文摘

Lipoarabinomannan (LAM)是一个主要glycolipidic抗原在分枝杆菌信封。本研究的目的是描述的体液免疫反应引起的免疫LAM提取牛和评估的作用生成的抗体的在体外感染的巨噬细胞鸟型分支杆菌无性系种群。副结核(地图)。从14小牛血清免疫与LAM提取或PBS弗氏不完全佐剂乳化,从五个paratuberculosis-infected牛进行了研究。LAM-immunized小牛开发特定的抗体与IgG1主要同形像。血清免疫球蛋白被孤立,他们的影响在地图摄入和可行性检查化验使用牛巨噬细胞细胞系。我们的结果表明,林所产生的抗体免疫显著增加地图摄入,减少其细胞内的可行性,表明一个积极作用模型。

1。介绍

副结核是一种慢性肉芽肿性肠病影响反刍动物。病原体,鸟型分支杆菌无性系种群。副结核(地图),进入口头,穿过肠道屏障,固有层中被巨噬细胞吞噬。这些细胞作为细胞内的站点地图的生存和繁殖1,2]。几项研究进行了评估MAP-macrophage交互,由于它的重要性在副结核发病机理3]。已经证明,参与各种受体的内吞作用分枝杆菌(4,5),不同航线的入口可以改变细胞内病原体的命运。例如,结扎为Fc受体部分免疫球蛋白(货代)通常是伴随着呼吸爆发的激活(6),和成熟的吞噬溶酶体7),而吸收由补体受体发生在缺乏促炎症信号(8]。

一般来说,对分枝杆菌感染的体液免疫反应被认为是nonprotective。然而,证据B细胞和抗体的积极作用在某些细胞内感染已经积累了在过去年(9- - - - - -15]。至于副结核,接受,体液免疫反应出现在感染后期,可能与疾病的发展从亚临床临床阶段16]。然而,很少有作品建议抗体可以提高一些免疫机制对地图。最近的一份报告已评估的效果免疫血清在地图上巨噬细胞相互作用表明积极作用的抗体(17]。此外,我们曾报道,纯化特定抗体地图可以提高MAP-macrophage交互在体外和提高核的激活因子NF -κB在感染细胞(18]。

Lipoarabinomannan (LAM)是主要的glycolipidic抗原在分枝杆菌信封和分子量约为40 kDa。其结构致病性分枝杆菌呈现相似性和差异与林不致病的属的成员(19,20.]。林在分枝杆菌发病机理中的作用已经研究了不同的研究小组21,22]。抗体林已被证明是有益的被动保护实验小鼠肺结核模型(10]。至于副结核牛,血清学反应对这种化合物被广泛研究以提高诊断。然而,对感染和LAM-specific抗体的作用,据我们所知,没有发表关于这个主题的报告。

这项工作的目的是描述的体液免疫反应引起的免疫LAM提取牛和评估的作用生成的抗体的在体外感染的巨噬细胞与地图。

2。材料和方法

2.1。林提取

鸟型分支杆菌无性系种群。鸟结核(MAA)增长日志阶段Dorset-Herley介质,heat-inactivated和a . Bernardelli博士提供的请(Servicio Nacional de Sanidad动物、阿根廷)。细菌颗粒离心和resuspended PBS(不₂阿宝₄3毫米,Na₂HPO₄7.5毫米,氯化钠145毫米,pH值7.2 - -7.4)进行进一步的声波降解法。林是提取总额的5.2 g细菌根据其它地方描述的方法之前23和适应我们的实验室条件24]。碳水化合物的浓度是由phenol-sulphuric酸法(25用葡萄糖作为标准。蛋白质含量是由布拉德福德法(26)使用牛血清白蛋白作为标准。从这些数据,除蛋白质的比例达到估计作为LAM提取总蛋白数量×100 /初始总蛋白量。林提取以sds - page,沾Bio-Rad银染色(Bio-Rad实验室Inc .)、大力神、钙、美国)改性碳水化合物检测(27]。电泳中执行Mini-Protean II (Bio-Rad) 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳细胞,遵循制造商的指示。样本包含5μ克碳水化合物/巷是双重的稀释样品缓冲和热处理(85°C, 5分钟)在运行(2 h 96 mV)之前。一个使用的anti-LAM ELISA进行结核分枝杆菌单克隆抗体(mab CS-35)和净化结核分枝杆菌林模式(j . Belisle博士提供的试剂都是善良的,科罗拉多州立大学,柯林斯堡有限公司,美国)。平底的96孔聚苯乙烯板(他一一Microlon,他一一Bio-One北美公司,梦露,数控、美国)被涂上一层LAM提取或林模式在25岁μ克碳水化合物/。一个HRP-conjugated antimouse免疫球蛋白(KPL科克加德&佩里实验室Inc . Gaithsburg,医学博士,美国)使用的稀释1:500。开发板使用ortho-phenylendiamine盐酸盐(门诊部当Sigma-Aldrich Corp .,圣路易斯,密苏里州,美国)在citrate-phosphate缓冲区(Sigma-Aldrich)。反应停止后10分钟的50μL / 1 M硫酸,和盘子被读入一个OpsysMR分光光度计(美国弗吉尼亚州Chantilly丹尼克斯技术)。结果表示在ELISA单位(欧盟),获得的估计为平均光密度值在每个样本490海里(OD)×100 / OD -控制。在这种情况下,一个无关紧要的马伯测试-控制。

