吞噬体的生物化学:研究瞬态细胞器的挑战

文摘

吞噬细胞是免疫系统的特殊细胞,吞噬和杀灭有害微生物在新成立的吞噬体。后者是一种细胞内的细胞器,在几分钟内变成了有毒的环境和消失一旦病原体被摧毁。活性氧和活性氮物种在吞噬体产生。细胞内颗粒或溶酶体吞噬细胞的吞噬体融合,然后解放他们的破坏性的酶。吞噬作用的过程中有效地防止大多数感染;然而,一些微生物避免他们的破坏和造成严重损害。理解这种phagosomal造成的失败,我们需要了解更多关于吞噬体的实际破坏过程。本文总结了生物化学的方法来调查吞噬体和讨论他们的一些限制。依照吞噬体的性质定位和时间动态强调的问题,和最近的进展是突出显示。

1。吞噬作用

吞噬作用的核心机制是我们致病性细菌和某些真核生物病原体的免疫反应。免疫学家揭开了适应性免疫的迷人的复杂性,包括特定的抗原识别和表示主要的生产有针对性的抗体。当最初的威胁是一个细菌,免疫反应的任务是杀死大量的相同,致病性细菌在我们的身体。抗体为主要3函数对细菌:中和,补体的激活,提高吞噬调理素作用。后者执行主要由巨噬细胞和中性粒细胞。缺乏中性粒细胞,中性粒细胞减少,危及生命。这一事实等说明,我们依靠吞噬作用的正常运转。超过50000项在PubMed、吞噬作用被广泛覆盖的主题,和读者被称为优秀的评论。然而,有充分的理由去追求研究面积:(我)罕见但严重遗传性疾病相关缺陷吞噬或死亡;(2)抗菌疗法快速发展遇到阻力;(3)一些最危险的细菌的进化策略来避免杀死吞噬细胞内。

本文将重点关注的一个特别具有挑战性的方面如下问题:

发生在吞噬体是什么?

事实上,大量的文献包括白细胞的杀菌机制,并将简要总结的主要元素。然而,这些机制之间的相互作用了解甚少。只要细菌被杀到最后,我们可能不担心。对于那些病原体生存,我们有一个识别的弱点根本利益吞噬机器。

2。机制的细菌杀死

从概念上讲,已知的杀死吞噬体内部机制依赖于基本吞噬体内部的化学变化。这可能是通过小分子和离子的进口或者出口。此外,酶是解放吞噬体或phagosomal膜内产生有毒物质或直接攻击病原体的细胞壁和细胞膜。

运输这些元素主要是通过膜结合传输机制(离子通道和泵)和交换与其他细胞间通过膜融合和裂变(图1)。后者不仅符合进出口可溶性物质也改变phagosomal膜的脂质和蛋白质组成。交换可能是双向的,例如,使用endosomal通路或单向与中性粒细胞颗粒。

图1

细胞吞噬作用的隔间。吞噬细胞包含多个膜结合隔间,仅包含了其中的一些。囊泡大多属于endosomal通路。中性粒细胞颗粒属于几种类型具有不同的内容。这些隔间交换膜和液体(箭头)。吞噬体充满了一种病原体(蓝色)包围有限phagosomal解决方案(红色)。

化学物质重要的病原体杀死也可以发现在几个隔间外的吞噬体。例如,线粒体产生ROS吞噬体,和几个隔间(核内体、溶酶体和颗粒)是酸性的。颗粒含有离子,可溶性蛋白和膜蛋白,深刻地改变phagosomal生物化学。因此,这些化学物质的检测需要特定场域。此外,所有的膜含有小分子转运蛋白和离子通道。吞噬体的自由体积小于总细胞体积。大多数phagosomal体积的病原体。吞噬细胞经常形成多个时间顺序,这些时间有时相互融合。对多个时间之间的交换。病原体的毁灭是基于化学修改免费phagosomal体积。 The investigation of this small, rapidly changing volume is the object of this paper.

免疫系统的专业的吞噬细胞,巨噬细胞和多核中性粒细胞,能够杀死微生物。然而,巨噬细胞也是一种抗原呈递细胞。人们普遍认为,细菌杀死由中性粒细胞更有效率。虽然细菌杀死的整体概念是相同的对于这两种类型的吞噬细胞,确切的机制是不一样的(1]。水解酶降解蛋白质和多糖攻击细菌细胞壁是交付给吞噬体。在巨噬细胞,这些酶是存储在溶酶体中。在中性粒细胞杀菌蛋白存储在几千胞内颗粒(2]。交付颗粒的吞噬体比巨噬细胞的吞噬体成熟过程更快。

phagosomal杀死的另一个关键特性是生产超氧化物阴离子(NADPH氧化酶)。的迅速转化为许多其他活性氧(ROS),主要是H₂O₂羟基自由基(OH^●),HOCl。病人没有功能性NADPH氧化酶患有慢性肉芽肿性疾病(CGD),表现为严重的复发性感染(3]。中性粒细胞比巨噬细胞产生更多的活性氧。

信号的吞噬体可能会影响吞噬过程的结果(4]。某些病原体的进化精心设计的策略来扰乱白细胞。举几个例子,结核分枝杆菌抑制巨噬细胞钙信号(5),还分泌磷酸酶脱去磷酸phosphoinositol-3-phosphate(π(3)P)逮捕,从而吞噬体成熟(6,7]。利什曼虫延迟凋亡中性粒细胞(8),而幽门螺杆菌和土拉杆菌内扰乱NADPH氧化酶的活化通过两个不同的机制(9]。

