预测最有害的错义产生的单核苷酸多态性的Hennekam Syndrome-Causing CCBE1基因,在计算机分析

文摘

Hennekam lymphangiectasia-lymphedema综合症与单核苷酸多态性在CCBE1(胶原蛋白和钙结合EGF域1)基因。几种生物信息学方法被用来寻找最危险的可能影响CCBE1 nsSNPs结构和功能。在网上使用最先进的工具,本研究调查了大部分病原产生的单核苷酸多态性(nsSNPs)扰乱CCBE1蛋白质和细胞外基质重塑和迁移。rs115982879,我们的结果表明,七个nsSNPs rs149792489, rs374941368, rs121908254, rs149531418, rs121908251,和rs372499913 CCBE1中有害基因,四(G330E, C102S、C174R G107D)是非常有害的,其中两个(G330E和G107D)的上下文中从未见报道Hennekam综合症。十二个错义snp, rs199902030 rs267605221、rs37517418 rs80008675, rs116596858, rs116675104, rs121908252, rs147974432, rs147681552, rs192224843, rs139059968,和rs148498685发现恢复到停止密码子。结构同源方法和序列同源工具显示,8.8%的nsSNPs致病性。筛选、PolyPhen2 M-CAP, CADD FATHMM-MKL,丹,豹,突变品酒师,轻轨车,SNAP2识别有害nsSNPs重要的分数。rs374941368的重要性和rs200149541译后变化的预测是强调,因为它可能影响磷酸化的网站。基因基因交互显示CCBE1协会与其他基因,显示其作用的途径和coexpressions。前16有害nsSNPs在这项研究应该作进一步的调查发现在未来研究疾病引起CCBE1基因具体商品。 The FT web server predicted amino acid residues involved in the ligand-binding site of the CCBE1 protein, and two of the substitutions (R167W and T153N) were found to be involved. These highly deleterious nsSNPs can be used as marker pathogenic variants in the mutational diagnosis of the HS syndrome, and this research also offers potential insights that will aid in the development of precision medicines. CCBE1 proteins from Hennekam syndrome patients should be tested in animal models for this purpose.

1。介绍

Lymphangiogenesis是一个过程,帮助淋巴系统的发展。这包括迁移、扩散和出芽内皮淋巴祖细胞系(1- - - - - -3]。间质液体,通常存储在心血管系统中,经常由于不规则Lymphangiogenesis流掉,这排水可引起乳糜胸,胸腔积液,血管扩张,淋巴水肿,淋巴管的乳糜性腹水和各种器官,包括肠道(4]。淋巴管的发育不良的症状通常是保留给四肢(1]。Hennekam综合症是一种遗传异质性疾病。Hennekam淋巴管扩张是一个条件,淋巴系统的紊乱,从而影响各种器官和胃肠道和心包的链接。淋巴水肿了面部先天性畸形和异常的认知功能障碍(5]。约,到目前为止45人被诊断出患有HS综合症(6]。近25%的病人的疾病是影响biallelic突变CCBE1 (Hennekam lymphangiectasia-lymphedema综合征1 (HKLLS1;MIM: 235510))和FAT4 (Hennekam lymphangiectasia-lymphedema综合征2 (HKLLS2;MIM: 616006)),而CCBE 1基因突变(7]。检查两个错义的兄弟姐妹,类型被发现biallelic ADAMTS3基因的突变(8]。在人类和生物模型、信号蛋白胶原蛋白和钙结合域1 lymphangiogenesis所需(CCBE1)。按向前在斑马鱼基因筛查CCBE1诱发编码突变,突变称为完整的流体相脱节,忽略了胸导管的躯干的淋巴管但保留正常的血液脉管系统(9]。错义突变CCBE1基因的蛋白质功能域或上游cysteine-rich域EGF被确认为HKLLS1[的病原体6]。CCBE1基因发挥了重要作用,淋巴系统的增长在一个生物模型(9,10]。然而,FAT4淋巴发展之间的联系还不清楚。随着时间的推移,我们理解相关的表型CCBE1变异进化。原账户,关键不一致程度的认知损害(扩张从正常到中度破坏)显示,Hennekam综合症科目(11]。标本和临床诊断Hennekam综合症有或没有突变CCBE1比较在最近的研究(6]。CCBE1基因与结缔组织的细胞外基质,然后分泌(10- - - - - -12]。斑马鱼往往缺乏淋巴管和胸导管,以及能力发展水肿(9,11]。CCBE1基因的突变证实了这一点。相同的情况下发展水肿是小鼠模型所示(10]。在此基础上,这个基因的突变,这被认为是生物之间的关键基因,与血管淋巴系统功能障碍,导致这样的结论:人类CCBE1突变与广泛的淋巴管发育不良。Aagenaes综合症,一种罕见的基于“增大化现实”技术的状况,也一直与biallelic CCBE1突变。这种罕见的疾病导致新生儿肝内胆汁郁积,极端慢性淋巴水肿没有精神发育迟滞,和淋巴管扩张13]。Aagenaes综合征是常见的治疗儿童和胎儿积水还发现HS患者(13,14]。造成的疾病证明CCBE1支持的罕见突变等位基因的基因引发突变的最新证据。因为他们的种族隔离的表现型AR继承模型,在不相关的生物体,零星的重复和相关的大量的突变,这些突变等位基因可能产生有害的影响15]。分子生物学、统计学、数学、计算机科学和遗传学都属于生物信息学的伞16]。单核苷酸多态性是最常见的遗传变异存在于普通人群(snp)。每一个单核苷酸在修改了整个基因组单核苷酸多态性。有200 - 300 bp在人类基因组单核苷酸多态性,但是有5000个,000个snp在整个人类基因组。这可能导致各种各样的序列变化,从而导致功能异常(17- - - - - -19]。除了其实基因组单核苷酸多态性,产生的单核苷酸多态性(ns SNPs)和氨基酸序列基因产物的变化往往受遗传变异(ns SNPs)。snp没有大型生物的影响,但他们可以披露各种障碍,影响免疫反应等药物,在某些情况下,单核苷酸多态性可以作为疾病的脆弱性(生物标记物20.]。氨基酸序列的变化引起的snp负责报告病例的50%遗传疾病(21]。基因表达和转录因子结合也影响和地区以外的基因启动子区域(22,23]。单核苷酸多态性有至关重要的作用在决定一个人的各种疾病易感性和药物反应(snp)。snp导致疾病被发现生物通过一个简单的过程,所以它是至关重要的,我们发现他们之前使用遗传学技术作为一种工具(24]。对齐方法基于树结构矩阵和数据计算中使用的工具。最近的结果,如(25,26),表明基于散列函数可以加快整个过程。本研究的目的是在网上使用各种方法基于不同的概念研究的潜在有害影响nsSNPs CCBE1基因和蛋白质。这项研究的目的是提供一个有价值的工具,用于快速且经济有效的筛查病理nsSNPs,而不是生物实验验证。

