、IDVET) (ELISA-C)。这个测试包括pre-absorption一步m . phlei。ELISA-C并非由于经济原因进行复制。一群被认为是积极的,如果至少有一个动物ELISA-C阳性。
2.4。细菌学的文化
粪便样本()的基础上进行战略池过程。粪便样本分类的基础上,出生顺序的动物,和2 g的每个奶牛粪便混合在实验室为8 - 12头牛的粪便样品池/池。之后,3 g的汇集粪便样本净化为0.75% (w / v) Hexadecylpyridinium氯溶液(0.75% HPC) 24 h,根据标准程序(12]。简而言之,3 g的粪便被添加到50毫升无菌管(Sarstedt Numbrecht,德国)包含HPC 30毫升的0.75%。这种悬架被摇晃,vortexting手动混合在垂直位置,让5分钟在室温下允许降水和大粒子的沉降。大约20毫升的浮层的上部是转移到另一个在50毫升无菌管整个悬架是由200 U /分钟搅拌30分钟。管被放置在垂直位置在黑暗中在室温下24 h。净化池粪便样本离心机在900 g×30分钟期间,上层的丢弃,和两个Herrold蛋黄琼脂培养基(HEYM)偏,补充了mycobactin J(准备培养基,正欲、海德堡、德国)注射300μL的净化颗粒12]。偏是孵化在37°C最多20周和检查1-2-week间隔。
泥浆样品也汇集、净化和粪便样本接种如上所述。如果HEYM偏接种汇集粪便或泥浆样本显示分枝杆菌生长,单一粪便和泥浆样本单独培养。个人负样本池被认为消极的,而不是单独的测试,除了ELISA-C-positive动物的粪便样本群2,这是培养个人不管他们的文化成果。
组织样本(结肠癌和肠系膜淋巴结)准备,净化,接种在复制到HEYM偏12]。短暂,结肠组织被割开,肠系膜淋巴结从脂肪组织释放。样本分别切碎,和大约1 g的各自的组织材料放在兜包袋7毫升的0.9% (w / v) Hexadecylpyridinium氯溶液(0.9% HPC)和均质6分钟的三角胸衣。均质组织在50毫升无菌管(Sarstedt、Numbrecht、德国)和动摇了在室温下,200 U /分钟5 - 10分钟。之后,管是在垂直位置在黑暗中在室温下24 h。去污后,管离心机在1880×g,在20°C为20分钟。上层清液被丢弃,沉积物在PBS-Buffer resuspended pH值7.2和vortexted。最后,两个HEYM偏,补充了mycobactin J(准备培养基,正欲、海德堡、德国)注射300μL净化颗粒。完成了粪便样本,偏在37°C的环境最大20周,检查每隔1-2-week分枝杆菌增长或污染。污染率大约在8.3%(3/36)的粪便和泥浆池样本,和3.7%(1/27)的个体粪便样本(包括ELISA-C-positive动物的粪便文化群2)和组织样本。在所有受污染的样品中,只有一个倾斜的复制的影响。分枝杆菌的增长,证实了地图实时PCR方法描述如下。
2.5。聚合酶链反应(PCR)
PCR进行只有在个体粪便和泥浆样本的一部分积极的粪便和泥浆池样本,文化,和四个积极ELISA-C动物的粪便样本群2 ()(图1)。从粪便DNA隔离和泥浆样本进行了使用商业DNA制备装备(高纯PCR模板制备设备,罗氏,曼海姆,德国)。简单地说,1.5 g的牛的粪便是15毫升无菌,nonpyrogenic离心管(Sarstedt, Numbrecht,德国)。5毫升的稳定的缓冲(运输和Recovery-S.T.A.R大便。缓冲区,罗氏,德国曼海姆)被添加到粪便样本和均质。这个悬挂随后离心机1分钟1000×g和1毫升的上层清液放入2 mL样品管(Biozym科学、赫斯。Oldendorf,德国)包含陶瓷珠子,尺寸范围1.4 - -1.6毫米,基因型ZY (Zirkonoxid-Beads、钇稳定)(西格蒙德·Lidner, Warmensteinach,德国)。机械细胞破坏步骤在一个自动化的生物样品进行溶解(Precellys 24日,贝尔坦公司技术、Montigny-le-Bretonneux法国)来实现高效的细胞溶菌作用。的混合随后在95°C的环境10米,5000×g离心5分钟。二百毫升的上层清液添加到1.5毫升反应管包含5μL(溶菌酶(默克公司,达姆施塔特,德国)的解决方案。进一步处理是根据设备的协议隔离细菌和酵母的核酸。DNA隔离总是在重复进行。
