蝙蝠SARS样冠状病毒的实时PCR检测及其在意大利大马蹄蝠粪便样本调查中的应用

抽象

蝙蝠是密切相关的严重急性呼吸道症候群（SARS）冠状病毒的来源。大量的研究已经进行了识别使用反转录 - 聚合酶链式反应检测与SARS冠状新蝙蝠病毒（蝙蝠SARS样COVS）。然而，定性PCR可能低估了感染率，影响了蝙蝠的病毒生态学流行病学评价。在这个工作中的SYBR Green实时PCR检测方法可以用来从蝙蝠粪SARS相关冠状病毒感染的诊断和开发应用的一项调查筛选工具，开展了45马铁菊头蝠（菊头蝠ferrumequinum)于2009年在意大利取样。该方法灵敏度高，重现性好。其在蝙蝠筛查中的应用结果为42%。该方法可作为流行病学调查中关于sars样CoVs存在的筛查工具，从而获得更真实的人群中病毒流行情况。

1.简介

其中已经出现在过去的十年中人类的病毒流行，其中最重要的一个是由严重急性呼吸综合征（SARS）的爆发，其在中国出现在2002- 2003年，再次迅速引起人类流行病[代表1个]。

一些研究表明，首先，一种新的冠状病毒是SARS的病原，即SARS冠状病毒[2个]，随后蝙蝠成为与SARS冠状病毒（SARS-like-coronavirus，SARS-like-CoVs）基因密切相关的几种病毒的天然宿主[三]. 目前，在亚洲、非洲和欧洲已发现蝙蝠体内存在类似SARS的冠状病毒[4个–9个]，表示这些病毒的宽扩散。

蝙蝠在这些病毒的生态学和进化中起着关键作用;因此，人们进行了大量的研究来识别新的蝙蝠sars样cov，并了解从动物宿主到人类的传播机制。

在大多数的调查上进行蝙蝠SARS样COVS，对于人口样本的初始筛选的优选的技术一直是反转录 - 聚合酶链反应（RT-PCR）测定或对RNA的RT-巢式PCR测定法从粪便样品中提取。用于PCR反应的引物通常扩增的RNA依赖性RNA聚合酶基因（病毒RdRp，由ORF1A，B编码的第12非结构蛋白），其也经常用于随后的系统发育分析冠状基因组的保守特征的片段[4个,八,10–16]。然而，这项技术可能没有最佳的敏感性，导致低估了感染的真实流行程度，这可能是由于在感染期间粪便中的病毒清除量很低，太低而无法用传统的PCR方法检测。

实时PCR法是用检测比常规PCR的显著下限的方法，从而允许增加的诊断测试的敏感性。尽管高灵敏度的，到现在为止，只有少数作家在他们的流行病学调查[使用这种技术5个,10,13]。其他作者开发的实时pcr使用了在当地地理区域发现的病毒序列设计的引物;因此，鉴于冠状病毒的高度遗传变异性，尚不确定这些检测方法是否能够检测来自其他地区的病毒。

这项工作的目的是建立一个实时PCR检测，以便把它作为流行病学调查用于检测病毒的筛选工具与蝙蝠粪SARS相关冠状病毒感染的诊断。为了这个目的，一个的SYBR Green的实时PCR测定中，扩增的RdRp基因的片段为冠状病毒的通用检测[17]，以增加对SARS相关冠状病毒的特异性。应用SYBR-Green实时PCR技术对45只大马蹄蝠进行SARS样冠状病毒检测(菊头蝠ferrumequinum），其均在意大利，2009年采样，从而导致42％的冠状病毒感染的发病率。

2.材料和方法

2.1。从蝙蝠采样

四十五只大马蹄蝠(菊头蝠ferrumequinum）标本采自于意大利的所有不同的栖息，包括洞穴，矿山和废弃的房屋拍摄，过了4个月的时间（从八月至2009年11月）（图1个和表1个)。所有捕获是由意大利环境部批准并且是博士学位的一部分投射菊头蝠ferrumequinum保护。

