系统发育的大肠杆菌隔离在巴西肉鸡家禽屠宰场

文摘

这项研究的目的是确定系统组大肠杆菌菌株分离出看似健康的烤肉和烤焙用具谴责疑似大肠杆菌病的巴西的屠宰场。呼吸道样本和食用内脏(肝和心脏)肉鸡大肠杆菌病的有或没有宏观损伤收集在屠杀。有84株分离肉鸡谴责其中11例获得拭子的心,从肝脏7,66从呼吸道。的53大肠杆菌菌株分离肉鸡不是谴责,5是孤立的从心脏,4从肝脏,从呼吸道44。大肠杆菌通过PCR检测系统组,B1、B2、C、D, E, f . Phylogroups和B1是最常见的Phylogroups大肠杆菌从健康和获得sick-appearing肉用鸡尸体。研究结果表明,phylogroups B2和E与心脏有关样品和phylogroup与呼吸道有关样本,phylogroup B1没有谴责的尸体,和phylogroup D肝脏样本。

1。介绍

巴西第二大生产商的鸡肉和这个产品的最大出口国1]。此外,巴西家禽业是扩大到其他地区在巴西南部(传统的家禽养殖中心)包括中央/西部地区的国家2]。目前,巴西家禽生产商的最大挑战之一是减少造成的经济损失的谴责在屠宰场的尸体,包括空气囊疾病,由于大肠杆菌感染(3]。

大肠杆菌属于家禽肠道的正常微生物群的殖民呼吸道病原大肠杆菌菌株与extraintestinal相关疾病,导致发病率和死亡率的家禽败血症(4,5]。

大肠杆菌病的发病机制尚不完全清楚,但一些大肠杆菌有许多毒性特性与宿主组织殖民,铁吸收系统、血清抵抗,生产的毒素,defensins [5]。这些菌株被归类为禽致病性大肠杆菌(亚太经合组织)subpathotype Extraintestinal致病性大肠杆菌(ExPEC)。

毒力基因的分子检测PCR是最常见的方法ExPEC研究。然而,没有共识关于最低亚太经合组织的预测因素,因为这个子集群菌株非常异构(6- - - - - -8]。此外,虽然亚太经合组织作为一个主要的病原体,一些共生的菌株大肠杆菌,没有毒性的因素,也会导致colisepticemia,作为投机取巧的二级病原体在强调和免疫功能不全的鸟类,主要在呼吸系统疾病的传染性支气管炎或支原体病3,5]。

大肠杆菌由共生体和致病菌株的多样性,和这些微生物系统发育的分类组织通过基因簇的结合是重要的理解大肠杆菌发病机理和互动与主机(9]。的理解大肠杆菌属于不同的基因组结构表明,菌株phylogroups可能与隔离的来源(10]。自2000年推出以来[11),系统输入使用PCR已成为广泛应用由于其简单性和速度,允许分化毒性菌株(B2或D)和同桌的血统(B1)。该方法改进了2013年(10)和一个四倍的PCR可以识别七phylogroups (a、B1、B2、C、D、E和F)。

系统特性改进的理解是一个重要的工具大肠杆菌人口压力和疾病之间的关系(12]。由于的多样性和重要性大肠杆菌感染家禽以及这些感染的经济影响,本研究确定了系统组大肠杆菌隔绝healthy-appearing肉用鸡尸体,尸体谴责为疑似大肠杆菌病的屠杀。

2。材料和方法

2.1。样本收集和细菌检查

呼吸道和食用杂碎样本收集从一个屠宰场根据联邦卫生检查局部托坎廷斯州,巴西,从2011年5月到2012年4月。这个设施屠宰肉鸡从圣保罗、托坎廷斯,戈亚斯州和联邦地区。病变分类在屠杀了巴西农业部联邦检查员和屠宰之后巴西农业部指南(13]。

呼吸道样本(气管和气囊)和食用杂碎的肉鸡肝脏和心脏没有宏观损伤(没有谴责并通过检验)收集后冷却过程。拭子从气管,气囊,肝脏和心脏从尸体谴责为疑似大肠杆菌病的检查期间收集的尸体和相应的内脏取出内脏。每个器官的拭子是放置在一个无菌试管中含0.9毫升的0.85%生理盐水和冷藏,直到处理。样本妥善包装在一个等温框冰袋、运输的兽医和动物科学学院托坎廷斯联邦大学的细菌的文化大肠杆菌。

根据[拭子分别处理14)的分离和鉴定大肠杆菌。短暂,棉签飞跑到MacConkey琼脂和孵化24小时37°C。之后检查MacConkey琼脂殖民地的发展,三乳糖正面和负面的殖民地特点根据生化反应(14)使用琼脂三糖铁(TSI),柠檬酸,吲哚、甲基红、和尿素的测试。管被孵化24小时37°C。只有一个证实乳糖积极应变选择从每个尸体样本进行进一步分析。大肠杆菌菌株保存在室温下营养琼脂分子分析。

