Actinobaculum是使用聚合酶链反应检测

文摘

Actinobaculum是是一个重要的代理相关泌尿感染猪女性。由于其挑剔的生长特性,厌氧细菌的隔离是困难的,因此损伤患病率的估计。本研究的目的是开发和测试的聚合酶链反应(PCR)检测和识别答:是然后比较这些结果与传统的隔离方法。细菌分离和PCR进行一百九十二份尿液样本来自公猪母猪和45包皮的拭。结果表明,PCR是特定的答:是之间,检出限CFU /毫升,CFU /毫升。答:是频率,以PCR,播种尿液样本中8.9%(17/192)和82.2%(37/45)在包皮的棉签。评估使用传统培养技术,没有一个尿样呈阳性答:是;然而,答:是中检测出31.1%(14/45)的棉签。PCR技术被证明是一种有效的检测方法答:是在尿液和包皮的棉签。

1。介绍

Actinobaculum是是一种革兰氏阳性细菌厌氧杆参与了镀金的严重形式的泌尿系感染猪,导致血尿、膀胱炎,肾盂肾炎,会导致动物死亡。母猪发生感染通过接触污染环境或自然与载波公猪交配。大量的猪雄性殖民答:是在他们的包皮的憩室,殖民开始在生命的头几个星期1]。

由于其挑剔的增长缓慢,答:是很难分离,这一事实可能受损患病率的估计。传统的厌氧细菌培养技术来识别可能需要耗费一些时间,在经济上并不总是可行的,超出了一些较小的诊断实验室的功能(2]。代替直接细菌隔离,间接免疫荧光法(如果)已被用于答:是检测(3- - - - - -7]。然而,如果技术的缺点对动物抗体生产的需要,缺乏抗体生产实验室这个代理,专业设备的要求和从业者炮制聚合酶链反应(PCR)检测的一个负担得起的和有前途的替代工具答:是。虽然没有用作PCR诊断方法,这种细菌在猪身上,这种机制已经被应用于检测属的其他物种Actinobaculumsp。银行等。8描述了PCR技术检测Actinobaculum schaalii在人类尿液和发现PCR是一个快速和可靠的检测方法,这导致了更有效的治疗和更快的恢复的病人。

本研究旨在开发一个PCR的探测和识别策略答:是在纯文化中,尿液样本,包皮的拭子;评价PCR检测的特异性和限制;和比较PCR结果与使用直接获得细菌隔离技术。

2。材料和方法

2.1。样品收集

一百九十二份尿液样本从母猪和45拭包皮的憩室从野猪收集三个猪群在圣保罗州,巴西东南部。样本保存在4°C到处理。

2.2。细菌检验

尿液样本(10毫升)在4000×g离心10分钟,获得颗粒或包皮的棉签在5%羊血琼脂补充硫酸粘菌素(10 mg / L)、萘啶酸(15毫克/升)和甲硝唑(50 mg / L)。抗菌粉末都是来自σ化学(圣路易斯,密苏里州,美国)。板是在厌氧条件下孵化在37°C 72小时。殖民地呈现特有的干燥,灰白色不等,夷为平地,不透明的表面,不溶血,提交了生化试验和PCR下面描述。形态学、过氧化氢酶和脲酶生产、hippurate水解、硝酸盐还原、发酵的葡萄糖,淀粉、乳糖、麦芽糖、海藻糖都是考验。

2.3。DNA提取

根据繁荣纯化DNA恢复et al。9)协议进行DNA提取,先前的酶治疗后60分钟37°C和10μ克的溶菌酶(USBiological Swampscott, MA /美国)和400年μ克的蛋白酶K (LGC Biotecnologia Cotia, SP /巴西),然后是储存在−20°C。

2.4。引物设计

一对特定的引物答:是检测的目的是使用16 s核糖体RNA-coding序列描述的路德维希et al。10(加入基因库S83623.1),使用底漆爆炸(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)。

假定的引物由底漆爆炸与非那些较低的身份答:是选择序列,导致两人Acs-1和Acs-2(表1)(Tms 59.45和60.18°C,分别地;职位S83623.1 86年至217年)。

2.5。聚合酶链反应

多重PCR条件进行评估,用于所有后续测试和最佳条件是:50μL反应包含MgCl 1.5毫米的₂,5.0μL (PCR缓冲,20岁的200毫米核苷酸pmol底漆(表1),1.0 UTaqDNA聚合酶(马里兰州Fermentas Inc .)、格伦·伯尼/美国),5μL的DNA模板、超纯水。PCR进行35周期组成的变性1分钟在94°C,退火为1分钟50°C,和扩展为1分钟72°C。

放大产品被发现通过在80 V在1.5%琼脂糖凝胶电泳沾蓝绿(LGC Biotecnologia, Cotia,圣保罗/巴西)40分钟,拍摄下紫外线透照ImageMaster照片文档系统(通用电气医疗集团做巴西Ltda。圣保罗/巴西)。100 bp DNA梯(新英格兰生物学实验室Inc .,伊普斯维奇,MA /美国)用于带大小的决心。

2.6。检出限

PCR的检测极限试验确定了通过使用一个已知浓度的连续稀释10倍(1×10¹1×10¹⁰CFU /毫升)答:是应变LSSU9/11在磷酸缓冲盐(PBS LGC Biotecnologia, Cotia,圣保罗/巴西)。