2.2。动物和样品

总共14个5个月大的荷斯坦牛结核病-和paratuberculosis-free牛群从阿根廷的潘帕斯草原地区被放养在野外条件下在所有的实验时间。小腿被随机分配到林集团(),皮下注射收到2毫克的LAM提取溶解在1毫升的PBS和乳化1毫升的弗氏不完全佐剂(FIA Sigma-Aldrich)和正常对照组(NC组,),这与1毫升的PBS mock-immunized乳化FIA的1毫升。第一次免疫收到天0和助推器35天后。采集的血液样本在0到65天。这个实验的批准和监督下执行机构的实验动物保健和使用委员会Facultad de Ciencias Veterinarias布宜诺斯艾利斯大学的阿根廷。

血清样本从五个自然感染牛副结核的临床体征包括在当前的研究中感染对照组(IC组)。诊断证实了粪便的文化和放大900年从孤立的殖民地片段PCR (28]。

2.3。评估对林提取体液免疫反应

2.3.1。ELISA

盘子是涂层(4°C, 2天)与LAM提取(25μ克碳水化合物/在PBS),洗了三次与冲洗缓冲(PBS渐变20 0.05%)和阻塞阻止缓冲区(0.05%渐变20到10%脱脂奶在PBS)。所有后续孵化项目在37°C进行1 h和每一个之后,盘子和冲洗缓冲洗了三次。特定的抗体水平的比较,欧盟的血清样本稀释1:100年阻止缓冲区测量。一个HRP-conjugated山羊antibovine免疫球蛋白(KPL)中添加1:1000稀释。为特定的同形像评价、HRP-conjugated羊anti-bovine IgM, IgG1,和IgG2抗体(美国Behtyl实验室Inc .,蒙哥马利,TX)稀释1:300年,兔子antibovine IgG3抗体(18]稀释1:500紧随其后HRP-conjugated山羊antirabbit免疫球蛋白(KPL)稀释1:1000。盘子是如上所述。结果表示在欧盟,使用正常控制血清阴性。

2.3.2。免疫印迹

描述生成的特异性抗体,免疫印迹进行使用LAM提取抗原。在硝化纤维膜电泳转移(Trans-blot传输介质,Bio-Rad)进行后Trans-blot SD细胞(Bio-Rad)制造商的指示。膜在阻断缓冲区,然后孵化与牛血清稀释1:250。随后,HRP-conjugated山羊anti-bovine免疫球蛋白(KPL)中添加1:1000稀释。开发的反应是使用0.5毫克/毫升轻拍(合显色试剂3,3′-diaminobenzidine, Bio-Rad)和1μH L /毫升₂O₂100卷。在TBS缓冲区(20毫米三、500毫米氯化钠,pH值7.5)10分钟。孵化项目都在37°C 1 h,和每一步之后,三个洗冲洗缓冲。为了证实对非蛋白特异性分子,蛋白水解治疗LAM提取0.2毫克/毫升蛋白酶K (Amresco Inc .)、梭伦,哦,美国)在运行sds - page之前,执行所述由Reichel et al。29日]。所有血清进行免疫印迹分析消化和未消化的林精。消化控制,1毫克/毫升卵白蛋白(卵子,Sigma-Aldrich)解决方案在相同条件下与蛋白酶K孵化LAM提取。消化和未消化的卵子评估超免疫牛血清对卵。

2.4。沉淀和净化的抗体

从LAM-immunized两只动物的血清抗体,感染,分离、纯化和正常对照组为进一步使用功能分析。血清在56 heat-inactivated°C为30分钟。饱和硫酸铵沉淀(44%)获得沉淀免疫球蛋白(Igs)执行。然后,净化通过G蛋白亲和色谱法(蛋白质G-agarose Exalpha生物制品,雪莉,妈,美国),和纯化Igs。为了检查纯度的Igs分数,sds - page电泳进行。布拉德福德Igs的浓度估计的方法,考虑的百分比gamma-globulins探测到光密度分析的电泳。Igs分数被0.22过滤μm和储存在-70°C到使用。