蝙蝠用竖琴陷阱捕获并单独置于棉布袋随后的调查开始前。一旦种类，性别，年龄组别（幼年，亚成年，成年），前臂长度和重量进行了测定，蝙蝠在他们拍摄现场被释放。

当蝙蝠在处理过程中产生新鲜的粪便时，立即收集粪便，并将其保存在2毫升RNAlater RNA稳定剂(QIAGEN, Hilden, Germany)中，以便在运输过程中保存RNA。样品在加工前保存在- 80℃。

2.2。RNA提取和cDNA合成

每一经取样蝙蝠的粪便丸剂悬浮在200 μ进行L磷酸缓冲盐水（PBS）pH值7.2±0.2，和病毒RNA的提取开始用140 μL请使用QIAamp病毒RNA（Qiagen公司，德国希尔登）按照供应商的建议悬浮粪便。提取的RNA储存在-80℃。第一链cDNA用随机六聚体与ImProm-II反转录系统（Promega公司，麦迪逊，WI，USA）合成，根据制造商的说明，并储存在-20℃。

2.3。引物设计

正向和反向引物是在先前Escutenaire等人发表的扩增RNA依赖性RNA聚合酶基因（RdRp）片段的11FW和13RV简并引物的基础上设计的。[17]。这两个引物的序列是在多个序列比对的基础上进行修改的，包括来自GenBank数据库的10个sars相关的冠状病毒参考菌株，以增加引物对蝙蝠sars样冠状病毒的特异性(图)2个)。参考序列使用与BIOEDIT版本7.0.5中实现的ClustalW软件对齐。

Using 11FW-modified (5′-TGA TGA TGC CGT CGT GTG CTA CAA-3′) and 13RV-modified (5′- TGT GAG CAA AAT TCG TGA GGT CC-3′) primers, a 168 bp fragment located between the nt 15647–15814 (Coronavirus, SARS-CoV Tor2; NC_004718) was able to be detected.

2.4条。标准DNA的制备

一个pCR4 plasmid (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) containing a copy of the RdRp target sequence was produced as the external standard for the construction of the assay standard curve.

将作为目标序列插入质粒载体的模板DNA是通过扩增从样本893/09-11中获得的cDNA得到的，该样本是意大利蝙蝠sars样CoV，在之前的调查中，作者仅对其进行了部分测序[4个]。常规的PCR是通过Taq DNA聚合酶（Qiagen公司，德国希尔登）使用11FW改性和13RV-修饰的引物进行;the thermal cycler conditions consisted of an initial incubation at 94°C for 5 min followed by 50 cycles of denaturation at 94°C for 40 sec, annealing at 50°C for 40 sec, and polymerisation at 72°C for 40 sec. A final cycle of extension at 72°C for 30 min was performed to produce a single 3′ deoxiadenosine (A) overhang.

按照供应商的建议，用高纯PCR产品纯化试剂盒(罗氏诊断，曼海姆，德国)对扩增产物进行纯化，并按照制造商的说明使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen, Leek，荷兰)将扩增产物克隆到pCR4载体中。重组质粒纯化使用PureLink快速质粒Miniprep试剂盒(Invitrogen, Leek，荷兰)进行;用260/280 nm比色分光光度计测定纯度。

为了更接近模拟病毒反向转录RNA的扩增效率并避免超螺旋质粒DNA的存在，利用限制性内切酶Spe-I（加拿大安大略省伯灵顿市酵母菌）将质粒线性化到蝙蝠SARS样CoV片段序列之上。线性化质粒在1倍标准TAE缓冲液中用1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，并使用快速加载1Kb DNA梯（新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州，美国）定量。标准质粒DNA的拷贝数（CN）是根据美国环境保护署协议中描述的方程式计算的[18]。

2.5。的SYBR Green实时荧光定量PCR

使用SYBR预混料Ex Taq II（Takara Bio inc.，Shiga，Japan）和Rotor Geen 3000系统（Corbett Research，Mortlake，NSW，Australia）进行实时PCR。在FAM通道（多通道机，光源，470 nm；检测器，510 nm；增益设置为5）上采集荧光信号，在每个延伸步骤结束时读取荧光读数。

该的SYBR Green实时PCR在25终体积进行 μ升含有12.5 μ大号SYBR预混料防爆Taq酶II，0.4 μM的正向(11FW-modified)和反向(13RV-modified)引物和2μL模板DNA。加入高压灭菌的纳米纯水，最终体积为25 μl

E类ach run consisted of an initial incubation for activation of the hot-start DNA polymerase at 95°C for 30 sec followed by 40 cycles of denaturation at 95°C for 10 sec, annealing at 55°C for 20 sec, and polymerization at 72°C for 20 sec. During the melt cycle, the temperature was increased by increments of 1°C from 72°C to 95°C.