2。方法

2.1。SNP检索

Entrez基因在国家生物信息中心的网站(NCBI)从数据的收集人类CCBE1基因。SNP的信息(加入蛋白质数量和SNP ID)从NCBI dbSNP CCBE1基因的获得(http://ncbi.nlm.nih.gov/snp/)和SwissProt数据库(http://expasy.org./)。也有搜索其他数据库作为外显子组聚合财团,基因组变异服务器,F-SNP再确认产生的SNP (nsSNP)数据CCBE1基因(27]。数据库访问:2020年7月3日。

2.2。GeneMANIA

检查CCBE1基因之间的相互作用和观察的协会与其他基因预测nsSNPs其他相关基因的影响,GeneMANIA (https://genemania.org/)和字符串(https://string-db.org/cgi/)(2020年7月6日通过使用手动搜索框中搜索CCBE1) (28]。预测的基因基因交互GeneMANIA交互是基于路径的基础上,colocalization, coexpression蛋白质域相似,基因和蛋白质的相互作用。预测字符串仅限于十大最好的互动与参数,包括基因融合基因,同现,coexpression,试验和生化数据。这些数据显示出综合得分为每个基因的相互作用与目标基因的范围从0到1,0为交互和最低1时最高的互动。因此,CCBE1提出了作为我们生成输入基因和基因基因相互作用网络。

2.3。用于nsSNP预测工具

2.3.1。序列同源性工具(筛选)

对于每个序列的查询,筛选需要引用SNP ID和序列的查询使用多个密切相关的信息来预测容忍和破坏性的替换29日,30.]。它告诉替换是否容忍在那个位置。2020年7月6日使用的工具。

2.3.2。PolyPhen

(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)PolyPhen预测通过使用特定的经验规则的影响氨基酸替换的蛋白质的结构和功能。蛋白质序列、氨基酸的位置,加入数据库ID /号码和氨基酸变异细节PolyPhen的输入(31日),得分计算变异和野生型氨基酸之间的区别。2020年7月6日使用的工具。

2.3.3。分析和识别最具破坏性的snp

许多算法的预测功能影响确认产生的单核苷酸多态性(nsSNPs)。这些算法筛选[29日,30.],PolyPhen2 [31日],PROVEAN [32),M-CAP,轻轨交通、元SVM MetaLR, FATHMM-pred, FATHMM-MKL-coding-pred,突变评估员,VESST3 CAAD单恩突变,品酒师,VarCARD [33,SNP-GO PhD-SNP和豹34,35],SNAP2 [36]。这些工具被使用从8到2020年7月25日。

2.4。预测疾病相关的氨基酸替换,MutPred表型

网络服务器MutPred (http://mutpred.mutdb.org/)作为搜索工具用于预测相关的疾病的分子基础与氨基酸替换突变蛋白(37]。它使用多个属性相关的蛋白质的结构、功能和演化。有三个服务器使用,PSI-BLASAT、筛选和配置文件,包含了与TMHMM MARCOIL, DisProt算法。这些都是一些结构破坏的预测。更大的预测精度达到通过结合所有这些分数的三个服务器。