DNA隔绝细菌对地图进行了确认和分子鉴定使用商业准备工具包(DNeasy血液和组织装备,试剂盒、希尔登,德国)。这个准备包括隔夜裂解缓冲孵化37°C,蛋白酶K / AL-buffer孵化为90分钟56°C,和最终孵化15分钟在95°C,修改的协议的商业工具。和细菌培养的粪便样品中的DNA测试一式两份地图的实时PCR方法针对F57和Mav2描述Schonenbrucher et al。(13]。样品也进行复制与nested-PCR针对900年被牛等。(14]。额外的样品,准备一个积极的和消极的控制,以及包含一个空白的控制。在PCR体系中,一个积极的地图控制(DNA的积极应变地图),non-Map负控制(DNA non-Map分枝杆菌),和一个反应混合液空白控制也包括在内。实时PCR方法还包括一个内部放大控制(IAC)为了避免假阴性结果的误解(13]。
2.6。分子鉴定
地图菌株分离的分子特征,结合两种不同的基于PCR扩增的基因分型方法的地图应用基因组的重复元素。茎短序列重复(MLSSR)分析是由放大的短序列重复(SSRs)轨迹中发现1、2,8,9根据Amonsin引物PCR条件报告等。(15]。最后一个PCR反应体积(30μL)包含GeneAmp 10 x PCR(应用生物系统公司,达姆施塔特,德国),布莱恩dNTP-Mix (10μ每米)(罗氏,曼海姆,德国),0.2μ米的底漆(欧陆坊MWG、Martinsried、德国),10% Dimethil亚砜(DMSO)(罗斯,卡尔斯鲁厄,德国),1 U AmpliTaq黄金聚合酶5 U /μL(应用生物系统公司、Langen、德国),和3μL的DNA。大师混合物空白(没有DNA)作为控制在每一个PCR反应。7毫升的PCR产品混合2μL(加载缓冲区,和1.5%的琼脂糖凝胶电泳。每个SSR位点扩增子都是使用QIAquick纯化PCR净化设备(试剂盒、希尔登,德国)和测序由一个独立的实验室(序列实验室、哥廷根、德国)。MLSSR基因型被表示为重复的数量的组合中发现的4个位点扩增的PCR。
分枝杆菌点缀的重复单位(MIRU)位点MIRU-1, MIRU-2 MIRU-3, MIRU-4选择分析地图根据牛隔离等。(16]。串联重复序列的变量数量(VNTRs)位点vntr - 292, vntr - 1658(别名X3), VNTR-25, VNTR-47, VNTR-3, VNTR-7, VNTR-10 VNTR-32, vntr - 259被选来分析地图根据Overduin隔离等。17),蒂博et al。(18],卡斯特罗等。(19]。所有位点引物是那些建议使用上面提到的作者。除了MIRU-1的PCR条件,VNTR-7, VNTR-10根据莫比乌斯等。(20.],VNTR-25和VNTR-47周晓明et al。(19]。最终的反应体积的PCR (30μL) MIRU-VNTR MLSSR描述的一样。然而,对于VNTR-32的PCR扩增,5μL(甜菜碱(Sigma-Aldrich、Schenelldorf、德国)另外添加到混合所建议的蒂博等。(18]。
