抽象性

现场检测mycobctiuma子sp.paratuberculosis用于诊断和研究复发论文的目的是通过直接原位PCR检测介合组织样本中的该代理技术用8头自然受感染牛和1头健康小牛的ileum或ileocacal淋巴样本实施,使用p89和p92素数扩展IS900序列在所有阳性样本中检测到中度阳性信号,非负控件,但由于酶处理和高温解析,组织结果在许多情况下受到影响虽然技术对地图检测有用,但信号比免疫史化学低,原因可能是定点过程在一个实例中,信号高点,这可能是检测spleoplasts的结果因此,当别方法产生负或分词检测时,应推荐所述方法

开工导 言

mycobctiuma子sp.paratuberculosis发作代理器PTB, 也称Johne病影响牛羊和山羊并造成每日和牛肉生产损耗临床特征包括腹泻和减肥,主要病理变化是肠道和内入淋巴结粒发炎一号..此外,PTB疑似与人类Crohn疾病相关,尽管这一假设目前正在辩论2,3..

历史病理学作为一种诊断方法使用,但它也是研究PTB的非常重要工具组织样本检测地图会增加病理诊断值,在实验感染时可能有必要数项技术测试,如Ziehl Nielsen染色化工和原地混合化2,4,5,但他们的性能不同ZN和IHC容易执行并敏感度高4-6,但假负值产生 当感染最近或bacilli稀疏相形之下,它们的特性可被视为低点,因为ZN分辨不出酸快微生物和异菌共生的抗原可能会影响IHC性能两者比较时,ZN便宜一些,但IHC可以检测地图抗原,即使Bacillus消化成宏图另一方面,ISH具体但费用更高,难以执行,解释可能比较困难,因为获取的信号较低5..使用HIS检测地图被认为是有用的,因为它检测出可能与该疾病相关联、ZN或IHC无法检测到的分片(配有细胞墙缺陷的地图形像)2..并检测地图脱氧核糖核酸可能有用 当IHC和ZN阴性

原位PCR(ISP)由组织样本中单列脱氧核糖核酸序列放大组成被描述为非常敏感和特殊技术并用于诊断或研究多项疾病与PTB相关,用ISP方法并继原位混合法对绵羊和小鼠组织样本检测地图7,8..直接ISP方法虽然对地图识别有用,但不要求混合步骤应更容易实现据我们所知,dISP成功用于检测感染M.肺结核样本中受影响的健康人体主体九九servey医学地图检测论文的目的是检测mycobctiuma子sp.paratuberculosis组织样本中自然受感染牛用dISP方法固定嵌入

二叉素材方法

2.1.分析样本

使用九头牛的ileum或ileocacal淋巴结样本八对准成年动物 临床标志PTB 和隔离地图粪便另一样本取自一头牛群免变或临床标志,用作负控件组织固定10%形式化解法并嵌入石蜡中相容损耗和酸快巴契里先前通过Hematoxylin和eosin和ZN按例技术染色

2.2.直接SituPCR

组织段2华府m厚度)获取并加载正电滑分解方法为保留18h摄氏60摄氏30摄氏度、室内温度绝对乙醇(RT)、75%乙醇(RT)、50%乙醇(RT)、25%乙醇(RT)和水(RT)。取0.02 mol/lHCl室温渗透10分钟,后加0.01%tritonx-10090sportins用1 mg/L蛋白质k(Gibco,Paisley,UK)在37摄氏30分时耗竭,该介质因在微波中煮15秒而失效异性碱化磷化物立即浸入二成乙酸

PCR由50ml1X反应缓冲区(Gibco、BRL)、1.5Uaq聚合器2mmol/LMgCl2、40mol/LdNTP、0.2mol/LdUTP贴上digoxigenin标签(Behringer Mannheim,Lewes,UK)和60pgM.avium子sp.paratuberculosis插入序列素数初级词为p89(序列5QGGATGTGTGTGTGTGTTGTS3QETS5GGGTGCTGTGCAPCGGGGAAT3QETSSHS测试2,5..幻灯片用装配工具封装(Perkin Elmer剑桥市,英国)并安装到触摸下温器中(Hybaid市,Ashford市,英国)。PCR使用下列热回转条件:5分钟958C、35周期948C(1分钟)、64.58C(1分钟)和728C(1分钟)结束728C2分钟PCR产品用碱化磷化绵羊抗体稀释1/500色素5-溴-4-氯-3-3indoly磷酸盐和四合二氮硝化物稀释1/50段反联播核快红控制假阳性时,每个测试段均受PCR并无Taq聚合物