2.5。突变蛋白的稳定性预测由于iStable snp 2.0

氨基酸替换是由错义SNPs和可以改变天然蛋白的稳定性从而导致蛋白质的影响,最终导致疾病(38]。由metaclassifier iStable 2.0,我们预计变化由于错义snp的蛋白质的稳定性。这个metaclassifier使用机器学习和调查的增加或减少稳定蛋白质。发生由于氨基酸替换基于预测的示例(I-Mutant2.0、CUPSAT PoPMuSiC, AUTO-MUTE2.0, SDM,二重奏,mCSM,大师,和SDM2)和3循序型(I-Mutant2.0、MUpro iPTREESTAB)稳定的预测的工具。效率PDB FASTA格式的代码或蛋白质序列作为输入,但结构预测达到更好的性能比序列预测。在web服务器上,http://ncblab.nchu.edu.tw/iStable2可以发现,iStable 2.0。

2.6。守恒的残留物和序列图案的识别

human-CCBE1蛋白质序列UniProt显示标示比较最多100序列,并抨击反对UniProtKB / SwissProt在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。执行,另一个序列的计算分析,Clustalω。调查显示超过50%的身份和价值在1 00 e-20 [39]。确定的氨基酸被Clustal颜色,颜色和对齐位置保护指数Jalview[提供的40]。

2.7。预测的氨基酸保护ConSurf (ConSurf.tau.ac.il)

贝叶斯经验推断是用来计算进化谈话在序列的蛋白质的氨基酸序列。这个推理是给我们保护成绩以及方案的颜色。变量氨基酸得到分数1,而最保守氨基酸分数9。ConSurf分析提交CCBE1 FASTA序列的蛋白质(41]。

2.8。希望工程

分析结构的影响目的突变是由网站希望工程。与UniProt合作和DAS服务器的预测,希望工程显示了突变蛋白在一个可观测的三维结构。希望工程是蛋白质序列作为输入源,然后执行野生型氨基酸结构的比较(42]。

2.9。由NetSurfP二级结构预测

完全折叠蛋白质识别交互接口或活跃的网站是必要的氨基酸溶剂的表面和可访问性的知识。当氨基酸替换这类网站注意到,被绑定的亲和力干扰(43]。亲和力也被一种酶是一种蛋白质时催化活性。表面和溶剂可及性、结构失调、骨干二面角角度,和二级结构,氨基酸残基,可以有效地估计netsurf - 2.0。利用蛋白质序列FASTA格式作为输入。他们招募深层神经网络训练解决蛋白质结构(43]。netsurfp - 2.0在网站的可用性http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/。

2.10。3 d蛋白质结构预测

3 d同源建模工具,可以预测3 d模型的蛋白质被称为Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/∼phyre2 / html / page.cgi ? xml: id =指数)[44]。有生成的3 d模型与其23突变体与野生型CCBE1最有害的nsSNPs。TM-align (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/TM-align/野生型CCBE1)是用于比较和选择的突变体。有预测TM-score(模板造型评分),RMSD(均方根偏差)和结构叠加。TM-scores提供的范围从0到1,1是确定为一个更高的结构相似。更将突变体和野生型结构之间的差异,将RMSD值越高(45,46]。I-TASSER深造的3 d蛋白质结构研究(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSE%20R/),提交3 RMSD较高的突变体与野生型CCBE1 [47,48,49]。嵌合体v1.11被用来研究分子特征和可视化交互产生的蛋白质结构(50]。

2.11。天车网站预测

文章翻译修改(天车)应承担的蛋白质是用来预测蛋白质的功能。GPS MSP v3.0设备(http://msp.biocuckoo.org/online.php)是用于谓词的甲基化网站CCBE1蛋白(51]。剩余头寸的丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸在CCBE1序列的蛋白质磷酸化预测的网站是由使用全球定位系统(GPS) 3.0 (http://gps.biocuckoo.org/online.php)[52)和NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)。神经网络采用3.1 NetPhos乐团,创建一个阈值为0.5,预测更具体的结果比GPS 3.0 [53]。有一个预测残留有得分高于阈值应该磷酸化。在CCBE1 ubiquitylation站点的预测蛋白质使用BDM酒吧设备(http://bdmpub.biocuckoo.org/prediction.php)和UbPred (http://www.ubpred.org/)。UbPred选择平衡截止(37]的赖氨酸残基被预测ubiquitinated以上得分0.62阈值(54]。NetOglyc4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOG%20lyc/)预测糖基化,这是另一个非常重要的转录后事件(55]。NetOglyc4.0的网站分析蛋白质与氨基酸序列替换和野生型蛋白序列。突变是功能上明显有区别功能模式时突变类型和野生型。有糖基化网站的预测评分高于阈值0.5将糖化。

2.12。配体结合网站预测由FTSite服务器

(http://FTSite.buedu/)服务器FTSite预测蛋白质三维结构的配体结合位点。这个网站是基于能量的预测,确定绑定网站超过94%的载脂蛋白。预测的热点,配体结合使用PDB数据作为输入。

2.13。统计分析

计算在计算机工具预测受到相关分析使用SPSS第23节和MS excel。各种计算工具预测意义使用学生的差异进行了比较t以及。一个价值<0.01被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。探索使用dbsnp / NCBI所需的基因