计算每个轨迹的重复数的MIRU-VNTR最初执行根据扩增子的大小取决于在1.5%琼脂糖凝胶电泳。此外,代表每个位点等位基因的扩增子使用QIAquick纯化PCR净化设备(试剂盒、希尔登,德国)和测序由一个独立的实验室(序列实验室、哥廷根、德国)。MIRU和VNTR基因型经重复单位的数量和所选序列串联重复序列的数量。MIRU-VNTR基因型被表示为的组合重复发现的数量在每一个轨迹的顺序MIRU-1, MIRU-2, MIRU-3, MIRU-4, vntr - 292, vntr - 1658(别名X3), VNTR-25, VNTR-47, VNTR-3, VNTR-7, VNTR-10 VNTR-32, vntr - 259。的INRA Nouzilly MIRU-VNTR (INMV)术语定义的蒂博等。(18)是考虑为便于比较与先前的研究。只为了这个目的基因座vntr - 292的结果,vntr - 1658, VNTR-25, VNTR-47, VNTR-3, VNTR-7, VNTR-10, VNTR-32被考虑。
2.7。数据分析
年龄的描述性分析,标准偏差(SD)的估计,置信区间的确定,95% (95% CI)进行了使用这个程序包BMPD release 8.1(美国伯克利)和偏差8.2版本(Hochheim-Darmstadt,德国)。测试协议的评估ELISA和文化(科恩kappa (1.0)系数)是完成了项目Win-Episcope(西班牙萨拉戈萨)。真正的流行是估计的基础上获得的患病率明显ELISA-C使用敏感性(42%),和特异性(99%)值确定之前在无症状感染动物21]。年龄与ELISA结果的关系进行了分析叙述地,根据年龄任意定义类。
3所示。结果
3.1。ELISA
ELISA-C产生积极的结果在1.8% (6/329)(C.I. 95%;0.7 - -3.9%),结果在97.5%(321/329),并怀疑结果0.6%(2/329)的血清样本检查,以及积极的结果在40%(2/5)的牛群。的六个积极ELISA-C样品检测,两人在群中发现1和4个群2(表中被检测到2和3)。真正的Map-prevalence基于ELISA-C-apparent患病率,敏感性(42%)和特异性(99%)为2.2%。
动物样本的年龄介于2.2和14年之间(平均5.9,标准差2.8)。分析动物的年龄与ELISA-C结果(正数、负数、可疑)透露,集团> 11岁,是该组织的比例最高(6.3%,1的16)ELISA-positive(表产生的样本4)。然而,它的5.1 8岁的绝对数量最高ELISA-positive动物()的研究发现。组中最年轻的牛(> 2.2 - -2.9岁),也就产生不了由ELISA阳性结果。在群3 - 5,5.1 8,8.1 - -10.9年,0.8%,2.9%,和1.9%的样品呈阳性结果,分别(表4)。
3.2。细菌学的文化和聚合酶链反应
战略对粪便样本池过程五个群导致36池,包括泥浆池准备从群1有泥浆坑收集液体肥料和污水从群的挤奶厅。两个池从群1 36池中分析了产生积极的结果通过文化5 - 6周后孵化> 50集落形成单位(CFU) /管。泥浆池产生积极的结果通过文化17周后孵化< 10 CFU /管。隔离从池获得样品被确认为地图上面描述的实时PCR方法。剩余的牛群池2,3,4,5没有显示分枝杆菌增长文化在20周的孵化。
粪便样本的两个积极的池的一部分群1 ()四个积极的结果由个人文化(表3)。所有隔离没有色素沉着和被确认为地图实时PCR。两头牛(ELISA-C-negative PCR-negative,无症状,7.1岁)低棚友(< 10 CFU /管),一头牛(ELISA-positive, pcr阳性症状6岁)是一个沉重的工友,和一头牛(ELISA-negative pcr阳性,无症状,9.5岁)是一个沉重的工友(> 50 CFU /管)(表3)。牛3从池1(群1)也产生了积极的结果由肠系膜淋巴结和结肠组织培养(表3和5)。在HEYM-slants接种肠系膜淋巴结组织,可见殖民地成长16周孵化之前,在那些接种结肠组织没有明显地图殖民地成长在这段时间。四个积极ELISA-C动物粪便样本群2通过文化和PCR结果呈阴性;这些样品都是来自不同池粪便样本(表3)。令人惊讶的是,尽管池泥浆样本产生积极的结果,文化和PCR,个人的样品()-聚合酶链反应,通过文化20周后孵化(表3)。