2.5。抗体的功能评价

这些实验进行使用SV40-transformed牛腹膜巨噬细胞细胞系(Bomac) [30.]。rpmi - 1640年Bomac细胞培养介质(GIBCO,英杰公司集团,Carlsband、钙、美国)补充了50μg / mL庆大霉素(Sigma-Aldrich)和5%胎牛血清(英杰公司)在37°C和5%的公司₂。K-10地图参考菌株(31日),f博士提供的慷慨Paolicchi(西班牙de Tecnologia Agropecuaria,阿根廷),生长在麦德布鲁克37°C 7 h9肉汤(Difco BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)albumin-dextrose-sodium氯含10%,0.05%渐变80 (Sigma-Aldrich),和2μg / mL mycobactin J(联合监测公司,菲也特,密苏里州,美国)。滴定法是由连续稀释和播种到7 h9琼脂板上。股票离心机和冷冻−70°C的15%甘油的媒介。在使用之前,地图是解冻和培养过夜37°C,然后离心,分解通过25针通道,和resuspended RPMI媒介的最终浓度10⁹集落形成单位(CFU) /毫升。感染复数被设定为10:1(细菌:细胞),抗体在100年最终的浓度μ克/毫升。

2.5.1。摄取试验

Bomac细胞(1×10⁶可行的细胞/毫升)被播种到20毫米×20毫米无菌盖玻片,可以坚持2 h和隔夜RPMI中孵化。细菌与沉淀Igs调理(100μ从LAM-immunized g / mL),感染或正常控制牛,在37°C 1 h瓶。立即接种层之前,细菌悬液分解如上所述。MAP-macrophages交互被允许了45分钟。细胞被洗冷PBS,用0.37%甲醛固定,与Ziehl-Nielsen染色。至少100个细胞/盖玻片浸领域的计算由光学显微镜(1000 x)。吞噬细胞的百分比(% PhC)和内化地图在每个细胞中发现的平均数量(iMAP)记录。吞噬指数(PI)被计算为% PhC×iMAP [32]。

2.5.2。细胞内的可行性分析

评估的可行性摄取地图,Bomac细胞(1×10⁶可行的细胞/毫升)被播种到24-well组织培养板和37°C在5%孵化有限公司₂。细菌是调理和分解如上所述。然后,接种到Bomac文化,一式两份。2 h后,单层膜与PBS和一个洗每个复制的细胞溶解了0.2%钠dodecylsulfate首次CFU计数。其他复制是孵化RPMI中含0.1毫克/毫升庆大霉素(2 h,以避免污染33),代之以不使用媒介。感染巨噬细胞培养了72 h,然后最终CFU计数细胞溶解。溶菌产物是连续镀h9琼脂培养7日在37°C 5周直到CFU计数。结果表示为生存能力变化百分比(最终CFU /初始CFU×100)。此外,一个FcR-blocking试验进行了描述Manca et al。34]。Bomac细胞preincubated 1 h和100μg / mL的蛋白质G-purified Igs从正常控制牛heat-aggregated。

2.6。统计分析

数据分析统计意义使用STATISTIX 8.0软件。使用方差分析之后,图基的测试除了同形像的分析。在这种情况下,克鲁斯卡尔-沃利斯检验两两比较运行紧随其后。是水平的意义值< . 05。

3所示。结果

3.1。表征LAM提取

我们获得了一个包含105毫克的总碳水化合物的提取。蛋白质的存在在很大程度上减少(46.8毫克的蛋白质最初和0.4毫克的残余LAM提取),因此显示蛋白质的99.2%的比例。sds - page结果证明了林提取主要是由碳水化合物组成的混合物,所揭示的存在许多乐队当银染法进行修改。事实上,主要组件迁移类似结核分枝杆菌林(图2(一个)巷1和2)。正如所料,从MAP-infected对照组血清识别MAA的LAM提取(图2(一个),莱茵3)。马伯CS35-ELISA,林提取的结果欧盟,而对于纯化肺结核林欧盟。这些结果显示LAM致病性分枝杆菌之间的交叉反应。

3.2。对林提取体液免疫反应

对林提取血清的反应是评估和特定抗体的水平测定同型的概要文件。所有的小腿林组生成一个特定的体液免疫反应,血清抗体水平在1:100稀释欧盟在180年和790年之间。可比水平被发现感染对照组(范围从180年到723年,欧盟)。至于同形像的分析,具体IgM的存在,IgG1, IgG2,并从LAM-immunized IgG3评估在血清,感染,和正常控制牛。我们不能检测特定IgM (LAM组欧盟,集成电路组欧盟、NC组101.6±8.1欧盟)。获得的结果为特定IgG1、IgG2 IgG3图所示1。的体液免疫反应LAM-immunized牛主要是由与小IgG2和IgG3 IgG1,尽管统计上显著差异被发现时,他们三人与正常对照组比较()。在感染对照组,发现了类似的趋势,IgG1作为唯一的同形像与水平显著高于正常对照组。

