添加硅灰石磷酸钙骨水泥纤维增加细胞活力和刺激Osteoblast-Like细胞的分化

文摘

磷酸钙骨水泥(CPC)是基于α磷酸三钙(αtcp)被认为是理想的骨组织工程由于其相对快速降解特性。然而,这样的水泥是相对薄弱,限制其使用领域的较低的机械应力。硅灰石纤维(WF)已被用于改善生物材料的机械强度。然而,WF的生物学性质仍知之甚少。在这里,我们测试的反应osteoblast-like细胞培养在中国共产党加强与WF (CPC-WF)的5%。我们发现两种类型的水泥研究实现了离子平衡钙和磷酸盐沉浸在3天后培养基,这使得后续长期的细胞培养。CPC-WF增加细胞活力和刺激细胞分化,而nonreinforced共产党。我们假设硅释放年末CPC-WF诱发增加细胞增殖和分化。根据我们的研究结果,我们建议CPC-WF为骨组织工程应用是一种很有前途的材料。

1。介绍

磷酸钙骨水泥(CPC)具有良好的生物相容性和osteoconductivity在活的有机体内通常被用作生物材料在骨植入物(1]。中国共产党是由钙磷酸盐,等α磷酸三钙(αtcp)或β磷酸三钙(βtcp)接触水溶解和沉淀钙缺乏羟磷灰石(2,3]。中国共产党的产生的降解产物,如钙和磷,引起材料的生物活性(3,4),虽然穷人机械性能限制其应用程序小口腔颌面缺陷和金属假体的覆盖5,6]。

机械性能的试验旨在改善中国共产党,小而细长的纤维和胡须应用作为增强材料(7]。磷酸氢钙化合物的强化将(羟磷灰石胡须和纤维)8)、钙碳酸盐(霰石胡须)9),和钙硅酸盐(卡西欧₃,硅灰石胡须,纤维(WF)) (10]。最近的研究表明,添加无机硅化合物对羟磷灰石等生物材料和生物活性玻璃可能会影响osteoblast-like细胞的代谢参与成矿的过程(11,12]。此外,解决方案包含高浓度的无机硅化合物刺激骨相关基因的表达活动,使骨赘生物osteoblast-like细胞(13]。

的力学性能α-TCP-based共产党可以增强的WF(卡西欧₃)[14]。这就提出了一个可能增加中国共产党通过释放的生物活性硅期间硅灰石水解。Motisuke et al。14发现添加5% (w / w) WF强化了磷灰石共产党的抗压强度250% nonreinforced共产党(从14.5到50.4 MPa)。硅灰石表现出优秀的在体外生物活性(15),相对快速的增长表明形成的磷灰石层表面与其他生物活性材料(例如,生物活性玻璃)。形成的磷灰石层至关重要的集成周围的骨植入材料,有利于osteoblast-like细胞的增殖和活动(16]。

本研究的目的是比较cytocompatibility中共和CPC-WF在体外。研究评估潜在的两种类型的水泥作为衬底的分化,osteoblast-like细胞的粘附和增殖。

2。材料和方法

2.1。材料

αtcp被固态反应获得出版的其他地方(17]。简单地说,Mg-free碳酸钙(CaCO的化学混合物₃)和Mg-free三斜磷钙石(CaHPO₄)是煅烧在1300°C和研磨达到1.33到10的粒度分布μm和平均粒径为4.93μm WF盐合成的融合方法。14]。总之,碳酸钙(CaCO₃西格玛奥德里奇)和电子级二氧化硅(SiO气愤地说₂西格玛奥德里奇)密切与氯化钠混合/氯化钾通量和煅烧950°C和盐与去离子水中被淘汰了。准备CPC-WF,αtcp和WF涨跌互现αtcp WF比例为5% (w / w)。这5% WF比率被认为增加CPC的力学性能最优,见我们的以前的工作14]。CPC复合磁盘(WF钢筋(CPC-WF)和nonreinforced (CPC))热压处理过的,沉浸在无菌培养基。所有磁盘都是直径0.8毫米。细胞播种之前,所有党和CPC-WF磁盘都沉浸在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) 3天,每天与媒介所取代。这是实现与培养基离子平衡。每日媒介变化是必要的,以稳定的平衡至关重要的离子,如前所报道(18]。