ELISA-C结果证实了文化只有一个动物(牛3)症状群1。因此,ELISA-C、文化和PCR只同意一个动物的动物提供积极的文化成果。根据这些结果,计算协议ELISA-C和文化很差(,95% C.I. 0.09 - -0.29)。ELISA-C地图没有检测抗体在三个血清样本从无症状群1的动物(牛从池1和牛2 1,牛4从池2)粪便文化产生积极的结果。这三个动物的粪便样本中两个,地图也没有检测到PCR。在一个案例中,一头牛(牛4池1群1)ELISA-C结果呈阴性,但积极的结果通过PCR和文化(表3)。
3.3。2007 - 2009年的比较结果
基于之前的研究结果(10),它是确定一些动物()再次测试2007年测试通过ELISA、PCR和文化在这个研究(2009)。这些动物在2007年之前提出了副结核的症状或两者之间的研究。结果可分为五个不同的类别,只有积极的结果,这意味着其他测试结果呈阴性。在类别1中,一个由ELISA-A动物产生积极的结果和实时PCR(分子目标F57)于2009年和2007年ELISA-C-positive结果。第二类,一个动物产生积极的结果在ELISA、PCR和实时PCR(分子的目标Mav22007年)。3级,两只动物ELISA-A和ELISA-B积极的结果在2007年生产的。4级,一个动物ELISA-A和PCR在2007年产生积极的结果。最后,在5级、6个动物产生积极的结果由ELISA-A(表6)。
3.4。分子鉴定
总共八地图隔离恢复。四个隔离来自粪便样本,一个来自肠系膜淋巴结,一个从结肠组织样本,和两个从池泥浆样品(表5)。隔离所有被确认为地图上面描述的实时PCR方法。所有隔离都获得样本群1。所有隔离增长-周内孵化,除了泥浆样品和结肠组织,16周后增长。
四个隔离来自粪便样本,隔离从结肠组织,获得的两个隔离从泥浆样本获得的MLSSR基因型7 g-10g-4ggt-5tgc(以下MLSSR-genotype),隔离来自肠系膜淋巴结和剩下的泥浆样本中分离获得的MLSSR基因型7 g-10g-5ggt-4tgc(以下MLSSR-genotype B)。同样,MIRU-VNTR显示两种不同的组合MIRU-VNTR基因型,基因型3951-42332228-2(以下MIRU-VNTR基因型1)和3951-42332228-2(以下MIRU-VNTR基因型2)。有趣的是,应变类型A - 1和B - 2都是确定在牛4中,代表一种双菌株感染。
4所示。讨论
据我们所知,这是第一次报告的孤立和分子特性的哥伦比亚Map-strains来自奶牛。为实现这一目标,牛群与历史的慢性细菌性肠炎(病例报告和/或积极的诊断)被挑选增加检测和隔离的可能性地图。尽管牛生产的重要性在哥伦比亚,副结核仍相对被知晓,非常有限的流行病学信息和数据地图上的分子特征。大约60年来,一些研究试图扩大在该国副结核的临床和流行病学信息通过研究诊断、治疗、流行病学、分子生物学。现在,一个一致的研究包括一个重要的牛人,使用不同的诊断测试,包括分子表征循环因果代理。先前一些研究建议、ELISA、PCR、和文化被用来增加地图检测的灵敏度,以确认是否群慢性细菌性肠炎或地图的历史真的是诊断感染(22]。