一般来说,感染的严重程度取决于培养液的大小。免疫反应是一个种族人口快速增长的微生物。然而,持续性感染可能导致从一个相对较少的幸存的微生物,可以适应一个特定的利基。数天、数周或数年之后,这些微生物可能会再次增长,例如,当宿主免疫力低下,并且产生新的感染的破裂。虽然金黄色葡萄球菌主要是细胞外的病原体,它可能生存在巨噬细胞,中性粒细胞,或内皮细胞,有助于引起持久的感染(10- - - - - -12]。因此,少数幸存的病原体可能足以持续感染。一个有趣的和复杂的延伸这一概念被描述为真核细胞内病原体利什曼虫主要。长期的宿主利什曼虫巨噬细胞。在感染、寄生虫也被中性粒细胞和经常死亡。然而,一些寄生虫生存在中性粒细胞在中性粒细胞进入细胞凋亡。巨噬细胞识别的凋亡中性粒细胞是通过磷脂酰丝氨酸(PS)外膜的传单和内化在反应检测不到发炎的迹象,这有利于生存的寄生虫最终主机内,巨噬细胞(13]。这种“特洛伊木马”策略是凋亡寄生虫的存在进一步优化的培养液(8,14]。默默地PS-positive寄生虫进入中性粒细胞和提高nonapoptotic寄生虫的生存在同一或相邻的中性粒细胞。后,中性粒细胞凋亡,由巨噬细胞内化。发现和理解这样的生存策略,我们不仅需要工具来调查的大部分传染性病原体也发现少数民族抵抗免疫反应的能力。

3所示。方法调查吞噬作用

本文的目的是提供在该领域的主要方法,概述他们的理由,他们强调动态方面的局限性吞噬体成熟。引用作为例子来说明要点和建议进一步阅读;他们绝对不是全面审查所有方法和重要的工作,许多研究已经完成。新的探测器不断发达,一些成为商用。读者必须选择与已知的违约和行之有效的方法可能更好的新探索,需要广泛的描述。

理想情况下,吞噬作用的效率评估通过测量相应的病原体。虽然这似乎是简单的,可用的方法有很大的局限性。细菌的生存能力的黄金标准,形成殖民地。适当colony-counting分析被广泛用于研究和临床应用15]。不依从病原体包括的生存利什曼虫可以评估有限稀释论文(14]。特别注意需要单独或破坏病原体,没有内化在实验之前计算可行的生物。根据微生物的生长速率,这些化验前几天读出。一个优雅的半自动的杀戮化验大肠杆菌和金黄色葡萄球菌基于光密度测量的细菌细胞培养直接在震动和加热(37°C)标(16]。杀死化验给小批量病原体人口中的小的子组的信息。他们反映吞噬细胞反应的最终结果。生存需要的变化分析了额外的吞噬过程的各个步骤的方法。最近的一次国际会议,题为“如何死是死进进出出的细菌休眠”处理可行但nonculturable细菌以及休眠菌(http://www.hdid2011.de)。问题的担忧包括几个重要的病原体金黄色葡萄球菌(17]。

对许多问题,化验监测期间直接杀死吞噬作用会很有帮助。首先,有问题来定义“杀戮。“许多古典生活/死污渍探针细胞膜的完整性。温和膜可能导致积极的结果即使微生物能够恢复和生长。作为替代细胞质细菌酶泄漏到吞噬体被监控的读出透化作用的细菌信封18]。细胞生存的另一个指标是产生蛋白质的能力。一个优雅的和敏感的检测方法Lilius和Atosuo描述这个问题。bacterioluciferase的分析是基于表达式转换、活细菌。酶催化化学发光反应,可以很容易地监控板的读者提供一个直接读出动力学的生存。

荧光蛋白GFP是专门HOCl由髓过氧物酶漂白的H₂O₂和氯(19]。这是用于监控myeloperoxidase-dependent杀害金黄色葡萄球菌在生活中性粒细胞(20.]。HOCl在病原体吞噬体中有许多目标,一旦破坏了细胞膜。GFP漂白发生在HOCl浓度相对较高。因此,GFP的漂白活细菌反映了一个国家先进的损伤,实际上,杀戮在克隆形成试验略快于GFP的漂白20.]。这项技术有许多应用,如个别细菌的识别抵制杀害。由于GFP可以经得起转染表达任何生物,病原体以外金黄色葡萄球菌可以调查。

吞噬作用通常是评估测量粒子吸收,这提供了我们大部分的知识的形成时间。惰性粒子频繁使用的,如死亡细菌,死酵母,酵母聚糖、酵母细胞壁的准备,或乳胶珠子。荧光粒子通过显微镜很容易量化,微型板块读者,或流式细胞术。关键问题是粒子之间的区别,坚持吞噬细胞的表面,那些内化成一个封闭的吞噬体。一种广泛使用的和简单的技术使用淬火荧光的细胞外的粒子。事实上,荧光素及其衍生物被台盼蓝对淬火敏感。后者不容易进入活细胞和时间。因此,当应用台盼蓝吞噬之后,内化粒子保持荧光,几乎所有细胞外粒子成为nonfluorescent [21]。粒子计数的显微镜是乏味时,主要有用非常少量的材料可用,如老鼠血液中性粒细胞(22]或当弱染色细胞需要确认,如细胞与低荧光蛋白的表达。流式细胞术不太耗费时间和分析大量吞噬事件(23]。FITC-labelled粒子(大肠杆菌、酵母)商用;然而,标签的其他粒子很容易实现一个简单的反应与FITC [22]。