标本被认为是正面的，如果在扩增曲线的荧光曲线呈指数级增长，并且观察到了特定的熔融峰。

2.6。标准曲线和检测限（LOD）

The SYBR Green real-time PCR standard curve was generated by serial 10-fold dilutions of recombinant plasmid with a known copy number (from至拷贝/μL）。These dilutions were tested in triplicate and used as quantification standards to construct the standard curve by plotting the plasmid copy number against the corresponding threshold cycle values (Ct). The threshold was determined using the Autofind Threshold function of the Rotor-Gene 3000, which scans the range of the threshold levels to obtain the best fit of the standard curve through the samples which have been defined as standards. The limit of detection (LOD) of the reaction was determined based on the highest dilution of plasmid possible to amplify with good reproducibility.

为了验证反应的特异性，我们对SYBR Green real-time PCR反应的产物进行了溶解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳。在1倍标准tris-acetate-EDTA (TAE)缓冲液中，2%琼脂糖凝胶电泳(w/v)，溴化乙二胺染色;大规模低量程DNA阶梯(Fermentas, Burlington, Ontario, Canada)被用来检查预期大小的扩增子是否存在。

2.7条。诊断敏感性和特异性

分析灵敏度和实时PCR的效率由LOD，其如先前所描述评估反射。

一起使用的重组质粒的几个稀释度与测定的特异性进行评价蝙蝠SARS-CoV的一样，不同的属和其它的RNA和DNA病毒，一式三份的冠状病毒。

从RNA获得的cDNA从粪便样品893 / 09-11 [提取4个]作为标准，检测类冠状病毒CoV的扩增情况，其他属的冠状病毒为猫冠状病毒FCoV (Alphacoronavirus, strain 420, cDNA from RNA extracted from from淋巴结，[19]），和传染性支气管炎病毒IBV（Gammacoronaviru年代,菌株M41, DQ834384, cDNA从受感染细胞的RNA中提取，由Elena Catelli教授提供)。为了进一步确定扩增反应的特异性，犬瘟热病毒CDV (Morbillivirus, Onderstepoort strain, NOBIVAC PUPPY CP, NOBIVAC, Boxmeer, Netherlands，从疫苗混悬液中提取的RNA中获得cDNA)和猫泛白细胞减少病毒FPV (Parvovirus, strain 1033/09, DNA提取自舌头)[20.)分别作为非冠状病毒RNA病毒和DNA病毒进行测试。对得到的扩增产物进行了熔融曲线分析。

2.8。分析内和分析间的变异性

为了确定为标准的质粒和用于样本的技术的批内变异，7个连续10倍稀释液（从至拷贝/μL)重组质粒在同一run内重复3次，不同病毒浓度的3个样本进行同样的检测(在样本蝙蝠中检测到的病毒浓度最高(B1): 10^2个和两个低病毒浓度接近检测限（B2和B3）：10^0个)(表2个)。

通过对三个不同病毒浓度(B1、B2和B3)的样本在三个不同的日子(表3)检测bat样本的分析间变异性2个)。

计算平均值、标准差(SD)和变异系数(CV)。特别地，CV是根据美国环境保护署议定书计算得到的拷贝数的标准差与平均值之比的百分比[18]。

2.9。冠状病毒的检测中使用SYBR Green实时PCR蝙蝠粪便样本

的SYBR绿实时优化后PCR测定中，对于每次运行，的标准质粒的6 10倍稀释液重复，蝙蝠样品的病毒反转录RNA，和无模板对照的一式三份同时经受分析。

蝙蝠样本被认为是正面的，如果平均三次重复比LOD更高。

为了证实反应产物的预期大小，扩增子的5微升在2％进行电泳（W / V）琼脂糖凝胶染色用溴化乙锭在1×标准Tris-乙酸盐-EDTA（TAE）缓冲液中，并通过ultravioltet可视化（UV）光;MassRuler低范围DNA梯（Fermentas公司，伯灵顿，安大略省，加拿大）来检查DNA片段的大小。