当前ELISA-C积极结果的比例低(1.8%)相比ELISA-A积极的结果(10.1%)在四个五群检查乍一看很惊讶,但这是解释的特点,ELISA检测这两项研究中使用。ELISA-C吸收测试使用提取、纯化地图IgG-conjugate和预培养m . phlei的特征,被认为是重要的影响的增量的特异性血清学诊断副结核(23- - - - - -26]。因此,使用一个吸收测试(ELISA-C)产生了消极的或较低比例的积极成果在牛群与以往地图诊断(ELISA-A和PCR),甚至与先前的历史类结核的临床病例(如群1),相比之前2007年的研究。在之前的研究中,成群的乳制品地区大多没有以前副结核的诊断测试使用一个未被吸收的试验林用作映射抗原(ELISA-A),产生一个更高比例的seropositives证实只有两只动物的吸收ELISA (ELISA-B)。有趣的是,这两个吸收测试的结果,ELISA-B 2007年和2009年ELISA-C,结果接近(5.1%比1.8%)比获得的未被吸收的ELISA-A 2007年(10.1%)。这表明,测试使用的特征在不同比例的行列式seropositives获得这两项研究。
此外,缺乏可靠的初步流行病学信息疾病使也合理,研究该地区奶牛发病率很低甚至是负的地图,或者至少与当前诊断测试检测不到,要是横断面研究,而不是纵向研究或串行测试。在任何情况下,这些研究的第一步是系统的流行病学研究副结核在哥伦比亚,因此必须进行进一步的研究来阐明疾病的情况。
2号群的情况下,临床副结核从未被报道,但是一些动物被ELISA-A积极和PCR在2007年和2009年(四个积极ELISA-C,但负面结果文化)是惊人的和难以解释。在这种情况下,它可能是其他分枝杆菌可能影响的积极成果未被吸收的ELISA-A ELISA-C积极的在2007年和2009年,使积极的动物的比例高于它真的是27]。在2007年的研究,非典型分枝杆菌(分枝杆菌engbaekii)被孤立10]。然而,缺乏测试的一半的成年牛人口群ELISA-C限制任何明确的结论对当前- PCR和文化从动物血清反应阳性的结果,考虑到测试的高质量的工作。此外,四个积极ELISA-C动物的粪便样本单独培养,这可能是减少的可能性可能的浓度低数量的地图,如果这些动物真的棚友。同样的,有可能是积极的ELISA结果,不仅在群2中,但是所有成群的两项研究已经产生由于干扰结核菌素皮内测试(尾折叠结核菌素试验)28)应用偶尔为了认证为免费群牛结核病在坐标系为根除结核病的国家计划。总之,这些结果ELISA-A甚至ELISA-C可能是简单的误报率在2007年和2009年,分别。
明显低患病率和真正的患病率(1.8和2.2%)可能是获得高特异性的相关测试使用(99%),作为研究这些特征(之前报道29日]。流行的决心,虽然我们的研究是有偏见的,因为分析牛群与先前的历史或副结核的诊断,动物水平明显患病率似乎低于计算获得的肥胖盛行程度在欧洲国家30.]。然而,没有发现类似的研究旨在确定地图使用ELISA-C感染的发病率,使不可能更好的比较结果。
在这项研究中,只有0.8%的ELISA-C-positive奶牛群中发现3 - 5年,唯一有症状的动物发现6岁的牛。这结果有点不同意报告之间的ELISA检测呈阳性的概率更高的2.5和5.5年受感染动物(31日)和与知识,大多数临床副结核病例发生在3 - 5年(32]。牛在哥伦比亚倾向于保持更长时间在生产和扑杀后相比北美或欧洲国家。在这种方式,牛可以长寿到足以进行检测,ELISA检测或粪便文化,或显示副结核症状的年龄限制为其他国家报告。
报道之前,文化汇集8 - 12动物的粪便样本每池允许大量的粪便样本的考试文化以低成本和可接受的灵敏度(6,33,34]。池的选择没有考虑5粪便样本而不是10由于经济原因。此外,精确的地图信息within-herd患病率是缺乏一个更好的决定最好的池大小根据以前的建模研究[35]。这个选项也被丢弃,因为报道无关紧要的池之间的敏感性差异5或池10头牛在先前的研究在一个类似的南美牛生产系统中,它被认为池相关的敏感性更牛的患病率和牛的感染状况与池的大小(6]。以同样的方式,在美国的一项研究报告可以接受灵敏度每池(35%),10个样本集中的样本5动物相比(44%),导致成群的结论至少有一个高粪便的工友,超过5样品池也可能发现地图(36]。尽管一些研究得出更好的灵敏度池5动物而不是10或更多,这些研究都是基于地图的检测使用放射粪便文化可靠地检测low-shedders,可比不上古典细菌学的方法(37]。其他研究参考更多比灵敏度估计,理论计算难以推断南美字段条件(35),或报道5样品池的使用重点确定文化汇集粪便样本的敏感性与个体粪便样本的文化相比,与特别注意每群汇集粪便样本的数量,而不是动物的数量在池中包含粪便样本(36]。
