文摘
目的是评估副结核分枝杆菌的生存(Map)在自然感染奶牛粪便在长时间的冷冻18°C和−−70°C。从牛之前收集的样本阳性血清ELISA和粪便文化,或慢性细菌性肠炎的临床症状。样本储存18°C和/或−−70°C和recultured Herrold的蛋黄媒体每3 - 6个月。按比例混合概率模型是用于数据分析。六十九份粪便样本存储不同时间2002年9月至2005年1月。其中,45(65%)存储在−18°C和24例(35%)在−70°C。重复文化之间平均天数日期是98年和84年18°C和−−70°C,分别。中等数量的重复文化是6和4样品储存在18°C和−−70°C,分别。调整后首次样品细菌负荷的影响温度或地图上的冻融循环数量可行性并不重要。样本的概率降低高moderate-low细菌负载和moderate-low -每月细菌负荷为13.5%。 Although this study found gradual reduction of Map concentration in stored fecal samples through time, overall survival in −18°C can ease fecal samples management in laboratories with low-processing capacity or lack of −70°C freezer.
1。介绍
副结核分枝杆菌(地图)、慢性细菌性肠炎的病原体(JD)在家养和野生反刍动物,已知生存很长一段时间在不同的环境条件(1,2]。附近的奶牛场环境尤其如此阴影发生动物粪便管理地方频繁的介绍(3,4]。一些报告描述长期在体外地图生存在不同物理和环境条件包括在水中生存,尿液和粪便和在极端温度下3,5,6]。有机体被发现在池塘水生存长达270天在体外条件和246天在牛的粪便在自然条件下,环境温度−3°C和23°C之间的不同(7]。可行的细菌分离存储相同的样品5个月后−14°C,然后在4°C 5个月之久,最后八个月的38°C。细菌存储12个月在−14°C,然后在4°C 5个月也可行的(5]。
粪便的价值文化的诊断JD在牲畜和特别是在牛一直建立(8]。收集的粪便样本通常是直接从直肠或从环境和运输到实验室作进一步处理。处理实验室能力有限可能会阻碍立即测试所有样本的能力。克服这个问题的一种解决方案,提出了存储标本在−70°C,直到设备可完成样品处理(9]。这将允许单个样本的集合,无论群大小或当实验室样品准备过程,假设存储空间是可用的。此外,样本存储还可以用于研究表现在很长一段时间。然而,有限的信息可以在地图的可行性在这些条件下,大多数研究使用相对较小的样本大小的粪便标本(9- - - - - -11]。使用11头牛在最近的一项研究中,发现样品存储−20°C一周有不利影响的可行性地图,而短期存储的粪便样本在4°C(48小时一个星期)和长期存储(3个月)−70°C对生存地图没有负面影响10]。因此,虽然作者评价地图不同运输和储存条件下生存,存储评估只有3个月。除了本研究,对地图的生存的影响下长期存储−18°C尚未评估,至于作者可以评估在出版的文献。长期生存能力的地图在这些条件下为JD研究通常可以明显降低实验成本。尤其是在实验室的可用性−70°C冰柜是由于其高成本非常有限。因此,本研究的目的是评估的生存地图从自然感染奶牛粪便长期冻结18°C和−−70°C。我们的假设是,地图长期生存能力18°C和−−70°C不会明显不同。
2。材料和方法
我们使用有针对性的取样方法,收集粪便样本的奶牛已知感染JD通过先前的血清ELISA或粪便文化测试。我们还与临床症状符合抽样牛JD(即。,chronic diarrhea, progressive weight loss, and reduced milk production) regardless of previous fecal culture results. Fecal samples were collected using a disposable obstetric glove and placed in a 40 mL plastic container for transportation to the laboratory in an iced cooler. A portion of each sample was sent for initial fecal culture, and the rest was divided into two equal portions and stored at −18°C and −70°C in a plastic container appropriately labeled with the sample ID, herd name, date of collection, and date of last