CCBE1基因SNP在NCBI数据库中数据搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。它总共包含73845个snp,在场智人407被发现产生的地区(错义),和156年在同义如图1。

3.2。GeneMANIA

CCBE1基因提供指令的细胞外基质蛋白的蛋白质晶格和其他分子。CCBE1蛋白参与淋巴系统的形成。具体来说,CCBE1蛋白质帮助指导未成熟的细胞称为lymphangioblast成熟(分化)和运动(移民),最终形成淋巴管的衬里(上皮)。我们的研究结果显示,CCBE1 coexpressed 17基因(COL6A6、MXRA8 PLEKHF2, RPRM, CDH4, PLEKHG1, CAND1, MY010, LRRC4C, LRAT, ANK3, OLFM1,宽带,NEURL1B, PLEKHH2, GLTSCR2,和NDRG2)和共享域只有2基因(PLEKHH2和宽带),物理交互有两个基因(SIAH2和TOX4),和colocalization 2基因(MYRA8和宽带)。字符串的预测结果显示综合得分为每个基因的基因和显示交互与FLT4 VEGFC, ADAMTS3, GJC2, FLGF, FAM43A, SNX29 PKD2L2, PHF5A。基因预测GeneMANIA(数据的交互2(一个)和2 (b)和表1(图)和字符串2 (c))在图2,分别。

3.3。预测有害nsSNP筛选和PolyPhen CCBE1

总共有407 nsSNPs(错义)筛选找到它们对蛋白质结构和功能的影响。第一步是进行预测nsSNP氨基酸替换。筛选预测nsSNP对蛋白质结构的影响,告诉诱导氨基酸是否容许在那个位置。407 nsSNPs, 23日被发现是有害的公差指数0.00筛选网络,以及预测匹配单元分数的高致病性nsSNPs PolyPhen > 0.5的服务器。11 nsSNPs包含的信息有轻微的等位基因频率(加)。除了T153N、G107D P249S、S19N C75S, C102S, G327 R, C174R, D397Y, R125W, P87W G330E,其他加nsSNPs可能低于1%(表2)。

3.3.1。确认发狂的nsSNP CCBE1不同的工具

15计算机算法被用来确认23有害/破坏性nsSNPs建立筛选和PolyPhen。这些工具被用于确认分析PROVEAN FATHMM,轻轨交通,M-CAP, VEST3,展望,MetaLR,丹,突变评估员,突变品酒师,FATHMM-MKL, SNP-GO, PhD-SNP,豹,SNAP2。十七岁的预测工具单独使用或结合一个工具显示几个预测工具的影响。每个方法都有不同数量的有害的SNPs。筛选分类36和PolyPhen 23 nsSNPs伤害或有害,但PolyPhen没有展示任何破坏性13 nsSNPs筛选归类为有害。截止为> 0.5,SNP-GO透露最少4个snp(17.23%),共有23个筛选,PolyPhen-predicated nsSNPs CCBE1基因破坏或有害,和19为中性。使用SNAP2工具,18(78.26%)(09年有效nsSNPs: SNAP2得分0到50;09年高效:SNAP2得分50 - 100)和05是中性(−SNAP2得分100)。有害的和破坏性影响的21个(91.23%)nsSNPs 18 nsSNPs可能损害,3 nsSNPs可能损害,2(8.6%)可能良性(时间> 450”可能是破坏性的,“450我的>时间> 200,“可能良性的,”和时间< 200我CCBE1蛋白质),预测使用豹(图1S4)。此外,使用PROVEAN进行了分析,预测了SNP对蛋白质的生物功能的影响。总共有11例(47.82%)nsSNPs CCBE1基因的预测非常有害使用PROVEAN截止>−2.667(图1S4),12 nsSNPs中立。3 nsSNPs高突变评审员谓词,9中,8低,2为中性的阈值> 0.65(−5.545到5.975(更高的分数>应承担更多的损害)。FATHMM-MKL (< 0.5), CADD(> 15),和M-Cap(> 0.025)和各自的分数显示所有23 (100%)nsSNPs有害/有害的。丹的19有害和4与容忍截止(> 0.5)。突变品酒师的阈值(< 0.5)建立21(91.30%)多态而VEST3一样有害和2建立15(65.21%)有害和8容忍截止(< 0.5)。FATHMM得分(> 0.453)建立17 (73.91%)nsSNPs有害和5作为容忍,而轻轨交通的19(82.60%),与分数> 0.001,nsSNPs有害和4是中性的。PhD-SNP显示13(56.56%)有害的SNPs和10个中性的。FATHMM-MKL此外,PolyPhen服务器上,预测匹配高致病性nsSNPs与单元进行评分(> 0.5)。一群4 nsSNPs rs149531418 (G330E) rs121908251 (C102S) rs121908254 (C174R)和rs372499913 (G107D),累计被认为是非常有害的,因为这些4 nsSNPs支持100%的所有最先进的工具只有突变评估员不同意的结果G107D由其他工具。尽管SNAP2同意G330E、C102S和C174R效果,比分是< 50(表1S4)。在预测匹配分析,nsSNPs rs149531418 (G330E) rs121908251 (C102S) rs121908254 (C174R)和rs372499913 (G107D)达成的最先进的工具,PolyPhen(> 0.5),豹(> 450),SNPs&GO(> 0.5),筛选(= 0),突变品酒师(< 0.5),CADD (> 15), MetaLR (> 0.5), M-CAP(> 0.025),豹(可能破坏时间> 450年我可能损害”(450 >时间> 200我,“可能良性”(时间< 200),VEST3(> 0.5),轻轨交通(> 0.001),PROVEAN (>−2.667), FATHMM-MKL (< 0.5), PhD-SNP (> 0.5), SNP-GO (> 0.5), SNAP2(100−(完全中立)+ 100(很强的影响),丹(> 0.5),突变评审员(> 0.65)(−5.545到5.975(更高的分数>应承担更多的损害),FATHMM(> 0.453),且高度有害nsSNPs CCBE1基因。分析407 nsSNPs CCBE1基因预测的致病性nsSNPs几乎是类似的(87%)筛选和PolyPhen而分歧是36%。我们选择深造23 nsSNPs建立有害/破坏性的筛选和PolyPhen。超过100%的重叠之间的相似性观察筛选,M-CAP, CADD, PolyPhen和FATHMM-MKL致病性nsSNPs。相似性SNP-GO PhD-SNP是13%,分歧是73%,而筛选和SNP-GO之间不同是82%。几乎50%以上的预测致病nsSNPs筛选之间被发现是不同意,和PROVEAN SNAP2,豹,MetaLR,突变评估员,FATHMM VEST3, MutPred。此外,这些工具之间的相似之处(SNAP2、MetaLR突变品酒师,丹,FATHMM,和轻轨车)预测的70%以上。有近60%协议致病性nsSNPs预测工具(MutPred, VEST3、PhD-SNP和突变评估员)。所有预测算法的结果是发现统计学意义,是高度相关的。 Student’st以及之间的工具是很有意义的价值<0.001。结果如表所示3以及累积得分和总意义研究的所有工具的图所示1S4。