积极的检测池泥浆样本从一个积极的文化ELISA-C群(群1)同意相关的知识的这一发现血清反应阳性的结果,和更高的概率隔绝泻湖样本相对于其他环境样品(7]。单浆样品的结果产生负面结果的个体文化和PCR已经报道,归因于不均匀分布地图的粪便样本(6),缺乏同质性的粪便样本之间或不同敏感性的个体粪便文化过程实验室(34),地图的存在至少一个动物的粪便池内的粪便样本,尽管这种动物没有检测到细菌个体粪便样本(文化38),或者不清楚原因36]。在任何情况下,卡莉et al。正确地得出结论,有机会的因素除了稀释相关的元素检测粪便的地图,特别是当样品含有低数量的生物,细菌并不是均匀分布在粪便样本33]。因此,尽管完整的均化池泥浆样本,使用的PCR系统非常可靠,有可能是3 g和1.5 g的泥浆样本测试个人文化和PCR,分别缺乏足够的地图细胞被细菌检测文化提供孵化期间,和两个PCR系统(F57-IsMav2实时,900年-nested-PCR)进行复制。PCR系统使用,特别是实时PCR,严格进行特异性检测,包括一个IAC和使用多个反应控制,避免误解的结果由于干扰污染或者不太可能假阳性结果(13]。
近群1个人的分析结果显示,一个动物症状产生积极的结果ELISA-C和PCR证实,无论ELISA敏感性较高或PCR类型用于检测动物和粪便高棚友[症状21,39]。结果三个无症状ELISA-C-negative奶牛产生积极的结果,文化可能是:两种情况(地图low-shedders和PCR-negative)之前所描述的已知的“穿越”现象(40),1例(地图high-shedder和pcr阳性)的积极的动物察觉抗体。另一方面,结果一个ELISA-C positive-animal群1日由文化产生消极的结果,并不意味着动物不是感染,但脱落阶段可能已经没有开始(在非传染性的阶段被感染动物)或没有粪便取样(间歇性)的时刻。另一个可能性是,在发现这种动物Map-antibodies开始之前细菌脱落,可能晚些时候开始然后可以检测到PCR或文化41]。地图是在受感染动物的粪便在不同的水平和阶段,但偶尔,要求重复测试来检测动物脱落数量非常低的地图,无论如何这可能未被发现(5]。
ELISA-C-negative动物之一是积极通过PCR、实时PCR,和文化。相反,一个ELISA-C-positive动物在同一群由PCR显示负面结果,实时PCR,和文化。在群2四ELISA-C-positive动物粪便产生负面结果的PCR和粪便实时PCR,以及由个体粪便文化负面结果。Muskens等人发现了一个低的百分比ELISA-positive牛测试粪便培养阳性包括所有年龄组。在他们的观点,他们说可能有限粪便文化的敏感性和/或假阳性ELISA检测结果和非齐次的分布地图在粪便尤其是低棚友42]。一般来说,解释为穷人诊断测试的一致性可以归因于假阳性ELISA结果,非齐次的分布地图在粪便(特别是低棚友),地图感染的患病率相对较低,和非常低的应用ELISA阳性预测值。此外,它必须考虑,不仅不同的组合测试,但重复抽样必须实现动物个体的识别(5]。