2.7。分析特异性

确定分析检测的特异性,14的临床菌株答:是和LSSU9/11应变测试。相关系统和临床相关的菌株,包括22个物种中所描述的表2还测试了。

2.8。DNA测序

PCR产品获得3答:是菌株(LSSU9/11应变和两个包皮的菌株)gel-purified使用AxyPrep凝胶萃取工具包(联盟城市Axygen生物科学,CA /美国),然后被测序和Acs-1 Acs-2(表1)引物使用BigDye 3.1(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)和ABI 3500 XL基因分析仪(美国应用生物系统公司,培育城市,CA),根据制造商的指示。序列被提交给blastn分析。

2.9。统计分析

PCR和孤立的结果估计之间的协议使用Kappa测试(11]。

3所示。结果

使用专门设计的引物PCR答:是显示1×10之间的检测极限¹CFU /毫升,1×10²CFU /毫升和生成一个133个基点乐队。没有一个23株不同物种根据PCR测试是积极的,而所有14答:是文化技术正从尿液中分离出来了。从三个测序获得的扩增子答:是菌株显示有98%相似的序列答:是044760.1 16 s (NR)存入基因库和三相比只有90%的相似性Actinobaculum massiliense隔离。

在处理的237个样本中,PCR检测到22.8%(54/237)的优点答:是,而传统的培养表示只有5.9%(14/237)的阳性(表3)。从尿液样本,PCR检测答:是在8.9%(17/192)的样品,和隔离程序没有确定任何积极的样本。从包皮的拭子,答:是PCR检测的82.2%(37/45)的样品,和孤立在31.1% (14/45)。之间的协议分析技术包括所有样本显示Kappa值为0.358,这被认为是一个弱的协议。

4所示。讨论

考虑到困难参与隔离细菌的生长特性答:是在兽医诊断laboratories-the需要抗菌补充媒体,耗时孵化(72小时),和艰苦的生化测试的重要性和流行这个代理在巴西和世界范围内的猪群常常被低估,因为当前使用的低灵敏度检测方法。

到目前为止,没有报告的使用分子检测的测试答:是在猪。银行等。8描述了PCR检测的协议Actinobaculum shaalii在人类的尿液样本,使用特定的引物促旋酶B (gyrB)基因。目前这项研究中,使用16 s rrna的引物设计序列存入基因库和被路德维希et al。10),这是一个高度保守的基因在细菌属,广泛用于目标检测和打字。

所述PCR测定的检出限是10至100 CFU /毫升,这是兼容多个出版物有关分子诊断工具,但不如被银行等。8),报告1.5×10³1.5×10⁴CFU /毫升Actinobaculum shaalii使用实时PCR在尿液样本。的评估分析使用不同的猪病原体特异性,包括Arcanobacterium化脓性链球菌,最近的过去的细菌Actinobaculum属(12),没有反应。与这些新引物扩增子获得匹配的序列答:是序列。此外,当引物在临床样本进行测试,没有发现特异性的乐队。

因为本研究的目的是评估的患病率答:是在尿液或包皮的棉签,而是比较这两种方法测试,统计上显著的抽样并不执行。尽管如此,所获得的结果与其他的比较答:是频率报告是确定关键的潜在使用PCR在未来的研究涉及这种细菌。

考虑到存在的答:是的尿液样本进行了分析,发现隔离方法并未发现任何阳性样品答:是192个样本中处理,而PCR检测到8.9%。Reis et al。13],Menin et al。14)独立代理从2.0%(1/60)和4.0%(37/922)的病例在巴西了。Vaz et al。6和波尔图等。4)报道答:是患病率为16.8%(17/101)和31.4%(11/35),分别在巴西使用如果牛群。频率在当前研究中发现位于前面描述的范围。

从包皮的拭子样本,隔离了31.1%(14/45)积极性答:是,而PCR检测到82.2%的积极性(37/45)。这些值按照患病率研究以前在巴西,报告率为53.8%(21/39)的隔离和78.0%(75/96),如果(5,15]。

其他组以前报道的发生答:是全世界在野猪包皮的棉签。这些包括Pijoan [16),60.5%(23/38)积极性率在美国样本,和琼斯和Dagnall17),89.0%(200/224)积极性答:是在英国的样本,使用隔离过程。Sobestiansky et al。5)报道,67.0%(52/78)积极的棉签在葡萄牙,和76.0%(16/21)积极的棉签在阿根廷的。

在这项研究中,比较PCR技术发达和隔离,如果技术是不可能的。然而,结果显示高功效的PCR方法相比,隔离,包皮的PCR阳性的数量被拭子和尿液与利率使用如果观察到。目前,利用分子工具广泛研究和兽医诊断实验室和被认为是可访问的和负担得起的。

Kappa值为0.358时表示非常弱一致性之间PCR和隔离方法,表明PCR是一个非常有效的工具,用于流行病学和诊断的研究答:是感染猪群相比与传统的隔离方法。这部分是由于PCR检测特定的基因组片段的能力可行性以及死亡的细菌。这个结果是更重要的是在考虑该代理先前描述的生长特征和缺乏特异性PCR扩增子样本测试。

总之,PCR在这项研究中开发和测试是一个快速和可靠的工具答:是检测,即使代理存在于少量与其他细菌在其原始的环境中,如尿道或包皮的憩室。

伦理批准

所有程序使用动物被批准的“使用动物伦理委员会”兽医、动物科学学院的圣保罗大学(协议号2412/2011)。

利益冲突

本文的作者都没有财务或个人与他人关系或组织不当影响或偏见的内容。

承认

本研究支持CAPES-Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量优越。

引用

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