culture. When manure sample was too small to be divided, priority was made to store samples at −18°C over −70°C. Our sample size included a total of 51 cows from 17 herds. Of these, 35 cows were sampled once, 27 (77%) at −18°C and 8 (23%) at −70°C. Fourteen cows were sampled twice; one of the pair samples was stored at −18°C and the other 13 at −70°C. Two cows were sampled 3; times of these, one was stored only at −18°C and the other two at both −18°C and −70°C. Samples were recultured approximately every 3–8 months. All samples were processed at the Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory using a previously described bacterial culture method [12]。短暂,文化沉积过程是使用72小时的沉积前接种4管包含Herrold蛋黄的媒介。菌落计数记录每周16周,最终结果报告为负的,光(平均0.25到9殖民地/管(CPT)),中等(平均10 49 CPT), moderate-heavy(平均50 - 100 CPT)和重型(> 100 CPT)细菌负荷。每个样本recultured直到结果负在两个连续的文化或者直到粪便筋疲力尽。
3所示。统计分析
所有统计分析使用SAS (SAS研究所版本9.1)。
为了测试我们的假设,按比例混合概率模型方法(PROC GLIMMIX)使用。我们假定一个多项分布的响应变量与3水平(0 = -粪便文化,1 = moderate-low粪便脱落(1-50 CPT), 2 =高粪便脱落(> 50 CPT))。独立变量在几个月时间(连续)的总时间样本被保存在冰箱里,储存温度(二分)(−18°C或−70°C),和最初的文化结果(顺序分类水平4的粪便细菌负荷)。每个测试粪便样本有不同的时间;因此,该模型假定重复措施(粪便文化)相同的实验单位(粪便样本)和测试时间不是常数在粪便样本。结果,测试时间也包含在模型作为分类随机变量。因为一些牛有多个样本的测试,我们使用一个嵌套的数据结构,这是样本嵌套在牛。为了测试的冻融循环次数的影响样本的映射能力,我们一起跑上面描述的相同模型一旦与主效应(几个月),然后作为一个主要作用。在最后的模型中,P< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。
4所示。结果
共有69个样本51牛存储不同时间2002年9月至2005年1月。其中,45(65%)存储在−18°C和24例(35%)在−70°C。地图是培养起始的研究所有69个样本。的45个样本存储在−18°C, 35(78%)和10(22%)样品开始研究和moderate-low细菌负荷高,分别。的24个样本存储在−70°C, 21例(88%)和3(12%)高,moderate-low细菌负荷,分别。天重复文化之间的平均数量是98(最小= 40,最大= 128)和84年(最小= 67,最大= 207)18°C和−−70°C存储温度,分别。重复文化的平均数量是6(最大= 13,最小= 2)和4(最大= 9,最小= 2)样本存储在18°C和−−70°C,分别。首次样品细菌负荷调整之前,中位数生存天是549(最高1016,最低= 124)和740(最大= 1042,最小= 112)为样本存储18°C和−−70°C,分别。这种差异具有统计学意义(P< 0.01;表1)。调整后首次粪便样本细菌负荷、温度效应并不显著(P= 0.084)。同样,冻融循环的数量的影响在地图生存能力不存在统计学意义(P =0.71),因此不包括在最终的模型。总体估计的优势比细菌冰箱里每个月减负荷为1.13 (95% CI 1.01和1.20)每月在冰箱里;因此,一个样本的概率从moderate-low可行性降低细菌负荷或从低-细菌负荷每月13%。因为比例优势模型没有聚合温度的存储时间的交互时,分析被储存温度分层评价的影响时间几个月的概率减少一类细菌培养的结果。类似的比例优势模型用于样品存储的完整数据集分别是安装在18和70−−。模型的结果表明,降低一类细菌培养结果的概率为13% (95% CI 8.3 - -19.4;或= 1.13 95% CI 1.08 - -1.19)样品存储−18 - 14.7% (95% CI 22.4−-70.4;或= 1.15 95%可信区间0.78 - -1.70),样本存储在70−,由最初的细菌培养结果调整后的模型。