4所示。方法调查PHAGOSOMAL生物化学

了解死亡的过程,我们需要知道什么发生在吞噬体。这是攻击病原体的化合物?什么是这些化合物的浓度和他们什么时候出现?病原体是如何干扰这些化合物的交付到吞噬体呢?它是相对简单的调查具体的化合物或混合物的杀菌剂的效果在细菌培养。然而,调查phagosomal环境在几个方面是具有挑战性的。

首先,吞噬体是一个小的细胞内舱,没有从外部直接访问一旦形成。调查的腔时间需要调查的具体目标或隔离时间。

第二,时间在数秒或数分钟之内形成和发展迅速。在一个给定的吞噬细胞,吞噬作用是异步的,除非特定的同步技术。吞噬体的成分迅速发展特别是聚变和裂变endomembranes白细胞。这是一个真正的瞬态细胞器,最终消失了。杀人的过程被认为是在几分钟内完成2小时对于大多数病原体。

第三,吞噬体是一个小型移动目标特别具有挑战性的活细胞的显微镜。噬菌细胞内的吞噬体移动,白细胞移动和经常继续吸收更多的猎物。大多数phagosomal体积被病原体离开一个小充液病原体和phagosomal膜之间的空间。非常高浓度的化合物包括宿主蛋白质可能达到在这个空间。

5。活性氧

检测phagosomal ROS生产问题受到越来越多的重视,和许多方法已经被使用。必须区分测量整体ROS生产期间在吞噬体吞噬作用和本地化的技术检测。一些但不是全部ROS跨膜扩散,所以做一些但不是全部为活性氧检测试剂。Nitrobluetetrazolium(电视台)形成一个黑暗沉淀在减少超氧化物阴离子和广泛用于筛查NADPH氧化酶活性在病人的血液样本。虽然电视台膜渗透,沉淀将形成接近活性氧的来源。当电视台添加在吞噬,吞噬体的沉淀将主要形式,能够很容易地观察到明亮的显微镜。方法是快速的,需要一些细胞,并给出信息NBT-positive细胞的数量/时间样本[22,24]。电视台没有测量ROS产生,它不适合动态测量的分钟。化学发光是一个非常敏感的方法,和一些化合物与ROS和反应产生的化学发光信号。反应是瞬时的,信号反映了ROS的数量在给定的时间。鲁米诺被广泛用于活性氧检测。它跨膜扩散,因此整体活性氧的生产提供了一个信号。Isoluminol不是膜渗透。鲁米诺信号和isoluminol信号之间的差异反映了细胞内ROS生产(25]。获得更直接的衡量phagosomal ROS共价连接的鲁米诺之前微吞噬作用。因此,复合粒子严格本地化,和化学发光信号反映phagosomal ROS生产。该技术已经成功地用于分析树突细胞的活性氧产量(26]。phagosomal苛刻环境的影响在中性粒细胞鲁米诺信号没有被调查。化学发光检测需要光度计或适当的标。只有少数非常敏感和复杂的光学显微镜检测化学发光,和空间分辨率相当有限。

荧光是目前首选获得单细胞ROS生产和空间信息。几个ROS-sensitive荧光染料的方法已被开发,他们中的大多数来自或罗丹明荧光素。它是公平地说,这些染料是完美的。的历史2′,7′-dichlorodihydrofluorescein (DCFH₂)完全说明了困难。这种染料用于40年数以百计的出版物。DCFH₂nonfluorescent而变得不可逆氧化绿色荧光2′,7′二氯荧光素(DCF)。氧化是不具体的特定ROS,和实际的氧化机制是复杂的回顾了最近[27,28]。H₂O₂缓慢氧化DCFH₂,反应更快的过氧化物酶,如辣根过氧化物酶(合)。氢氧自由基(哦^●)迅速氧化DCFH₂,而超氧化物阴离子()是一个可怜的反应物。近来变得明显,次氯酸氧化DCFH (HOCl)₂一个新产品命名Xfluo比DCF(具有稍微不同的光谱特性29日]。过氧亚硝基(ONOO^{- - - - - -}),这是由没有^●和,也与DCFH反应₂荧光光纤,从而吞噬细胞可能取决于NADPH氧化酶的活性以及没有合酶(30.]。当比较动能发光信号与荧光技术方法(见上图),发光是与荧光信号的斜率。

DCFH的优势是什么₂吗?贴现收益率很强的荧光信号。DCF接近的激发和发射光谱的荧光素,从而符合所有标准荧光检测的设备。DCFH₂商用多种形式,(我)一个免费的化合物,(ii)膜渗透二乙酸(DCFH吗₂- da)细胞加载,进入细胞,成为被困在细胞酯酶水解后,或(3)胺活性导数,2′,7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein, succinimidyl酯共价标记的蛋白质或粒子。

当吞噬细胞含有DCFH₂- da和刺激吞噬颗粒,胞质中ROS的存在可以通过流式细胞仪检测(31日]。胞质DCFH的氧化₂在吞噬作用可能是由于H₂O₂通过phagosomal膜的扩散。这个扩散需要时间,在髓过氧物酶的存在消耗H₂O₂,估计有6%的phagosomal H₂O₂生产将泄漏的吞噬体(32]。细胞抗氧化防御将进一步抑制信号,而其他细胞线粒体活性氧的来源,如光纤也可以生成一个信号。然而,单个细胞水平上的技术提供信息和ROS生产的一般时间进程33]。