2.2。隔离Osteoblast-Like细胞

Osteoblast-like细胞从头顶获得20-day-old刘易斯老鼠的外植体的方法。这在动物实验伦理委员会批准的协议是使用由(CEUA 2606 - 01)。每个细胞隔离过程之前,动物被牺牲,头顶被删除和沉浸在DMEM(西格玛奥德里奇、目录号D5796)补充用抗生素(西格玛奥德里奇、目录号A5955)。软组织被手术刀。接下来,头顶是支离破碎的,沉浸在烧瓶内包含DMEM补充用抗生素和10%胎牛血清(西格玛奥德里奇,2442年产品目录号)。培养瓶被保持在37°C公司5%₂的气氛。媒介改变了每2 - 3天,细胞用于实验,直到第四段。

2.3。细胞生存能力

细胞生存能力评估后1、7和14天的文化。离子平衡后时期(如上所述),细胞被播种在材料3×10的浓度⁴细胞/磁盘。消极的控制,细胞培养在聚苯乙烯24-well盘子。孵化后,肝癌和可行的细胞被评估使用比色(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑)(西格玛奥德里奇,88417年产品目录号)减少测定线粒体活动(西格玛奥德里奇,美国)。4 h后孵化的麻省理工,吸光度读数是使用微型板块读者(模型elx - 800紫外Bio-Tek仪器,美国)的波长570纳米。

2.4。扫描电子显微镜

细胞形态学分析了中国共产党磁盘上扫描电镜(JEOL jxa - 840 a)。为此,样本固定在4%多聚甲醛溶液(Prolab产品目录号01 p1005.01.a)、2.5%戊二醛(微孔、编目号码104239),0.03%苦味酸(VETEC QUIMICA国际泳联LTDA,产品目录号000910.06),和1%鞣酸(Synth,目录号01 a2012.01.af) DMEM 30分钟。接下来,样本在磷酸缓冲盐洗(PBS)后缀在1%四氧化锇(西格玛奥德里奇,419494年产品目录号),和越来越乙醇脱水系列。样本然后临界点干燥(鲍尔泽CTD 030)和气急败坏的黄金(050年鲍尔泽SCD)。

2.5。碱性磷酸酶

碱性磷酸酶(ALP)活性化验确定各种材料的成骨细胞分化的早期阶段。高山活动可以显示细胞是否osteoblast-like细胞。使用比色法是基于对硝基苯磷酸盐转化为p-nitrophenol在高山的存在。细胞被播种在磁盘DMEM补充3毫米β甘油磷酸、0.1毫米抗坏血酸和1 nM地塞米松。高山活动测量7点10,孵化后14天。在试验之前,磁盘与PBS和细胞洗两次被声波降解法和特里同x - 100细胞溶解,根据制造商的说明(SensoLyte®pNPP碱性磷酸酶检测装备,Anaspec, Inc .)。生产p-nitrophenol吸光度测量的微型板块阅读器(模型elx - 800紫外Bio-Tek仪器,美国)的波长405 nm。

2.6。电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)

确定Ca^{2 +}、Si和P离子水平,整除的介质被离子平衡期间(1和3在天文化)和在细胞培养(天1、7、14),分析了ICP-OES(珀金埃尔默,最适条件3000 dv)。

2.7。统计分析

所有数据由单向方差分析比较(方差分析)。每当显著差异( ),图基的事后测试应用(BioEstat,版本5.0)。所有的实验都进行了一式五份。

3所示。结果

3.1。细胞生存能力

在所有样品测试,细胞生存能力分析显示,随着时间的推移增加了细胞的代谢活动。然而,细胞活性显著升高( )观察CPC-WF比聚苯乙烯板(负控制)或共产党(图1)。

3.2。细胞形态

扫描电镜显示,细胞能够坚持和传播在测试样本(图2)。细胞质拖长某个观察在所有样本1后,7日和14天的文化。

3.3。碱性磷酸酶活性

高山活动随着时间的增加在所有样本和CPC-WF样本中显著高于中油公司样品后14天的细胞培养( )(图3)。

3.4。Ca的浓度^{2 +}、Si和P离子培养基

离子平衡期间,我们注意到Ca的损耗^{2 +}和P的释放离子经过1天的沉浸在DMEM。在3天的离子平衡时期,我们发现Ca的增加^{2 +}离子浓度和降低P的释放。ICP-OES数据显示Ca^{2 +}和P浓度在党和CPC-WF样本类似的负面控制在DMEM经过3天的离子平衡。有一个稳定下降的速度如果释放CPC-WF样品整个浸时期(图4)。所有的评估离子(Ca^{2 +}、Si和P)类似的浓度后7和14天的文化。这些数据表明,离子水平成为平衡文化(图的第七天4)。出于这个原因,我们从图省略第14天的数据4。

