基于实时评估微生物杀死的中性粒细胞的抗菌化合物

文摘

一个重组大肠杆菌k - 12株,转换修改细菌荧光素酶基因(luxABCDE)Photorhabdus luminescens,构建了以监控实时基础上各种抗菌药物的活动。这大肠杆菌勒克斯发出,没有任何添加底物,本构生物荧光(提单),相关可行的细菌细胞的数量。提单的减少信号相关死亡细菌细胞的数量。抗菌活性的过氧化氢(H₂O₂)和髓过氧化酶(MPO)评估。在较高浓度下,H₂O₂仅bacteriocidic功能和MPO增强这个杀死形成次氯酸(HOCl)。牛磺酸、已知HOCl清道夫,阻塞MPO的杀戮。当大肠杆菌勒克斯孵化了中性粒细胞,类似杀死动力学被记录在H₂O₂/ MPO实验。细菌的调理素作用增强的杀戮,MPO的最大速率释放溶酶体伴随着杀戮的开始。

1。介绍

多形核中性粒细胞是最丰富的一种白血细胞在哺乳动物;他们的主要效应细胞宿主防御反应微生物入侵提供快速部署和效应的免疫系统(1- - - - - -6]。中性粒细胞是专业能力吞噬细胞摄取微生物和粒子进入细胞内被称为吞噬溶酶体的小隔间里。

细胞毒性药物的阿森纳吞噬溶酶体直接降解吞噬物质(7- - - - - -10]。调理素作用的过程是一种吞噬细胞识别入侵的微生物。补充的非特异性结合组件C3b C3bi和血清抗体的特定绑定所需的入侵病原体通常成功识别和破坏这个病原体吞噬细胞(11- - - - - -16]。

目标的摄入会导致增强消费的氧气通过NADPH氧化酶的活性产生超氧化物阴离子(O₂⁻)进一步dismutated形成过氧化氢(H₂O₂)[6- - - - - -10]。这将导致进一步的形成活性氧化剂如次氯酸(HOCl)催化髓过氧化酶(MPO) [6- - - - - -9,17]。MPO的过氧化物酶酶具有基础性作用氧化剂生产,因此在中性粒细胞抗菌活性。它是一种溶酶体蛋白存储在azurophilic颗粒的中性粒细胞(6- - - - - -9]。释放MPO通过融合这些颗粒的吞噬体形成吞噬溶酶体(18]。

中性粒细胞的评估抗菌活动通常是由流式细胞术(FC),化学发光(CL)测定,或者显微镜13,19- - - - - -23]。此外,MPO的检测主要是基于酶蛋白的量化分析没有任何知识的MPO活性。我们以前用luminol-amplified CL和FC分析绑定,摄入和呼吸爆发吞噬细胞的活动(24- - - - - -28),有一个严格的相关性吸入粒子的数量和luminol-amplified CL回应的中性粒细胞(23,24),提供的CL粘附事件排除在外(23,24]。Luminol-amplified CL已被证明是几乎完全依赖于释放MPO azurophilic颗粒。

这些都是可靠的方法,但他们没有透露任何关于死亡的微生物。一般来说,生存能力评估是由板计数。动能测量造成的麻烦,该方法和结果不是实时基础上获得的,因为板块需求很长的潜伏期。测量光密度(OD)还提供了一个实时测定,但所需的细胞密度高浊度测量和不能区分生活和死亡的细菌限制这种方法的应用程序(29日]。

在这项研究中,我们描述一个方法中大肠杆菌k - 12 pEGFPluxABCDEAmp (大肠杆菌勒克斯)是用于评估neutrophil-derived杀死的氧化剂。我们先前已经表明,生物荧光(提单)的信号大肠杆菌勒克斯是直接关系到可行的细菌细胞的数量和分崩离析的信号,由于抗菌剂的加入,与死亡的数量大肠杆菌勒克斯细胞(29日]。我们可以监控这个杀死反应定量实时基础上通过测量提单信号不断孵化期间(29日]。

2。材料和方法

2.1。材料

琼脂、胰蛋白胨和酵母提取物是从Difco获得实验室(底特律,密歇根州)。磷酸二钠(Na₂HPO₄h·2₂O)和磷酸二氢钾(KH₂阿宝₄)购买的j·t·贝克(代芬特尔、荷兰)。氨苄青霉素钠盐、甘油、H₂O₂鲁米诺,食盐(氯化钠),氨基乙磺酸获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。从足底MPO购买天然产物(奥地利维也纳)。所有试剂都至少为分析纯。

2.2。细菌制备和培养

大肠杆菌-勒克斯在5毫升precultivated Luria Bertani肉汤(磅)(10 g胰蛋白胨,5 g的酵母提取物、5克氯化钠,和pH值7.4)和孵化瓶(250 rpm)在一夜之间37°C。细菌培养是悬浮在100毫升LB培养基和孵化瓶(250 rpm) 37°C到OD_620海里为0.25,用日本岛津公司uv - 1601光度计测量(日本岛津公司公司、日本)。在这个OD,细胞在对数生长,文化包含大约3.5×10⁷细菌细胞/毫升。细胞被离心收获2500×g, resuspended 20毫升的混合物的磅(含25%甘油)冰箱股票存储−70°C。所有大肠杆菌媒体包含100μg / mL氨苄青霉素为了保持选择的压力。