探讨phagosomal ROS生产、染料应限于吞噬体,它可以通过共价与DCFH标签₂- da succinimidyl酯。这是第一次使用标签BSA,当时与anti-BSA混合抗体和抗原抗体免疫复合物内化(34]。这些试剂现在商业化Fc OxyBURST绿色试剂(分子探针/表达载体)。后来,大的粒子如细菌、珠(35),酵母聚糖(36),或heat-killed酿酒酵母(23]标签。最近的出版物也报道成功的标签与DCFH活细菌₂- da succinimidyl酯(37]。DCFH₂标记粒子不仅适用于流式细胞术,也与活细胞显微镜包括视频显微镜。因此,动力学phagosomal ROS生产可以分析在个人时间的水平。不同的报告认为活性氧的生产开始在吞噬体形成和收益曲线与超过10分钟。以下个人时间与高时间分辨率很难随着吞噬体细胞内各个方向和白细胞显微镜领域的移动。分析粒子的荧光在每个时间点是耗费时间。当DCF荧光从多个时间相比,每个吞噬体的时间轴必须同步的一个共同的参考点,比如吞噬体的关闭。抑制吞噬细胞NADPH氧化酶的DPI停止荧光增加,和吞噬细胞缺乏功能性NADPH氧化酶产生一个很小的DCF的信号(29日]。因为DCFH₂photo-oxidation敏感,总曝光在显微镜需要是有限的。Noninternalized粒子在同一视频电影可以作为控制photo-oxidation。DCF的激发和发射光谱主要GFP的光谱重叠和YFP。对于一个使用荧光蛋白和DCFH相结合₂,CFP和mCherry是更好的选择提供了测量仪器提供了良好的光谱分辨率(见下文)。

测量时耗氧量的中性粒细胞吞噬作用表明,活性氧的生产范围的持续时间从60年代38)超过30分钟(39]。内化DCFH₂标记粒子通常显示增加了DCF荧光10到30分钟(29日,35]。此外,至少有两种类型的动力学检测在neutrophil-like PLB985细胞DCFH吞噬作用₂标签酵母(29日]。DCFH₂标记粒子仍低估了ROS的总持续时间生产如果染料成为完全氧化。确定粒子的最大荧光,他们被氧化在体外与H₂O₂合,然后测量显微镜相同的设置。实验DCFH₂标签酵母表明染料中不完全氧化1 h PLB985细胞。然而,其他粒子可能含有更少的染料和早些时候达到饱和29日]。这个问题进一步复杂化,标签在每个粒子的数量变化和遵循一个高斯分布。因此,一些粒子可能会达到饱和,而其他人仍然有未氧化的DCFH₂。综上所述,DCFH₂标记粒子可能是目前最好的选择探讨动力学phagosomal ROS生产;然而,所需的控制是确保整个实验时间进程实际上反映了活性氧的生产。此外,当然phagosomal ROS生产的持续时间取决于细胞类型和吸入粒子的类型。

Dihydro-2′, 4、5、6、7、7′-hexafluorofluorescein (H2HFF)是另一个ROS-sensitive荧光素衍生物。它是对pH值从4.5到740]。不幸的是,只有免费的染料和BSA-coupled变体(H2HFF-OxyBURST)商用。后者已经成功测试了phagosomal ROS生产。氰氨化硅珠与H2HFF-OxyBURST标签通过使用作为交联剂与12 h孵化下氩。在第二个反应,同样的珠子和alexa标签- 594 succinimidylester获得ROS-insensitive参考信号。OxyBURST荧光在Alexa的594的比率荧光为phagosomal ROS提供了一个健壮的读出。像DCFH₂H₂高频电炉氧化是H₂O₂由peroxidise催化;然而,其他ROS也可能氧化染料(40]。

如前所述,DCFH₂不具体。据推测,大多数从neutrophil-like细胞吞噬体内的氧化是由于H₂O₂与过氧化物酶,这可能是MPO中性粒细胞时间。然而,MPO也会产生氧化DCFH HOCl₂Xfluo。此外,在高浓度时,HOCl也能漂白DCF Xfluo。激发光谱DCFH₂粒子在时间显示DCF和Xfluo存在于相同的吞噬体(29日]。还有待观察是否这两种染料的光谱特性允许定量分析phagosomal HOCl生产。大多数ROS的特异性检测方法一直讨论超出了本文的范围。虽然理想的探针是完全特定的一种ROS,最具体的调查不一定是最好的选择对于每一个实验。探针与多个反应类型的ROS可能利用总体响应更敏感。显然,他们也更敏感的其他来源的活性氧或其他化学物质的干扰与活性氧反应。

Dihydrorhodamine (DHR)由氢氧化₂O₂红色荧光罗丹明123和最敏感的探针是ROS和流式细胞术检测(31日]。DHR和罗丹明123是脂溶性和容易进入细胞,细胞内的细胞器如吞噬体。罗丹明123显示倾向于积累在线粒体本身可能导致DHR氧化(41]。因此,罗丹明123荧光只是部分反映了phagosomal ROS生产。视频显微镜,吞噬体可能会选择感兴趣的区域和当地罗丹明荧光分析调查phagosomal ROS生产(42]。