3.4。保护分析

我们分析了保护的程度CCBE1残留物通过ConSurf web服务器。ConSurf分析的结果表明,23有害的错义snp位于高度保守的区域(7-8-9)。其中23个错义变异,13是位于高度保守的立场:11 (C75S、P87S P290L, A96G, G107D, R118L, G330E, D336N, R125W, Q353R,和T153N)预测功能和暴露的残留物和其他2 (C102S和C174R)预测埋和结构性的残留物。S19N预测守恒和埋残渣,和其他8 (T144M、R167W P249S, R301W, G327R, K355T, D397Y,和D41E)受到残留。结果如图所示3。

3.5。希望工程

所有的23产生的单核苷酸多态性预测是有害的和破坏性的筛选和PolyPhen软件都提交给希望工程软件。研究结果显示,rs149531418替换了甘氨酸(野生型)谷氨酸(突变)在330的位置。突变比野生型更大的残留。野生型残留电荷中性,突变体残留电荷是负的。野生型残渣更疏水比突变体残渣以及突变坐落在一个域,注释在UniProt collagen-like 2,和突变引入了一种氨基酸与不同的属性,可以打扰这个域和废除其功能。我们突变体残渣和另一个残留具有类似属性的类型是观察到这个职位在其他同源序列。基于保护分数,这种突变可能是损害的蛋白质。突变残留高度保守的附近位置。半胱氨酸的rs121908251导致替换(野生型)丝氨酸(突变类型)在102的位置。野生型残渣更疏水比变异残渣。 The variant is annotated with severity: disease, and the mutation is located in a region with known splice variants, described as C- > S (in HKLLS1; dbSNP: rs121908251). The mutant and wild-type residues are not very similar. Based on this conservation information, this mutation is probably damaging to the protein. This mutant residue is located near a highly conserved position. The rs121908254 shows the substitution of cysteine (wild type) into arginine (mutant type) at position 174. The mutant residue is bigger than the wild-type residue. The wild-type residue charge was neutral, and the mutant residue charge was positive. The wild-type residue is more hydrophobic than the mutant residue. The mutation is located within a domain, annotated in UniProt as EGF-like, calcium-binding. The mutation introduces an amino acid with different properties, which can disturb this domain and abolish its function. The variant is annotated with severity: disease, and mutation is located in a region with known splice variants, described as C- > R(在HKLLS1;dbSNP: rs121908254)。突变体和野生型残留并不非常相似。基于此保护信息,这种突变可能是损害的蛋白质。突变残留高度保守的附近位置。rs372499913表明甘氨酸(野生型)的替代天冬氨酸(突变类型)在107的位置。突变比野生型更大的残留。野生型残留电荷中性,突变体残留电荷是负的。野生型残渣更疏水比变异残渣。突变体和野生型残留并不非常相似。 Based on this conservation information, this mutation is probably damaging to the protein. Our mutant residue is located near a highly conserved position. SNP rs147208835 results in the substitution of arginine (wild type) into tryptophan (mutant type) at position 125. The mutant residue is bigger than the wild-type residue. The wild-type residue charge was positive, and the mutant residue charge was neutral. The mutant residue is more hydrophobic than the wild-type residue. The mutant residue was not among the other residue types observed at this position in other homologous proteins. However, residues that have some properties in common with your mutated residue were observed. This means that in some rare cases, your mutation might occur without damaging the protein. The mutant residue is located near a highly conserved position.