5。讨论
当前的研究代表了地图的长期生存能力的第一评价粪便样本中自然感染牛当储存在18°C和−−70°C,使用相对较大的样本容量和存储两年多的时间。之前的研究使用了一个小样本大小(在一个短的时间内9- - - - - -11]。在我们的研究中,地图中幸存下来在−18°C(即平均540天。,18个月)。这段时间足以让低容量实验室以及实验室没有−70°C冰柜执行映射测试和研究的能力。我们的研究表明,整体映射在长期生存能力没有明显受到冻融循环的数量相比,存储时间。然而,它是可能的,在一个更大的样本量,将产生巨大的影响评估。在这项研究中使用的方法,然而,并非旨在解决冻融的具体问题。作者承认大多数准确评估冻结解冻,整除应在研究的开始,一些整除会受到冻融循环而另一些则连续冻结,直到文化的日期。
给长期生存在这两个温度,这可以缓解长期研究样本管理使用−18°C或−70°C。然而,重要的是要考虑我们的抽样目标高细菌负载奶牛棚友和结果可能不适用于中度棚友,在常规群测试期间更常见。进一步的研究需要在更大的样本量中度细菌负荷的粪便样本,以确定长期储存这些样本是一个可行的选择。在冻融循环在我们的研究中不完全模仿这些周期的性质,我们的研究结果提供额外的证据映射到生存能力的极端环境条件在农场。重要的是要考虑到每日的循环冻融在北半球的高纬度地区很常见。
虽然明显倾向于减少地图观察生存能力随着时间的推移,在目前的研究中,几个样品导致增加细菌负荷连续两个文化之间。我们没有一个明确的解释缺乏可重复性,但这是似是而非的粪便样本同质性是不一样的在每一个样品处理,或许是由于非均匀分布的地图内的样本。然而,这是与之前报道的研究表明,地图可耕种的数量相对均匀的分布从亚临床和临床动物粪便样本获得13]。然而,作者并没有量化粪便细菌负荷是在当前的研究中。
比例优势模型(也称为有序逻辑回归)被选为分析数据,因为结果粪便文化通常分类类别(负,低和高)而不是平均每管的殖民地。这个分类系统提供了信息不仅牛的脱落状态,也是疾病传播的风险。这种类型的模型的一个重要假设为每个级别的几率的比例结果粪便文化的结果。这个假设最初评估使用卡方测试分数和策划自己的胜算的固定效果。数据也可以使用名义logistic回归分析,没有假设的可能性的比例;然而,这种类型的模型需要更大的数据量,因为更多的参数需要估计。在我们的模型中,我们测试了最初的文化的影响的结果在随后的概率减少细菌培养(响应0,1,2)。样品细菌高负载后的第一个粪便文化收藏有较高的概率减少地图浓度比样品moderate-low初始细菌负荷。换句话说,细菌死亡的比例必须发生,以减少粪便培养细菌负荷从moderate-low -小于细菌死亡的比例必须发生,以减少粪便细菌负荷从高到moderate-low文化。因此,减少文化的几率更高moderate-low最初细菌负荷的文化。而最近的一项研究不同温度和运输方法,解决不同初始细菌加载不解决(10]。此外,我们的分层分析表明,减少地图可行性加班的几率显著样本存储在−18°C但是不重要样本存储在−70°C。这是一个重要的事实时要考虑使用冰箱被认为是研究是否或诊断。
目前的研究是一个自然实验,和设计的缺点是在分析解决。然而,这项研究的主要弱点是缺乏恒定的时间间隔重复文化之间,不同数量的样品是用于两个存储温度。然而,我们相信,缺乏持续的时间间隔是解决统计模型使用一个随机拦截的储存时间,因此并不影响这项研究的结果。同时,有针对性的抽样方法是用于研究和从牛不是随机选择的样本。然而,我们不认为这影响了研究结果,因为这项研究的主题是动物的地图生物独立了。此外,克服偏见的估计可能由于非随机分配之间的样本两个治疗,我们包括最初的文化变量的结果为非随机分配控制/调整基于最初的粪便样本文化的结果。尽管在我们的分析,我们控制了可能的认识偏差,通过调整这些变量,无法控制的研究设计,是不可能控制随机分配等未知来源的偏见。
总之,这项研究表明,地图可以长期生存(中位数约18个月)18°C和−−70°C和生存都存储温度之间的差异不具有统计学意义。不过,地图在样本存储在−70°C显示趋势的两倍(或= 2.2)再生存所产生的相对较小的样本容量储存在−70°C。这意味着粪便样本可以存储长时间在实验室没有能力处理所有样品一次或者一个实验室没有−70°C冰箱。此外,这项研究的结果是一个额外的迹象表明地图有能力在极端环境条件下生存很长一段时间,可以发现在许多奶牛场和农田。然而,我们的研究表明,这种能力取决于最初的细菌的粪肥。未来的研究需要解决生存地图初始细菌负荷较低(0.25 -10 CPT)和执行分析使用实数(连续)CPT而不是直言文化的结果,这将决定每个治疗的存活曲线对存储时间。