新战略目标探讨时间来自最近对荧光蛋白变体(FPs)。某些FPs的荧光,比如EGFP,可逆地减少在低pH值和不可逆HOCl漂白。巨噬细胞不产生HOCl,时间变得酸性和淬火EGFP荧光。可逆性可以测试通过中和phagosomal pH值与一个质子离子载体的实验。相比之下,中性粒细胞时间酸性较低但包含HOCl,将漂白剂FP。当表达的微生物,FP是直接针对吞噬体(20.]。另外,GPI-anchored GFP表达巨噬细胞外层膜的等离子体膜。吞噬作用,一些但不是全部GFP进入吞噬体和酸化期间就熄了41]。其他endosomal隔间也获得GPI-GFP,因此需要仔细选择感兴趣的区域进行图像分析。

近年来,许多FPs与改善灵敏度ROS创建(了43])。roGFP2似乎是最有前途的这个家庭的成员。roGFP oxidation-induced转变的激发光谱是可逆的,平衡慢慢(分钟)和氧化还原电位的环境,这是一个根本区别比较像DCFH染料₂这成为不可逆的氧化。DCF荧光反映了累积接触ROS,而FPs反映氧化还原平衡。roGFP之间的融合结构和其他redox-sensitive蛋白质如glutaredoxins显示改进的特异性和敏感性44]。另一种方法导致蛋白质超(45]。cpYFP,这不是氧化还原敏感但对构象的变化特别敏感,是融合redox-sensitive蛋白质大肠杆菌,OxyR。融合蛋白发生可逆转换的激发光谱的存在submicromolar H₂O₂。直到现在,roGFP构造和超没有被成功地应用于生产phagosomal ROS。他们可能会过于敏感,因此迅速浸透在吞噬体。所需的时间为他们的光谱变化和可逆性的条件可能进一步限制。变异与不同的氧化还原电势在建,开辟新的道路调查时间。

ROS生产不是一个孤立的事件在吞噬体成熟但恰逢pH值的变化,颗粒融合,离子通量。理想情况下,测量phagosomal ROS生产应耦合定量检测的其他事件在时间。视频成像DCFH₂标记粒子已经成功地耦合到胞质自由钙离子浓度的测量(Ca^{2 +}]_我)并行fura-2位于相同的单元中。2动态参数的组合测量显示瞬态(Ca^{2 +}]_我,这引发了phagosomal ROS生产(36]。至少2研究成功随之而来的观察DCF-fluorescence吞噬体内部和荧光蛋白的积累,CFP和/或mCherry,吞噬体(35,46]。以来这样的同时多色观察并不琐碎的激发和发射光谱DCF和各种荧光蛋白广泛而有可能重叠。狭窄的激发和发射乐队为每一个荧光团必须选择和切换迅速在整个收购。下面的总曝光时间需要保持光致氧化水平和为每个染料光褪色。DCF-particles倾向于给很强的信号,而FPs倾向于在低水平表达给弱信号。因此,轻微污染的DCF信号可以覆盖信号荧光蛋白。如果不能充分分离信号,使用的染料必须在单独的实验。平均这些实验仍可能提供有价值的见解2个或更多的探测器的平行进化,但有些信息对个人时间丢失(47]。

6。pH值

intraphagosomal pH值的巨噬细胞逐渐减少在15到60分钟4到5 pH值,主要是由于V-ATPase的活动,这酸化是重要的细菌杀死48]。中性粒细胞时间不太酸(1,42),甚至一些研究报告一个瞬态碱化[49]。巨噬细胞和中性粒细胞的区别似乎更强相关NADPH氧化酶活动后者,因为转换到H₂O₂使用质子。Phagosomal pH值与分区研究染料吖啶橙和lysotracker等(41]。这些染料优先积累在酸溶酶体等细胞器和时间。然而,它们的荧光强度不仅取决于许多参数和pH值的直接环境。因此,他们适合识别酸性pH值时间但不方便定量测量。

直接粒子标签需要目标pH-sensitive染料吞噬体。染料的选择大于ROS测量。荧光素和它的许多衍生品pH敏感,和异硫氰酸荧光素(FITC)耦合到胺和含巯基的团体在一个简单的反应。其他pH值指标如Carboxy-SNARF,俄勒冈州格林488年,pHrodo可用作为粒子标签succinimidyl酯。Sulfosuccinimidyl酯也可以由溶解在缓冲区包含羧酸染料N(-hydroxysulfosuccinimide (nhs)和1-ethyl-3) - 3-dimethylaminopropyl碳化二亚胺(EDAC) [50]。当用于荧光显微镜,这些染料受干扰定量评价的常见问题,即光漂白,泄漏的染料(如果未绑定)间的利益,和动作的隔间的焦平面。大多数这些问题是可以克服的比率测量类似钙的开创性工作指标(51]。理想的染料本身经历了一个pH-dependent光谱转变。确定两个合适波长的荧光时,两个强度的比值表明pH值是独立的染料浓度的测量区域。另外,两个染料耦合是相同的粒子,一个敏感的pH值和其他不敏感。两者之间的比例是pH值的可靠指标,除非一个染料光褪色或其他环境参数更敏感。这样的比率测量可以使用离子载体校准的定义良好的pH缓冲。