3.6。协会的单核苷酸多态性与高度保守的埋(结构)和暴露(功能)CCBE1蛋白质的氨基酸残基

CCBE1从结构的角度表达了作为一个长406氨基酸蛋白质有11个外显子位于18 q21.32。CCBE1序列structural-functional分析使用Clustal Omega-based多重序列比对分析。对于这一分析,CCBE1蛋白质序列(UniProt ID: Q6UXH8)从UniProt检索知识库。CCBE1蛋白质序列是抨击反对UniProtKB / SwissProt条目并使用Clustalω与默认设置一致。Clustalω工具生成的结果由CCBE1蛋白质序列与其他系统关闭序列与其他生物。结果包含一个比色保护分数在1到10的范围。多重序列比对使用Clustalω表明人类CCBE1蛋白质序列包含许多守恒的残留物和主题。的高度保守的氨基酸残基在人类CCBE1蛋白质G262, P264, G265, G270, P272, G273, G276, R284, G285, R315, G317, R322, G323, G329, A345, E368, F370, P371, P374, P381, E382 D385, D391。有24个不同的守恒的残图4。

3.7。预测致病MutPred2氨基酸替换

MutPred2认为几个氨基酸残基的分子特征来预测一个氨基酸替换是否在人类疾病或中性。它提供的得分的概率预测是一个氨基酸替换应该影响各自的功能蛋白质。致病性预测阈值评分是0.5,MutPred2得分≥0.8可以被认为是一个高度自信的一个。所有替换预测分数≤0.5。表4提供MutPred2结果。

3.8。突变蛋白的稳定性预测由于iStable snp 2.0

Web 2.0工具iStable用于分析蛋白质稳定性的预测。这个网络工具包括11序列和基于结构的预测工具,和机器学习的方法是用于所有输出。突变序列分析由于不可用的运行实验结构。结果表明,G330E、C174R G327R, P290L, D41E, A96G, T114M, D397Y, S19N,和Q359RT增加了稳定而P249S R167W, R301W, C75S, P87S, R118L, T153N, D336N, R125W K355T, G107D, C102S显示降低稳定性。表52.0提供iStable预测。

3.9。表面残留的溶剂可及性和CCBE1 netsurfp - 2.0的二级结构

表面可访问性(暴露或掩埋)在给定的蛋白质的氨基酸被netsurfp - 2.0的,它提供了一个相对和绝对访问每个残留的表面积。它还预测蛋白质二级结构。相对表面易访问性:红色向上海拔暴露在残渣,蓝色和天空向下海拔埋残渣;阈值为25%。二级结构如下:橙色螺旋=螺旋,靛蓝色箭头=链,和粉红色直线=线圈。障碍表现为黑色线肿胀;线的厚度等于无序残留的概率。图5显示netsurfp - 2.0的结果。

3.10。3 d造型CCBE1及其突变体

Phyre2用于3 d结构代地理野生类型CCBE1蛋白质和22个突变体。产生突变的蛋白质三维结构,nsSNP替换了单独Phyre2 CCBE1蛋白质序列,然后提交,预测其三维结构。Phyre2 c5to3B作为模板用于3 d模型的预测,因为它是最高的相似的模板根据Phyre2服务器。TM的分数和RMSD值计算为每个突变模型。TM分数告诉我们应承担的拓扑相似性而RMSD值之间的平均距离α量碳脊椎的野生和突变模型。高RMSD值预测更大的变异结构偏离野生型。突变体的模型R118L (rs115982879)显示的最大偏差在1.56 b RMSD价值其次是A96G (rs149792489) S19N (rs374941368)和C174R (rs121908254)与1.50 b, b 1.44,和1.46 b RMSD值,分别。R125W、C75S T153N显示0.89 b, b 0.90,和0.85 b RMSD值,因此没有从野生型结构的变化。其他nsSNPs显示轻微的变化包括G327R (1.36 b RMSD), P290L (1.3.6B RMSD), Q353T (1.3.2B RMSD), P290L (1.25 b RMSD), D336N (1.25 b RMSD), C102R (1.22 b RMSD), R167W (1.16 b RMSD), P87L (1.14 b RMSD), G107D (1.13 b RMSD), T144M (1.13 b RMSD), G330R (1.12 b RMSD), D41E (1.12 b RMSD), D297Y (1.06 b RMSD), R301W (1.02 b RMSD),和K355T (1.01 b表示)。TM的分数和RMSD值表中给出6。四nsSNPs (R118L A96G、S19N C174R)拥有最高RMSD值选择和提交我助教应承担的重构。蛋白质结构生成的我还是助教是最可靠的,因为它是最先进的造型工具。这些3突变体研究和叠加使用嵌合体1.11 CCBE1型野生量蛋白质,如图6(一)- - - - - -6 (d)。