2.3Immunohistochemistry

Imnothis化学程序前描述5..简言之二华府m段获取并安装为正电滑并分解异性过氧化物活性阻塞甲醇中10%过氧化物(20分钟)和抗原恢复法由同文缓冲中湿热处理(121摄C,15分钟)实现(monocryatecate,10mM,pH6)。冷却后,幻灯片浸入TBS缓冲区20分钟(50mMTris-HCl,300mNAClp7.6)。屏蔽步骤执行量(BSA(Promega)2%TBS5分钟)后,40mL反Map抗体稀释TBS1/100反应使用LSAB2显示^R系统(Dako电流系统)和DAB滑动片与Mayer Hematoxylin并用合成介质覆盖

2.4.滑动解析

所有准备都用传统光显微镜观察40X、100X、200X、400X和1000X放大作用,并对所有区域都作比较观察所得结果分类为负数(-)、弱数(++)、中度(++)和强度(++)观察到百度染色 分类为强度

3级结果

3.1.西图PCR

所有受感染样本都显示染色性,即巨形或兰汉斯巨细胞内小蓝点其中大部分置入细胞芯片中,少数置入细胞核中(图解图解图解)1(a)并1(b))信号强度在所有实例中均适中一号)负控制为负,无Taq嵌入式正组织不显示信号

组织形态并非完全保存连通组织没有正确反射,许多细胞核无法清晰观察1(d))几例组织面积中断并从滑动中去除,使得无法解释这些地区的dISP

3.2Immunohistochemistry

所有受感染组织显示在有粒状发炎区进行免疫迭代利欧德和兰汉斯大细胞内有染色体,分布于ialmecosa和submecosa1(c))信号在所有例子中都强烈化,样本6除外,该样本弱(表6)一号)负控件未显示免疫性

组织形态在所有案例都完全保存,解释容易实现

4级讨论

组织样本中检测地图支持病理诊断并允许确定物剂固存实验性疾病4,8..所得结果显示,dISP检测出自然受感染牛中所有形式化固定组织样本中的地图蓝正信号在有病理变化的地区清晰识别 大型词组或兰汉斯巨细胞负控件和阳性样本置入无Taq酶结果为负值,这确认正数样本中获取信号是由于地图的存在

描述方程可能与开发PTB或CD相关联,这些地图形式可用ISH检测2,7..以类似方式,dISP对识别有用,因为它以检测 mycocistialDNA为基础,这一事实比IHC可能提高敏感度。在本文件中,IHC信号在所有例子中均强效化,样本6除外,DISP微弱但中度化这一事实可以用本节检测法解析来解释,前一研究建议此法解析法解析法解析法解析法解析法解析法解析法解析法解析法解析法解析法解析法解析法5..

虽然dISP敏感度描述为非常高九九显示敏感度比IHC低 因为dISP检测信号中度然而,这种染色结果差异可能与DNA损耗相关联,可能发生在定点过程期间,因为定点时间或定点解决办法性质等变量在采样时不予考虑,它们可改变脱氧核糖核酸完整性[10..虽然IHC也可能受定型[11抗原恢复可恢复免疫性考虑到分析样本不是为dISP采集的,固定不受控制,有必要进一步研究评价dISP敏感度

原位混合未在本文件中测试使用dISP获取的信号比前一篇论文报告的SISH弱信号高5..产生差异的原因可能与dISP获取的脱氧核糖核酸放大相关此外,探针大小不影响dISP效率,因为素数和dNTP非常小并常存

特性dISP方法基础放大基因序列s900类序列在其他微生物中描述12,13IS900算作PCR分子检测地图中的黄金标准14..有可能这些序列影响性能,这可能会降低技术特性放大其他更具体的地图序列可减少错配7并需要进一步研究 确定哪个序列提高敏感度避免假阳性诊断

组织形态演化dISP时受到影响这一事实可能与酶消化并多次解析/高温问题相关,因为这一问题没有通过IHC检测到。正因如此,解释后一种比较容易,而受dISP损害的组织则需要重复测试

5级结论

dISP方法对IS990脱氧核糖核酸序列成功用于填充组织样本中的地图检测,这些样本取自自然受感染成年牛信号小于IHC, 需要进一步研究确定技术敏感度和特性前文HIS描述,dISP检测地图脱氧核糖核酸应有益于检测speoplasts组织结构受到影响,开发比IHC难基于这些事实,该方法应在IHC检测不到地图或检测组织样本中相容变化频谱后使用

感知感知

作者感谢María del Carmen Tagle、Claudia Moreno和Daniel Funes提供神学支持,Gimena Rodrigue、Gloria Jauregui和Mariana Falabela提供论文评审