大肠杆菌菌株在屠宰场获得59批次。每批次状态的分布如表所示1。在每一批动物被宰杀,10样本收集,5 healthy-appearing肉用鸡尸体和5从尸体被屠杀的大肠杆菌病。

2.2。DNA提取和系统组织的决心

大肠杆菌菌株被送到兽医学院的实验室应用细菌学的米纳斯吉拉斯联邦大学的系统组织的决心。细菌DNA通过电镀之前独立的殖民地大肠杆菌到MacConkey琼脂。电镀后,样本为18 - 24 h孵化37°C。获得的细菌DNA随后resuspending亚文化细胞包含100 1.5毫升超小型电子管µL (TE(10毫米Tris-HCl;EDTA 1毫米,pH值8.0);根据[DNA提取15]。大肠杆菌菌株被分配到7个系统发育组织之一,B1、B2、C, D, E, F基于存在和缺失的基因或DNA片段蔡,yjaA,arpA, trpA基因和TSPE4。C2via PCR assay according to [10]。输入方案进行分类大肠杆菌在本文中描述的phylogroups很的10),并进行相应的研究。EDL933 (phylogroup E)和E2348/69 (phylogroup B2)作为积极的控制。

2.3。统计分析

卡方测试使用95%的意义估计差异的比例系统组织器官中标识的肉鸡和评估系统的比例组织colisepticemic和健康的尸体。

对应分析(CA) (16)被用来研究phylogroups起源的样品(肝脏、心脏和呼吸道),和尸体的特点/内脏检查(谴责谴责)使用占据®/ SE 12.0 [17]。在CA分析,类别之间的关系表示为一个二维图形和三维的值显示在括号。学位类别之间的关系是通过评估变量绘制紧密地结合在一起。CA检查之间的关系分类使用列联表和名义数据分类变量和转换非度量数据的度量数据,允许数据映射和可视化18]。

所有量子GIS空间分析方法与程序执行(19]。两个地图创建的georeference大肠杆菌从收集到的样本(图菌株分离1)。一个是对所有菌株大肠杆菌孤立的呼吸道和食用杂碎(图1/图1),另一个是大肠杆菌菌株分离样本收集的谴责肉鸡(图1/图。图2)2演示了系统组的分布大肠杆菌菌株分离肉鸡屠宰(谴责而不是谴责)根据批动物被宰杀的起源。样本得到的坐标的质心点的直辖市这场创建一层点。这些点被提交给一个半径自适应四次密度内核来说明样品的浓度很多属于相同的位置。

3所示。结果

总共59批次的动物进行了分析,共有590名肉用鸡尸体。一百三十七株的大肠杆菌被孤立和研究中使用。大肠杆菌从呼吸道隔离得到(气管和气囊)和食用杂碎(肝脏和心脏)肉用鸡尸体。有84株从肉鸡谴责疑似大肠杆菌病的分离得到11拭子的心,从肝脏7,66从呼吸道。的53大肠杆菌分离出的样品检验通过了肉鸡,5是孤立的从心脏,4从肝脏,从呼吸道44。表2显示了系统组的分布大肠杆菌从样本获得的谴责,而不是谴责在巴西屠宰场屠宰的肉鸡。系统发育的大肠杆菌根据隔离在尸体的来源如表所示3。没有phylogroups和尸体的状况之间的联系( ),这意味着谴责谴责。Phylogroups B2 ( ), 与心脏有关样本。

我们使用CA分析的程度之间的关系类别phylogroups,起源的样本(肝脏、心脏和呼吸道),和特点的尸体检验(谴责谴责(图)3)。二维表示解释了总变异的42.52%,15.59%用第一维度来解释,第二维度,13.86%和13.07%的3。根据这一分析,附近的一个是绘制phylogroup呼吸道样本,而phylogroup B1附近没有谴责呼吸道样本。样品从谴责肉鸡是绘制接近两个phylogroups和B1;肝脏样本接近phylogroup d虽然phylogroups B2和E绘制远离其他变量,phylogroups都接近心脏的样品比其他变量。

图1显示了总数的核函数大肠杆菌菌株孤立在屠宰场根据城市起源的肉鸡的批次屠杀(图1/图1)的核函数大肠杆菌菌株分离出肉仔鸡谴责怀疑大肠杆菌病根据批肉鸡(图的起源1/ 2)地图。地图上显示大肠杆菌菌株分离出健康和sick-appearing肉用鸡尸体起源主要来自批动物从戈亚斯州和联邦地区。图2显示了系统组的分布大肠杆菌菌株分离呼吸道和食用杂碎的肉鸡屠宰根据批肉鸡被宰杀的起源和显示,phylogroups B1被发现在圣保罗,托坎廷斯,戈亚斯州和联邦地区,但大多在戈亚斯州;在圣保罗phylogroup B2和托坎廷斯州;在戈亚斯州phylogroup C;phylogroup D在托坎廷斯河和戈亚斯州和联邦地区;在圣保罗phylogroup E和戈亚斯州和联邦地区;phylogroup F圣保罗,托坎廷斯河和戈亚斯州。