3.11。预测铝(Post还是翻译修改)

GPS列车MSP 3.0是用于此目的的预测没有网站CCBE1甲基化。GPS 3.0和3.1 NetPhos CCBE1磷酸化预测网站给出的表S1。刺:62残留物(Ser: 23日,22日和酪氨酸:17)被NetPhos 3.1预测的磷酸化的潜力。另一方面,18残留物(Ser: 12,用力推:06,酪氨酸:00)被GPS 3.0能够预测的磷酸化。BDM的酒吧和UbPred用于ubiquitylation预测。BDM-PUB预测11 ubiquitinated赖氨酸残留物,而UbPred预测没有ubiquitinated赖氨酸残留物。在这些预测,BDM的酒吧,没有一个是位于一个高度保守的或有害的nsSNP地区。获得的结果标注在表S1。NetOGlyc4.0用于预测潜在糖基化的网站。糖基化的输出显示所有可能的地点位置19,144年和153年预测糖化得分为0.34,0.43和0.17在野生类型CCBE1应承担的蛋白质。有趣的是,糖基化位点的突变S19N显示损失位置19而T144M还显示糖基化网站的损失在144位置。所有野生型和突变体蛋白的成绩表S2。

3.12。配体结合网站由FTSite预测

网站的配体结合被FTSite预测算法和可视化使用PyMOL和进一步分析。通过这个工具,3配体结合网站被确定在人类CCBE1蛋白(数字7(一)和7 (b))。站点1由14残留物;站点2和站点3由7和5残留。的一些替换22取代位置预测的筛选服务器躺在预测配体结合位点(T153N和R167W)(表S3)。

4所示。讨论

几项研究已经联系CCBE1基因单核苷酸多态性在淋巴血管发育不良的情况下13,14]。利用先进的计算机方法,当前研究单核苷酸多态性的影响进行了探讨CCBE1蛋白的结构和互动行为。最致病性不同的基因的多态性筛选按顺序使用这些方法(42,56]。目前的研究还利用这些方法的顺序应用分类在CCBE1有害的变异,可能与机器交互作用的细胞外基质重塑和迁移压制它的功能。我们在CCBE1筛选73845个snp基因通过多个dbSNP数据库的影响基因的结构和各种蛋白质分子的相互作用。各种在硅片方法被用来屏幕407检索产生的snp的致病性。我们的研究发现23 nsSNPs预测被筛选和PolyPhen2有害,而是通过其他工具验证(PROVEAN FATHMM,轻轨交通、M-CAP VEST3,展望,MetaLR,突变评估员,突变品酒师,和FATHMM-MKL SNP-GO, PhD-SNP,豹,SNAP2,和MutPred)。四nsSNPs被归类为高致病性rs149531418, rs121908251 rs121908254, rs372499913。这个数量低于以前估计使用相同的方法在不同的基因56,57]。所示的两个变体研究(C102S C174R)已经报告Hennekam综合症的研究(11),而其他两个变量(G330E和G107D)不报告直到现在Hennekam综合症。高致病性变异的基础上选择的影响nsSNPs保护序列,序列属性和结构嫁祸于(58]。选择先进的工具的最大可能范围覆盖方法(如:比对的得分;神经网络:神经网络;嗯:隐马尔可夫模型;支持向量机:支持向量机;为预测致病nsSNPs[公元前:贝叶斯分类)58]。因为必需氨基酸中所涉及范围广泛的生物方法和流程,尤其是蛋白质相互作用,是高度修改和保存,在保守位点snp更容易造成损害比nonconserved snp位点(59]。总共23 nsSNPs,只有11个snp位于进化保守,暴露,和功能重要的残留C75S, P87S, P290L, A96G, G107D, R118L, G330E, D336N, R125W Q353R, T153N。有2 nsSNPs (C102S和C174R)位于守恒的,埋葬,在结构上重要的残留物。其余的nsSNPs被发现位于只暴露或埋残留预测是没有任何结构或功能重要性CCBE1蛋白质。这些11 nsSNPs CCBE1尚未报道Hennekam障碍患者,在未来,这些可以被认为是致病性nsSNPs Hennekam患者的报道。预测蛋白质的稳定,我还是STAB2 web服务器使用的预测nsSNP rs149531418, rs121908254, rs147681552, rs192224843, rs147974432, rs141125426, rs374941368,和rs149792489增加稳定而C75S P87S, R125W, K355T, D336N, T153N, P87S, R118L, R301W, P249S, R167W减少蛋白质的稳定性。可以用作诊断和标记这些nsSNPs揭示Hennekam疾病的新治疗靶点。横冲直撞的值被用来验证所有的建模结构。蛋白质结构与横冲直撞值大于80%,核心价值观被认为是高(60]。图中给出的结构5(一)(CCEB1型野生量),横冲直撞值是75.5%残留的喜爱,允许19.1%,4.5%通常允许,不允许0.9%。同样,突变体R118L(80.0%赞成残留物,允许13.6%,4.5%通常允许和不允许1.8%),A96G(76.4%赞成残留物,允许16.4%,5.5%通常允许和不允许1.8%),C174R(79.1%赞成残留物,允许15.5%,2.7%通常允许和不允许0.9%),和S19N(78.2%赞成残留物,允许16.4%,4.5%通常允许和不允许0.9%),所有的结构都以某种方式验证。天车已被证明在细胞信号和蛋白质的相互作用是重要的,以及其他重大事件如生物过程,控制蛋白质结构和功能(61年,62年]。在这个分析中,我们看是否选择nsSNPs修改的天车CCBE1蛋白质。各种生物信息学方法用来预测天车网站在我们可以理解蛋白质。甲基化是一个重要的多功能天车因为赖氨酸残留在某些蛋白质甲基化,影响他们的结合DNA和基因表达变化。另一个重要的蛋白质调控机制作为蛋白质适应它的分子开关等功能蛋白质结构构象变化,蛋白质激活和失活,和信号转导途径63年- - - - - -66年]。S19是高度保守的,暴露和功能显著,根据ConSurf保护配置文件,说明其重要性。磷酸化S19潜力是在位置,也包含了一个最具破坏性的nsSNPs (rs137 6162684),这是结构重要且高度保守的(ConSurf预测),这非常重要。Ubiquitylation是一种蛋白质降解机制,也有助于在DNA损伤修复67年]。它对蛋白质的功能和稳定性至关重要。它在蛋白质相互作用结构的作用。磷酸化是唯一在CCBE1天车能产生重大影响蛋白质的结构和功能,如图所示,这些多功能天车的预测,与残差S19最重要的磷酸化和T153网站。字符串和GeneMANIA预测表明,ADAMTS3最互动与CCBE1基因,由VEGFC FLT4。CCBE1 ADAMTS3、VEGFC FLTR4, GJC2被认为是与Hennekam障碍或相关症状在许多疾病,包括类风湿性关节炎(8,13,68年,69年]。由于他们的交互模式和coexpression概要文件,可以推断,一些最有害的nsSNPs CCBE1基因会影响甚至破坏其他相互作用的基因的正常功能。这说明这些交互的重要性和coexpressing基因,这可能是重要的在Hennekam综合征或其他主要的免疫缺陷疾病。FTSite用于替换在蛋白质功能的影响。FTSite服务器预测三个配体结合网站,每14日7和9残留。我们发现R167W T153N替换参与配体结合部位和催化协调领域,从而影响CCBE1蛋白的亲和力。因为我们的研究是全面的,它包含了所有必要的数据和分析对于识别nsSNPs最有害的。包括我们在内的任何研究有一定的局限性。我们的研究的重点是在数学和计算算法中使用的编程工具和web服务器。因此,需要实验研究来证实这些发现。 Our findings shed light on the CCBE1 gene’s nsSNPs, protein 3D structure, PTM potential sites, and gene-gene interaction, and all of which may help researchers better understand the gene’s role in autoimmunity and related diseases in the future.