标签的活细菌或真菌succinimidyl酯或异硫氰酸酯pH-sensitive染料(carboxyfluorescein、荧光素和俄勒冈州绿色)取得不干扰病原体的生存。然而,标签条件通常是活的有机体的修改来减少暴露咄咄逼人的化学物质(52- - - - - -54]。标签需要仔细控制条件保持完整病原体的生存能力。染料在活的有机体的总量可能不到死亡的生物体,这可能导致信号强度或饱和的问题。然而,这种方法提供了重要的洞察intraphagosomal细菌的生存机制。一个有趣的方法来检测phagosomal pH值被Martin-Orozco et al。55]。他们在活细菌表达绿色荧光蛋白,鼠伤寒沙门氏菌,一个pH-sensitive启动子的控制下。GFP显然是超过50%的内化细菌中发现早在转染后30分钟。这是一个相当间接法检测phagosomal酸化,作为交换这揭示了一个重要的细菌对pH值变化的反应。

7所示。钙

需要钙作为信号分子的步骤从肌动蛋白在吞噬作用改造NADPH氧化酶的活化(了56])。当地的钙信号在吞噬体已经观察到,提高钙源的问题;它可能是ER钙商店或吞噬体本身。钙指示剂fura-2共价链接到酵母聚糖颗粒,然后由中性粒细胞内化。比率计测量fura-2荧光在个别时间显示缓慢下降的phagosomal钙浓度(57]。因此,吞噬体似乎解放的胞质钙离子被困在吞噬体的形成。负责任的钙通道益康唑敏感,抑制剂的门店钙条目,但BTP2,另一种抑制剂的门店钙条目,未能影响phagosomal ROS生产(23,57]。钙通道蛋白Orai1及其ER-based调节器stim1参与吞噬作用和phagosomal ROS生产。然而,这些渠道可能在phagosomal膜或只在质膜(58]。本地化的Orai1 2和3通道在时间是最近报道59]。鉴于胞质钙的重要性的吞噬作用的规定,从吞噬体钙释放的作用值得进一步研究。我们可以设想一个吞噬体内钙的作用,例如,真核病原体可能需要钙的信号机制。

8。镁

盘基网柄菌discoideum是一个变形虫,以细菌为食,并使用吞噬的内化和杀死细菌。与哺乳动物的吞噬细胞,盘基网柄菌是遗传的屏幕。利用这种可能性,Lelong等人刚刚描述magnesium-dependent造成影响对某些革兰氏阴性细菌(克雷伯氏菌)[60]。机制尚不清楚,但实际的Mg的发现提出了一个问题^{2 +}吞噬体内部的浓度。以前的迹象表明镁消耗吞噬体的青睐沙门氏菌经济增长导致直接毫克^{2 +}吞噬体测量。Mg^{2 +}敏感染料香豆素343一起嵌入纳米粒子是一个毫克^{2 +}麻木不仁的参考染料。纳米颗粒一起孵化沙门氏菌并通过巨噬细胞内化。实验还揭示了一种稳定而phagosomal毫克^{2 +}浓度约1毫米(55]。其他商业镁等指标mag-fura 2对Ca Kd^{2 +}低于100μ他们足够具体的Mg^{2 +}测量细胞内钙浓度较低;然而,更高的phagosomal钙浓度,最初1毫米以上,将Mg过高检测变化^{2 +}这些染料。

9。钾

近10年前,里夫斯等人发表了一篇论文对中性粒细胞的激活蛋白酶K⁺通量的吞噬体(61年]。这篇文章引发了激烈的辩论和无数的论文将在这里不能总结。同一组的第二篇论文提出大电导钾通道(BK通道)负责大规模涌入到吞噬体钾。本文是由几组高度批评[62年- - - - - -64年),最终收回了。辩论BK通道有点阴影的问题,是否phagosomal钾水平变化和用途。困难的一部分是由于钾K的方法来研究动态变化⁺在时间。K⁺电极或定量^86年Rb通量测量检测大量的细胞的平均响应(61年]。x射线微量分析具有很高的空间分辨率,但需要固定的组织。荧光显微镜和流式细胞术钾指标是罕见的。荧光PBFI钾指标可能不足够具体phagosomal K⁺测量,因为它是敏感的钠浓度、pH值、粘度的介质,所有这些可能会改变在吞噬细胞成熟。有更多了解phagosomal钾在最近的一份报告在分枝杆菌K⁺运输车,迷离恍惚65年]。巴特勒等人报道,分枝杆菌泵K⁺到吞噬体由宿主巨噬细胞,从而增加活性氧的产量;没有的,多分枝杆菌生存。

10。氯

越来越多的兴趣在吞噬体氯的作用。至少两个不同的氯离子转运蛋白,雌性生殖道和ClC-3表达中性粒细胞和参与吞噬作用66年,67年]。令人惊讶的是,单核细胞增多性李斯特氏菌利用CFTR-mediated Cl^{- - - - - -}可以把逃离吞噬体(68年]。另一方面,杀害铜绿假单胞菌由中性粒细胞取决于细胞外氯。大量的氯^{- - - - - -}所需的生产HOCl由髓过氧物酶和额外peroxidase-independent氯的角色也确认(69年]。Phagosomal Cl^{- - - - - -}浓度测量与chloride-sensitive染料6-methoxyquinoline附加到酵母聚糖一起chloride-insensitive引用染料(70年]。正如作者指出的那样,染料由髓过氧物酶氧化敏感;因此,这种酶被抑制在整个测量。因此,最重要的Cl^{- - - - - -}消费者必须中和表明Cl^{- - - - - -}集中在功能齐全的时间将低于该方法检测到。这个例子说明了调查的困难吞噬体内部的恶劣的环境。Chloride-sensitive FPs已经开发,包括最近ClopHensor [71年]。还有待观察是否适合吞噬体这些FPs。