4所示。讨论

PCR技术来识别7系统组最近由克莱蒙特et al。10),它的使用是罕见的在文献[20.- - - - - -22]。引用的文章的讨论部分本研究使用三层pcr方法,识别phylogroups, B1, B2, d .以前,我们集团的关系7 phylogroups根据主机(牛牛、水牛小腿和家禽)(20.]。因此,据我们所知,这是第一个报告,分析了七个phylogroups协会大肠杆菌样品的起源(肝脏、心脏和呼吸道),和尸体的特点/内脏检查(谴责谴责)在巴西使用四倍的pcr方法。

我们的研究显示,phylogroups B1是最常见的phylogroups紧随其后大肠杆菌从没有谴责肉用鸡尸体。这表明,通过呼吸道因为系统性污染发生大肠杆菌呼吸道的菌株主要phylogroup和一定程度上的B1。感染的主要形式大肠杆菌是通过吸入feces-contaminated尘埃的23]。四郎et al。24同桌的]表明,家禽胴体污染发生大肠杆菌。这个观察是钢筋的事实大肠杆菌与健康组我们的研究主要是phylogroup a .此外,CA显示phylogroup菌株和呼吸道tract-an器官之间的关系被认为是全身感染的第一步大肠杆菌(5]。此外,同桌的菌株大肠杆菌可以作为投机取巧的特工在二级很多鸟类受到感染传染性支气管炎病毒和其他呼吸道病原体流行在巴西。

相反,phylogroups B1之后所获得的菌株是最常见的,在谴责肉鸡。在巴西也发现类似的结果(25,26),日本(27)、伊朗(28),澳大利亚(29日]。在巴西南部的一项研究显示,phylogroup B1孤立在冷藏死鸡的百分比增加随着时间的推移而phylogroups B2和D减少(24]。此外,phylogroups和鸟类B1菌株占主导地位20.,30.),类似于我们的发现。然而,phylogroups A和D是最常见的phylogroups大肠杆菌从意大利(家禽中分离的31日),中国(32)、加拿大(33),和伊朗(34),这表明phylogroups的频率不同地理区域之间可能会有所不同。

总体而言,我们的研究结果表明,phylogroups B2、C, D, E, F是不常见的大肠杆菌从肉鸡phylogroups孤立。这些结果同意其他研究[20.,24,31日,32]。相反,phylogroup B2在其他研究发现在高频率(25,26,35]。Phylogroup D也检测到低频率(4.37%)。在CA, phylogroup D下跌接近肝脏样本CA地图,而phylogroups B2和E下跌接近,与心脏相关样本。在巴西的一项研究中,大肠杆菌与蜂窝织炎病变的肉鸡被phylogroup D[成为主流36]。Phylogroups B2和D菌株被认为是extraintestinal致病性大肠杆菌(37]虽然phylogroup E包括人类和动物肠道病毒和人类肠出血性大肠杆菌O157: H7菌株(38]。总之,我们的研究结果表明,phylogroups B2和D也extraintestinal致病性大肠杆菌对肉鸡和表明phylogroup E可能与extraintestinal致病性有关大肠杆菌肉鸡,但还需要进一步的研究来证实这种联系,由于phylogroup E菌株的数量确定研究中很低。

内核函数显示大肠杆菌菌株分离是主要来自批次从戈亚斯州和联邦地区。肉鸡屠宰的数量根据联邦检查巴西中西部地区增加了多年来,谴责的主要原因是大肠杆菌病和airsacculitis。此外,大肠杆菌分离是主要的细菌菌株在屠宰场与联邦检查在戈亚斯州39]。超过90%的巴西家禽养殖是基于集成系统具有良好的卫生状况、质量和可持续性。屠宰场受到联邦检查服务风险降到最低。家禽大肠杆菌病并没有很好的理解和高度与存在的相关风险因素,如压力,存在其他病原体,免疫状态的鸟类(5]。

研究表明,亚太经合组织是一个人类ExPEC水库和应被视为一个潜在的人畜共患的风险35,40]。我们的研究没有评估毒性基因的存在,但ExPEC phylogroups B2和D被检测到。系统发育研究的背景大肠杆菌很重要,因为有数据显示发展史与毒性之间的关系。在这里,收购的背景很重要,表达不同的毒力因子和流行病学研究(41]。超过95%的大肠杆菌菌株可以正确地分配使用扩展四倍的方法(10]。

5。结论

我们的结果表明,所有phylogroups中发现大肠杆菌从健康和分离sick-appearing肉用鸡尸体屠杀在巴西,但是phylogroups和B1是最常见的phylogroups。Phylogroup分离主要从呼吸道而B1主要是在尸体被发现。Phylogroups B2和E是相关联的大肠杆菌从心样品分离,而phylogroup D与肝脏样本。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的慰问Nacional de Desenvolvimento Tecnico e Cientifico (CNPq)和Fundacao德帕罗尽管做Estado de米纳斯吉拉斯(Fapemig)。安德烈·p·拉赫和马克斯·b·海感谢CNPq奖学金。费尔南达·m·Coura谢谢CNPq斗篷(13827/13-8)她的奖学金。

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