尽管许多动物采样在之前的研究中(2007年)在牛群的时候不再第二次抽样(2009),这是一个有趣的发现2007年比较动物样本的诊断结果与结果从同一动物在2009年,模拟这些动物的纵向研究或重复测试。改变我们的诊断测试结果在2007年和2009年之间同意研究报告波动的血清ELISA、PCR和文化结果加班(43- - - - - -45]。许多试验因素(群的敏感性,特异性,within-herd患病率)在每个诊断过程影响结果的可变性,当相同的动物测试不止一次加班。特别是对ELISA,测试结果波动归因于假阳性结果在第一或第二个测试,波动抗体生产的牛,低患病率牛群的应用测试,在测试的阳性预测值较低,或分析错误。分析错误发生在样品没有测试复制根据制造商的建议,和重复分析给出了负面结果(43]。不过多个测试随时间增加的机会发现受感染的动物,这也会增加假阳性结果的可能性(43]。因此,ELISA结果仔细分析这个测试时申请个人动物诊断(21,46]。然而,这并不是一个统一的过程,因为据报道,牛与负面结果不太可能改变ELISA状态比牛与积极的结果,无论within-herd患病率(44]。
表型特征的快速增长,mycobactin依赖性,没有色素的哥伦比亚地图隔离与II型的描述(或牛类型)菌株中描述以前的研究(47]。MIRU-VNTR和MLSSR,正如前面做的(48)首次实现可靠的分化两个地图基因型在八个不同的地图隔离在哥伦比亚的一群。这些方法结合应用于增加所需的最低歧视性的能力并没有达到如果一个方法被使用,之前报道的史蒂文森等。2009年(49]。根据MLSSR,孤立的类型在我们的研究中普遍存在于牛和其他物种在不同的国家48,50- - - - - -52]。有趣的是,牛隔离来自哥伦比亚的邻居国家委内瑞拉显示一个不同的基因型(11 g-10g-5ggt-5ggt),表明菌株多样性北部的印度次大陆(48]。
虽然与其他研究相比是非常困难的,因为使用不同的位点进行分析,基因型1 (INMV1)和基因型2 (INMV 2)以前报道中最常见的基因型隔离从阿根廷和委内瑞拉18),在欧洲隔离(49,53]。双株感染病例已在美国也公布在群水平(54),德国(20.)和荷兰(55),而双株感染病例在动物水平已报告在德国(51]。
两种菌株的发现八隔离从群1中恢复过来,包括隔离来自四个奶牛群中所有出生,但彼此无关,和隔离浆泥浆坑样本收集液体肥料和污水从群的挤奶厅,显示地图的循环和环境,以及不同的动物群体。同样的,两种不同类型的隔离一个动物,类型也被隔离在泥浆样本,支持一个高度地图污染环境,导致感染多个不同的菌株基因型。群1、动物粪便作为肥料的草场,没有副结核控制程序执行。它已经呈现散在病例的动物与副结核的症状经组织病理学证实(未发表的数据),聚合酶链反应和血清学和地图已经检测到10,11]。脱落奶牛相对旧牛(≥6年)取样表明这些动物的时候一直在污染环境地图,直到他们从羊群中删除,导致地图的延续和新感染的报告,如果没有建立控制程序。
关于基因分型方法的技术方面的考虑,我们同意,可以访问和更昂贵的比MIRU-VNTR MLSSR由于测序步骤要求(48]。这方面可以代表一个限制在一些发展中国家(例如,哥伦比亚)有时测序出国进行递增MLSSR方法的更多应用程序的成本。然而,我们同意MLSSR分析是一个很好的地图分子表征方法的体外稳定性和歧视性指数(54),这可能证明测序步骤所需的成本。
这项研究的结果证实了存在和显示不同的地图菌株类型的流通和传播感染群的个体之间。此外,该研究证实了当前测试的局限性对个人的诊断亚临床感染牛、地图和合用的粪便样本的有效性和环境采样为地图屏幕牛群。
确认
作者承认ALECOL程序(德意志大学安蒂奥基亚省德,Colciencias-MEN-Icetex)对金融支持;m·菲舍尔c·沃尔特·k·西蒙,O。大学吉森Akineden, k .失败;j·e·佩雷斯·c·科雷亚,o . Arroyave m·奥利维拉m -帕拉西奥市,m·萨帕塔r·拉米雷斯j·g·马尔多纳多和安蒂奥基亚省合作大学的学生;m·苏亚雷斯所的哥伦比亚、技术和后勤支持;Departamento de Formacion Academica de安蒂奥基亚省大学的大庄园;农民参与合作;和IDVET创新诊断的捐赠ELISA-C测试套件。