11。酶

中性粒细胞颗粒和巨噬细胞溶酶体包含一个广泛的酶(2参与细菌杀死。要理解它们在吞噬体的活动,你可以区分几个步骤。第一步是颗粒与吞噬体/溶酶体的融合提供其内容到吞噬体。然而,这种酶可能被困在晶内的矩阵,首先必须解放。酶可以调节,例如,由特定抑制剂,其活动可能取决于phagosomal环境(pH)和衬底(ROS)的可用性。我们可以从一种假定酶颗粒吞噬体到一起,但他们的活动可能遵循完全不同的时间进程。各种蛋白质的到来的吞噬体被广泛研究在低时间分辨率免疫荧光法和电子显微镜。动能的测量phagosomal活动开始。

动态分析为phagosome-lysosome融合基于荧光共振能量转移(FRET)开发了耶茨et al。72年]。巨噬细胞含有Alexa萤石594酰肼通过胞饮染色endosomal和溶酶体隔间。然后细胞暴露于调理的硅珠之前贴上488 succinimidylester Alexa萤石。担心信号反映时间与Alexa萤石594含有溶酶体融合包含Alexa萤石488珠,有效地测量溶酶体吞噬体(内货物的浓度73年]。信号迅速增加吞噬作用的前10分钟,90分钟后达到稳定状态。

水解酶的活性在吞噬体可以被监视当粒子被贴上了一个适当的底物在酶催化裂其荧光特性变化。检测蛋白酶活性,Bodipy染料都附在BSA如此高的程度,大多数Bodipy荧光自歇。Bodipy BSA或商业DQ-BSA(绿色或红色)直接与anti-BSA调理的抗体或附着在颗粒吞噬之前。乳沟BSA缓解自灭,释放荧光Bodipy肽在吞噬体(74年,75年]。一个类似的策略是用nonfluorescent衬底(Biotin-LC-Phe-Arg)₂-Rhodamine110解放罗丹明荧光在乳沟[72年]。平行标签Alexa萤石594给protease-independent信号报告内化粒子的数量。分析揭示了连续蛋白酶活动至少1 h的巨噬细胞。的方法是有限的衬底,不得透露真正的蛋白酶活动的结束。在其目前的形式,分析不是特定于一个特定的蛋白酶。

同样的原理后,DG罗素集团也为phagosomal脂肪酶活性和开发动态分析β牛乳糖活动(73年,75年]。在这两种情况下,基质是亲脂性的,因此在硅珠被涂上混合脂质单层。再次,分析衬底有限;因此,观察到的动力学取决于基质的数量相对于活跃的酶的数量。在这个阶段,他们给一个总体的想法开始,第一个小时酶活性的巨噬细胞吞噬体,他们提供了一个工具来比较不同的巨噬细胞的激活状态(75年]。

电子显微镜已经集中用于描述时间。技术提供了独特的优势来检查吞噬体的大小、病原体和phagosomal膜之间的空间,病原体的完整性,phagosomal膜的完整性。染色技术提供更多的洞察吞噬体的组成。然而,生物材料需要固定前通过电子显微镜检查。因此,该方法具有内在低时间分辨率和适合一些固定的时间点是最好的。

12。仪表

荧光染料中方便地分析一个敏感的荧光光谱仪,通常配有温度控制,搅拌的试管和提供可能注入化学物质在测量试管。微型板块的读者提供了一个更高的吞吐量和降低样品体积。除了最复杂的机器,其时间分辨率是有限的。流式细胞术提供信息在每个细胞样本,允许小事件的检测。多参数实验往往是可能的。时间分辨率是变量之间的应用程序和工具。流式细胞术从微型板块可能为高通量实验开发和创造新的机会。显微镜提供了独特的亚细胞定位的优势包括可能遵循并行多个时间相同的细胞。时间分辨率可以比1 s。传统的显微镜是劳动密集型的,明显“低吞吐量。” In fact, analysis of video films takes as much time as the actual experiment. Improved software for phagosome tracking and analysis is likely to accelerate the analysis process. Automatic imaging and image analysis systems are currently developed [76年]。一起使用的微型板块读者和流血细胞计数器,我们可能会看到在未来更快的样本营业额(73年]。很长一段时间,荧光团的激发和发射光谱只在荧光光谱仪可记录的。近年来,高光谱分辨率显微镜成为可供激发和发射光谱(77年]。光谱分析可以揭示变化,仍然忽视以固定波长(29日]。

13。调查的局限性

吞噬体的调查可能会干扰化学或转移phagosomal反应。经典例子,这一现象是钙染料也是钙缓冲区。染料与低效率(荧光强度)需要使用更高浓度获得可利用的信号,可以绑定一个大量的钙。这是第一代的钙指标的缺点,即quin-2 [78年]。另一方面,缓冲能力可以用来改变自由钙离子浓度故意和抑制钙的生理信号。例如,脱粒和过氧化物生成的钙依赖中性粒细胞被充电研究细胞与不同浓度的quin-2 [79年]。最近钙指标如fura-2更有效,给强荧光信号在微摩尔的浓度。fura-2一直有用的缓冲能力分析瞬态钙信号在中性粒细胞(80年]。因此,探讨可逆结合的配体可能有缓冲作用,需要考虑。另一方面,探针与配体如活性氧检测探针反应会改变实际的配位体浓度。如果配体是其他phagosomal反应底物,后者可能遭受缺乏底物与探针的交互。这些问题可能是微不足道的,只要有更多的配体比调查。在任何情况下,控制实验,以评估可能需要probe-ligand交互的本质。高亲和性探针有更强的影响比探针亲和力较低,他们也更快饱和。因此,探测器的灵敏度需要在实际的配体的浓度。