5。结论

nsSNPs的影响在功能和结构偏差CCBE1蛋白质预测使用各种各种最先进的工具。CCBE1蛋白质,结构同源方法和序列同源技术已经确定了四个nsSNPs作为潜在的破坏性:rs149531418 (G330E) rs121908251 (C102S) rs121908254 (C174R)和rs372499913 (G107D)。的致病性nsSNPs可以逐步和准确地预测(筛选> PolyPhen > CADD > FATHMM-MKK > M-CAP >丹> >豹>突变品酒师>轻轨MetaLR > SNAP2 > VEST3 > MutPred评估员> PROVEAN > SNP-GO > > PhD-SNP >突变累积),预测匹配的工具。因此,这些工具为其他研究的结果可能被视为更可靠。rs374941368的重要性和rs200149541预测的转录后修饰是强调,因为它可能影响磷酸化的位置。未来4报道极其有害,在高度保守的蛋白质稳定性降低,nsSNPs位置可以作为Hennekam综合症nsSNPs标志。虽然我们在网上进行了彻底的研究,进一步的研究是需要完全理解这些nsSNPs蛋白质结构和功能的影响。

数据可用性

使用的数据在文章中给出的信息的数据,例如,(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp /)。

伦理批准

该研究没有包含任何生活研究对象;因此,不需要伦理批准。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

工作状态研究的框架内进行免疫学和生理学研究所的乌拉尔分支的俄罗斯科学院项目数量aaaa - a21 - 121012090091 - 6。

补充材料

补充文件1。表1:磷酸化预测网站NetPhos 3.1 3.0和GPS。表2:CCBE1 BDM-PUB泛素化的预测结果。补充文件2。表1:NetOGlyc 4.0结果CCBE1(野生型和最终选择突变体)。补充文件3。表1:残渣CCBE1蛋白的配体结合的网站。补充文件4。图1:整体预测工具用于研究的意义(显示了不同的预测工具的意义研究中使用)。表1:确认的有害nsSNPs其他预测软件(显示的结果除了筛选和PolyPhen2预测工具)。(补充材料)

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