三。结果

3.1。发展和SYBR Green实时荧光定量PCR验证

通过构建标准曲线，对10倍稀释的重组质粒进行测试，确定了SYBR Green real-time PCR的线性度和效率。通过绘制实时荧光定量PCR (real-time PCR)阈值循环数(Ct)和已知的重组质粒拷贝数，得到标准曲线。得到的斜率显示出9个数量级以上的线性关系，范围大约为至拷贝/μL的斜率为-3.36以确定的系数和反应效率（，由斜率(）使用.

The LOD determined on the standard curve generated by amplifying the recombinant plasmid dilutions was found to be 0.0045 fg or 1 copy/μL，从而示出了测定的高灵敏度。（结果未显示）的反应的特异性通过的83.3℃的标准质粒的稀释的熔融温度证实，表明单个的PCR产物没有伪像，诸如非特异性扩增产物或引物二聚体的形成。F型urthermore, amplification products were also checked on agarose gel stained with ethidium bromide in standard TAE buffer and a clear and well-defined specific band of approximately 168 bp was visualised for all replicates of recombinant plasmid dilutions, except the concentration of拷贝/μL.（图三)。

该方法能够检测出sars样CoV样本893/09-11，其他RNA或DNA病毒均未检测出阳性结果。样品893/09-11的熔化曲线分析在83.3℃时出现单峰(图3)4个). 这些结果表明该技术对类蝙蝠SARS冠状病毒具有高度的特异性。

批内变异性测定中，首先，在一式三份测试重组质粒的7个连续10倍稀释液，然后，在具有不同的病毒浓度，一式三份测试了三种蝙蝠样品。波动（CV）的系数得到的从0.45到不等1.41质粒浓度高于10^2个拷贝/μ五十、 随着浓度的降低，它们逐渐增加。蝙蝠样本的变异系数为1.27，病毒浓度为10^2个拷贝/μL和7.56 - 13。68的浓度为10^0个拷贝/μL（表2个)。测定在三个蝙蝠样本上测试的分析间变异性得出的CV值为1,38，而病毒浓度为10^2个拷贝/μL和23.97-28.79为10个浓度^0个拷贝/μL（表2个)。

用于质粒稀释液和样品的分子内和批间变异性因此对于递减浓度低至10低^2个拷贝/μL and progressively higher for lower concentrations, as influenced by distribution statistics (Poisson’s law) which involves an increase in CV values for the quantification of very low copy number. However, despite the higher variability, low viral concentrations were always detected in all repetitions using the SYBR Green assay.

此外，各个测定之间的标准偏差（SD）为以下（表2个），其通常被认为是可接受的定量分子测定的可再现性的最低要求的水平。

3.2。冠状病毒的检测中使用SYBR Green实时PCR蝙蝠粪便样本

45只大型马蹄蝠的粪便样本(菊头蝠ferrumequinum）一式三份地测试了存在SARS样冠状;19呈阳性，42％的患病率（表1个)。

病毒数量阳性样本中10级的订单范围^0个到10^2个;低病毒浓度也可以是在萃取程序期间采集的粪便的稀释的结果。熔解曲线分析显示84℃每个正蝙蝠样品83之间的单个峰°和。在标准的质粒之间的解链温度差异（83.3℃，见上文）和粪便样品是扩增的靶序列中的核苷酸突变的可能后果（未示出结果）。

The real-time PCR products were checked on agarose gel stained with ethidium bromide in standard TAE buffer and all replicates of the detected positive samples showed a well-defined specific band of approximately 168 bp (Figure5个)。

为了确认阳性样本属于SARS样冠状病毒，对检测到的部分病毒基因组进行了部分测序，并用BLAST网页界面进行了分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）（数据未显示）。

4。讨论

蝙蝠的传染性病毒药物可能传染给人类和其他动物的一个水库的重要性日趋明显，随着时间的推移。在由蝙蝠主办的不同病毒家族，备受关注已经支付给这证明这些主机相当大的变化的冠状病毒。这也与翼手目中的核心作用为冠状病毒的来源密切相关的SARS病毒其中，不超过十多年前，导致人类严重的全球疫情有关。