血清也对林测试通过免疫印迹试验(图中提取2 (b))。LAM-immunized小腿,只有一群分子量25至50 kDa被检测到。这个乐队保持在同等强度提取蛋白酶解后,展示(图涉及的非蛋白抗原的性质2 (b)D与UD车道)。

3.3。功能性抗体的影响

沉淀和净化Igs获得(图3 (b)盒子)被用于功能化验。

影响地图摄入
如图3(一个)调理素作用的地图与特定的抗体增加细菌的摄入。抗体LAM-immunized和感染控制牛显示吞噬指数明显高于()比获得当调理的地图与正常控制抗体(吞噬指数为59.4,61.5和33.2,分别地)。

影响细胞内生存地图
进行了化验调理的地图与沉淀抗体,林集团Igs显著降低()的比例地图生存能力,而获得正常和感染控制Igs调理素作用(图3 (b)(1))。

地图与纯化Igs调理的时候,可比性和可重复的结果LAM-immunized和正常对照组()。感染对照组,结果是相似的Igs LAM治疗组。预培养的巨噬细胞聚集Igs(货代封锁)导致显著增加地图的可行性从林组与抗体的效果没有之前的孵化与聚合Igs ()(图3 (b)(2))。这一结果表明,调理素作用的效果观察与林集团Igs FcR-mediated。

4所示。讨论

在目前的工作中,我们检查了牛的免疫反应诱导免疫LAM提取和生成抗体的效果在MAP-macrophage交互。

我们MAA用于LAM萃取代替地图由于抗原之间的同源性(29日),前者的文化更快的增长。除此之外,我们的ELISA和免疫印迹结果支持交叉反应在分枝杆菌糖脂前所述[19,20.,29日)和显示,林的方法提取应用保存其抗原性。据我们所知,这是第一次报告的使用分枝杆菌LAM提取牛免疫。使用免疫协议,我们能够诱导高水平的特定抗体的免疫球蛋白增加同形像的优势IgG1在大多数研究了小牛。IgG1也检测到的主要同形像感染对照组。类似的反应对林曾描述与临床副结核牛35]。考虑到这个同形像代表最相关的免疫球蛋白在牛乳腺分泌物(36),当地的存在特定IgG1可能相关的初生牛犊的被动保护。

调理素作用的影响与抗体在地图之前吞噬作用和细胞内生存能力评估(17,18,33,37,38]。然而,报告已经出版一般根据化验血清总在哪里检查的抗体。在许多其他血清组件具有调理素的活动和可能影响细胞内生存能力的细菌,我们纯化Igs功能评估。净化方法的应用是成功的。然而,一个沉重的乐队在sds - page,可能对应于不完全的存在降低了Igs分子,反应所显示的antibovine IgG抗体(数据没有显示)。

我们发现Bomac细胞的吞噬水平增加了双重的地图时调理与抗体LAM-immunized或受感染的牛。MAP-phagocytosis增强Bomac超免疫血清之前已经报道过的细胞(18)和牛血monocyte-derived巨噬细胞(BMDMs) [17,37]。噬细胞水平检测到这是与那些由吴等人发表Bomac细胞(38),虽然我们的描述指标低于BMDM当摄入地图(17,37]。其中,地图吸收动力学评估检测到显著增加摄入水平60到120分钟后的孵化17,37]。考虑到这些观察,可能较低的吞噬指数检测到这里可能与MAP-macrophages孵化时间短或使用代替BMDM Bomac细胞系。

有争议的结果在可行性分析调理的地图与整个从健康和受感染的牛血清发表(17,37,38]。在我们的模型中,调理素作用沉淀Igs从正常和感染牛对地图生存能力显示了一个有益的影响。然而,我们发现不同的结果当沉淀和净化Igs从受感染的牛被用于调理素作用。存在其他调理素沉淀Ig分数,如collectins、c反应蛋白,或纤连蛋白,可以解释不同的发现39- - - - - -41]。值得注意,我们的结果表明,林免疫引起的抗体可以显著降低细胞内的可行性地图。

这些结果质疑的生物相关性林副结核抗体。我们这里发现纯化抗体存在于从牛血清免疫与LAM MAA地图可以减少细胞内生存能力以及抗体临床感染牛从地图。然而,在自然感染,抗体出现晚,可能与疾病的进展。它还有待建立特定抗体目前存在的感染可以修改类结核。

我们的研究结果提供了新的数据基本方面的作用在MAP-macrophage感染的抗体在体外。更多的研究,使用其他地图株,特别是现场隔离,直接从牛和巨噬细胞中,必须以更好的方法进行抗体的作用在自然MAP-macrophage交互发生在主机。

确认

作者感谢VMD劳拉·巴斯和卢卡斯VMD高盛的有用的技术援助。这项工作是支持UBACyT v038(2004 - 2007)和v023 (2008 - 2010)。