4所示。讨论

在体外分析生物材料在细胞培养是一个有价值的工具,用于了解最近开发的材料引起的不良反应在细胞水平上(15,16]。合适的生物材料应noncytotoxic并能够维护和刺激细胞分化[19]。在这里,我们评估的反应培养osteoblast-like细胞WF-reinforced共产党。

我们发现,中国共产党和CPC-WF使细胞粘附,随着时间的蔓延,提高生存能力。然而,在文化14天之后,细胞生存能力明显高于CPC-WF比共产党。细胞粘附和增殖取决于他们的衬底的物理和化学特性(20.]。中国共产党进行水解与水溶液接触时,形成的磷灰石层,类似于生物磷灰石。这层是一种常见的生物活性材料的特点,使绑定骨骼组织,从而提高移植物同化(21]。根据周et al。16),这对形成过程是至关重要的,成长,和维护tissue-biomaterial界面,以及核扩散和骨基质的合成。Morejon-Alonso et al。22]表明,添加硅酸钙α-TCP-based水泥提高生物活性,加速形成密集的磷灰石层在水泥表面。根据我们的数据,连同Morejon-Alonso et al。(22),我们建议加速磷灰石层形成可以解释CPC-WF细胞生存能力的增加相比,共产党在这里观测到的。

除了共产党的物理特性,有利于细胞粘附和增殖,水泥的化学成分也影响细胞反应。城区et al。18]研究中共掺杂硅离子性质的培养基,这些离子的影响的反应osteoblast-like细胞并观察钙损耗介质包含中国共产党。这些作者还报告推迟细胞增殖,是由于材料的强离子改性。与城区et al。18),我们观察到细胞生存能力随着时间的增加在两种类型的水泥研究离子平衡。此外,与共产党相比,细胞生存能力在CPC-WF显著增加。其他的研究报告了类似的结果对硅在osteoblast-like细胞增殖的作用11,23]。细胞死亡后文化钙磷酸盐报道(24- - - - - -26),通常归因于介质的离子浓度的变化。根据Tamai et al。27],P的释放钙磷酸盐材料诱导磷酸酸的形成,导致酸化的培养基。我们还证明了P释放改变介质的pH值,从而改变从红色到黄色的外表。这里,在第二次中离子平衡的变化时期,培养基的pH值保持稳定(中性)。ICP-OES分析发现,在3天的离子平衡时期,有一个减少P的释放到培养基中共产党的存在。因此,我们建议,这里使用的离子平衡时期促进提高细胞生存能力在随后的细胞培养步骤。

osteoblast-like细胞的诱导分化的能力是成功的基本生物材料为骨组织工程。高山是成骨细胞分化的早期标志(28]。这种酶水解磷酸基板和结果在无机磷酸盐的释放,与钙离子结合,形成羟磷灰石(29日]。发病高峰高山活动通常对应于矿化的30.]。我们的数据表明之间的直接联系的WF在党和高山的生产。如果骨代谢的生物作用仍不清楚;多项研究表明,硅的存在在生物材料刺激骨形成20.,31日,32和增强的高山活动和表达33,34]。

5。结论

综上所述,我们的数据表明,中国共产党样本可能实现离子平衡与培养基。只有在实现了这种平衡,细胞可以长期培养和维护。所有类型的中国共产党对osteoblast-like细胞是生物相容性测试。WF增加细胞活力,以及高山的活动,这可能是直接关系到硅释放在中。我们的研究表明,CPC-WF可以应用在骨组织工程支架的策略。

缩写

高山:	碱性磷酸酶
中国共产党:	磷酸钙水泥
DMEM:	杜尔贝科修改鹰的媒介
ICP-OES:	电感耦合等离子体发射光谱
麻省理工:	(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyl四唑溴离子
PBS:	磷酸缓冲盐
WF:	硅灰石纤维
αtcp:	α磷酸三钙。

的利益冲突

没有披露潜在的利益冲突。

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