鉴于此，已经有不少的研究，近年来随着发现的蝙蝠冠状病毒的新品种，以监控全球情况，研究人类SARS病毒的可能来源，并预测可能出现的新的冠状病毒疫情的目标人类。

到现在为止，调查对冠状病毒感染在蝙蝠的优势已经用于初始粪便样品筛选一个反转录PCR（RT-PCR）技术。然而，由于常规的PCR通常具有检测的相对较高的极限相比于分析的其它方法，可能的是，出现了感染的蝙蝠实际流行的低估。

这可能冠状病毒流行的低估影响的病毒生态学蝙蝠的真实流行病学影响评价，通过不考虑长期或持续感染的动物群与病毒载量低，这可能是在传输，维护和演进的重要在环境中的病毒。

本文的描述和验证SYBR绿色实时PCR方法进行了检测SARS-like-coronaviruses在场的情况下,为了提高病毒的敏感性检测和发展,与此同时,一个快速、健壮的技术用于粪便样品的初步筛选。

该的SYBR Green实时PCR本研究开发是高度敏感，能够检测出病毒的最低浓度。此外，它表现出与低内和批间变化相关联的反应的最佳效率和线性度。

因此，这种可靠的和快速的技术，由于其极端灵敏度和重现性，可表示为SARS样冠状检测在流行病学调查的重要且有用的替代方法。实时PCR可以在蝙蝠筛选检测从具有少量病毒拷贝的粪便样本病毒程序特别有用。

该方法应用于2009年意大利不同地区蝙蝠粪便中SARS样冠状病毒的检测。在45只大马蹄蝠样本中，19只呈阳性，患病率为42%，阳性样本的病毒数量在10个数量级之间^0个到10^2个.德雷克斯勒等人。是施加的实时PCR测定以欧洲（保加利亚）的粪便样品字段蝙蝠唯一作者检测26％阳性动物达到高达10^八每克的面[副本5个]。意大利蝙蝠感染sars样冠状病毒的流行率高于保加利亚蝙蝠。意大利蝙蝠粪便最初被稀释，但没有被定量;因此，很难比较我们和Drexler等人的研究中检测的粪便中病毒拷贝的差异。

在本次调查检出的患病率比进行到现在为止关于冠状病毒在意大利蝙蝠群体中存在的唯一的其他研究报告要高得多[4个]，其检测（使用定性RT-PCR）2个阳性出了同种的52只蝙蝠。这些不同的结果可能反映了在意大利地区的蝙蝠种群间的冠状病毒感染的患病率真正区别，但它也可能是由于使用了不同的检测方法。

5.结论

实时荧光定量PCR技术是一种可靠、特异、灵敏的检测工具，在蝙蝠群体中具有快速筛查的潜力。如果广泛应用传统的定性rt - PCR(因为它允许的测序获得产品和病毒的基因组描述),用一个综合的方法定量实时PCR提供相关信息在蝙蝠冠状病毒感染的流行病学状况,从而获得一个更现实的视觉病毒流行的人口。

缩写

蝙蝠SARS样冠状病毒：	蝙蝠病毒与sars冠状病毒有关
CDV：	犬瘟热病毒
CN:	副本编号
冠状病毒：	新冠病毒
CT：	阈值周期
简历:	变异系数
	衍生哪里=荧光和=时间
:	反应效率
FCOV：	猫冠状病毒
废票:	作猫细小病毒
IBV:	传染性支气管炎病毒
LOD:	检测极限
子:	开放阅读框
PCR：	聚合酶链反应
2:	确定系数
的RdRp：	RNA依赖性RNA聚合酶基因
RT-PCR：	逆转录 - 聚合酶链式反应
:	坡
SARS：	严重急性呼吸系统综合症
SARS冠状病毒：	严重急性呼吸综合征冠状病毒
类似非典浸:	严重急性呼吸道综合征样冠状病毒
标准差：	标准差
TAE：	Tris-乙酸-EDTA。

承认

财政支持由的创立RFO（Ricerca Fondamentale Orientata）提供母校Studiorum-博洛尼亚大学。

参考

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