准确的动态测量,probe-ligand交互需要的动力学速度比配体浓度的变化。这并不是对所有已知的染料和变得更加关键的可逆变化。

在许多情况下,我们想比较两个生理情况如吞噬病原体不致病的物种。绝对定量测量并不总是需要调查病原体phagosomal pH值变化,是否为例。然而,校准测量提供一个更好的升值的效应。校准与pH值和Ca通常是可行的^{2 +}测量,但对大多数其他调查,校准方法很少可用。我们经常甚至不知道是否探测器响应线性方式的配体。校准测量需要测试和优化数学方法如phagosomal ROS的生产(32]。

14。新方向

我们可以希望实质性改进有机荧光团特别是新蓝色或红色染料,可以结合主导的绿色荧光团。我们还可能看到荧光蛋白的新变种。仪表,特别是显微镜和流式细胞术,不断提高。技术像烦恼一样,这部电影,或者测量各向异性仅仅利用吞噬的上下文中。有一个全新的领域,纳米粒子,这不是这里讨论。事实上,一些应用前景已经出版的检测H⁺、钙^{2 +}、镁^{2 +}、活性氧等(81年]。

15。吞噬体周围发生了什么?

通常,调查吞噬体的生物化学的目的是了解监管机制和潜在的病原体的干扰。吞噬细胞的调节机制主要是局部细胞质吞噬体表面。例子关注NADPH氧化酶的会中,泡核裂变和核聚变,激活GTP-binding蛋白质或脂质phagosomal膜的修改。这些事件的实时测量数据现在可能FP-tagged蛋白质。胞质单元的积累NADPH氧化酶的吞噬体已经被视频显微镜调查FP-tagged蛋白(46,47,82年,83年]。3的激活状态密切相关的GTP-binding蛋白质,cdc42, rac1, rac2,一直在探索一个复杂的烦恼成像研究[84年]。吞噬体的脂质成分改变成熟期间,暂时提供锚定网站大量的蛋白质,这是重要的病原体破坏(7]。这些变化成为可见的帮助下FP-tagged蛋白质域特别附加一定的脂质(85年]。例如,PH值的使用领域和不同的脂质特异性发现了临时出现的3种polyphosphoinositides phagosomal膜(86年]。下一个挑战是phagosomal膜上的事件连接到吞噬体内部的变化。理想情况下,这应该是做在同一个实验兼容检测方法(35]。另外,平行研究可能[执行类似的实验条件下47]。

16。其他应用程序

这里描述的方法选择使用专业的吞噬细胞,巨噬细胞和中性粒细胞。他们也可能是有用的其他含有细菌细胞内的细胞器。树突细胞内化的病原体的主要目的抗原。这个过程包括NADPH氧化酶和其他phagosomal化合物,但不同的树突细胞吞噬体的特点已确定(26]。盘基网柄菌discoideum喂养内在化的细菌,包括杀戮和降解细菌的吞噬体(内60]。各种细菌入侵哺乳动物细胞,大概是为了寻求一个适合生存和逃避免疫系统(4,87年]。在某些情况下,细菌进入phagosome-like液泡。这些液泡的腔的环境知之甚少。在每一种内化过程中,液泡的生物化学(pH值、活性氧、蛋白酶等)可能会在分钟和小时的变化,可能会影响内在化的结果(破坏、生存、等等)。上述的一些染料面临饱和内中性粒细胞和巨噬细胞时间。这应该是少得多的时间从非专业的吞噬细胞的一个问题。此外,染料在中性粒细胞吞噬体可能摧毁足够稳定的液泡。

17所示。关键特性的理想的染料

这里提到的大多数方法依赖于荧光探针。理想的探针具有很高的选择性对一个参数(pH值、活性氧等),不应受到任何其他在吞噬体化合物。完成对H不敏感⁺是难以实现的,特别是在整个范围的phagosomal pH pH4 pH8跨越4数量级的质子浓度。忽视ROS也同样具有挑战性的这些化合物的定义是高活性。控制实验没有ROS生产用NADPH氧化酶抑制剂,即DPI、或NOX-deficient细胞需要评估调查的鲁棒性。敏感性和饱和适应时间内的相关范围。空间和时间分辨率取决于染料的强度以及成像设备。光漂白和光敏化需要避免。染料应适当的目标,而不是吞噬体的泄漏。校准是一个巨大的优势。多个染料在同一实验需要分析两个或两个以上的相关参数。这主要取决于染料的激发和发射光谱。 Finally, the dye should be compatible with live organisms.

没有染料完全满足所有的需求。现有的方法带来了深入的吞噬体的生物化学。新染料正在开发改善动力学、分辨率和特异性的方法。传染病的意识是一个持续的威胁人类和动物健康会激发新的努力了解传染性病原体的病理。

承认

作者想要感谢他的同事很多讨论本文的主题,特别感谢苏菲身上,玛丽•Erard Marie-Cecile福尔,Dhafer Laouini,劳伦斯•Mery特里Sulpice, Asma Tlili。

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