造成实验之前,大肠杆菌通过添加50勒克斯首次种植μL冰箱股票5毫升磅中等然后孵化瓶(250 rpm) 37°C到OD_620海里是0.25。孵化后细菌细胞被离心收获2500×g,洗了两次,然后resuspended在67毫米磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)以0.9%的氯化钠(氯化钠)或汉克斯平衡盐溶液(哈佛商学院)和明胶(1毫克/毫升)(gHBSS)吞噬作用分析。

2.3。血清处理和白细胞分离

外围人类血液收集从一个健康志愿者Venosafe 3毫升EDTA管和一个Venosafe 4毫升血清管(比利时鲁汶,作秀的成分公司)。血清分离和用于调理素作用。1毫升的EDTA血混合着NH 10毫升的0.83%₂Cl包括370 mg / l EDTA为了溶解红细胞(RB)。暂停一直在室温下15分钟,之后,白细胞被离心分离g在400×10分钟。细胞溶解RB碎片吸走,和白细胞resuspended gHBSS 1毫升。为了避免不必要的压力对细胞没有额外的纯化步骤。白细胞与显微镜计算通过使用伯克计数室,和孤立白细胞悬挂包含大约2.5×10⁶中性粒细胞/毫升,代表85%的人口吞噬细胞(单核细胞和嗜酸性粒细胞3% 12%)。我们曾表明,单核细胞和嗜酸性粒细胞的luminol-amplified CL反应只有50%的中性粒细胞和,因此,实际上,整个CL-signal /血容量来源于中性粒细胞(25]。

2.4。抗菌反应H₂O₂和MPO

通过添加140杀死化验进行μL的培养大肠杆菌勒克斯细菌悬浮在磷酸缓冲(pH值7.4和0.9%氯化钠),白色的井清楚微量滴定板底96 -(他一一Bio-One,杜塞尔多夫,德国),包含3×10⁵或3×10⁶细菌细胞/。MPO(1或2μg /), H₂O₂(30μ米、125μ米、500μ米、2毫米或20毫米/)和牛磺酸(50毫米/)都在20分别添加μL磷酸盐缓冲剂。最终的反应体积是200μ信用证,通过添加H反应开始₂O₂。

2.5。杀死中性粒细胞的活性

100年移液Neutrophils-killing活动进行分析μL培养细菌悬浮在gHBSS,包含1×10⁶细菌细胞/。中性粒细胞是移液2.5×10加上去的⁵中性粒细胞在100年μL gHBSS入井。调理素作用是由添加40μL 2.5%血清溶液gHBSS反应混合物,最终的血清浓度是0.4%。最终的反应体积是250μ信用证。

Luminol-amplified CL试验是由增加100μ细菌悬液L (1×10⁶大肠杆菌勒克斯细胞/ gHBSS), 100年μL(白细胞悬挂(2.5×10⁵中性粒细胞/ gHBSS), 20μL(鲁米诺(10毫米硼酸缓冲,pH值9.0),和20μL gHBSS人类血清溶液的微量滴定板井(最后的血清浓度0.4%)。最终的反应体积是250μ信用证。

2.6。多模的读者

提单和OD(620海里)大肠杆菌勒克斯在微量滴定板井测定37°C 940年密特拉神磅标(坏Wildbad Berthold技术,德国)。Luminol-amplified CL信号测量变色龙标(Hidex,图尔库,芬兰),由MicroWin 2000 (Mikrotek)。三个平行井准备从每个反应混合物。读者被编程来测量发光和OD持续0.5秒/,在60或240秒间隔。背景信号测量从一个只包含缓冲区,这阅读的读数减去实验井。结果显示为均值±SD三个平行井。

2.7。集落形成单位(CFU)测量

重复的微型板块,类似放入多模的读者在H₂O₂/ MPO和嗜中性粒细胞分析,存入一个层流罩,孵化在37°C。每隔30分钟,100年μL每一步反应的悬架是稀释10¹-10年⁷倍,100μL和20μL从每个稀释用移液器吸取到培养皿中包含与100年洛杉矶琼脂μ克/毫升氨苄青霉素。殖民地被数隔夜孵化后37°C。结果显示为CFU /反应体积。

2.8。数据处理

2007年Excel版本的原始数据进行了分析(微软),和所有的图表都准备起源version 8 (Microcal)。

3所示。结果

3.1。H₂O₂和MPO活动

H₂O₂和MPO补充说到大肠杆菌勒克斯悬架(3×10⁵细胞/),提单和CFU记录(图1)。H₂O₂在缺乏MPO,仅仅有能力杀死,99%以上的细菌细胞在500年被杀μM H₂O₂经过90分钟的孵化(数字1(一)和1 (b))。添加MPO大幅增强的杀戮,因为增加1μg (MPO)到500年μM H₂O₂杀死了99%以上的细菌细胞已经经过一分钟的反应(数字1(一)和1 (b))。这种增强是由于生成的HOCl MPO反应(7- - - - - -10]。这是确认通过添加50 mM牛磺酸、已知HOCl清道夫(22,30.),阻止杀戮的MPO反应几乎完全(图1(一))。提单的测量和板计数互相符合表所示1。

抗菌剂的杀菌的效果只有评估检测OD的减少信号(31日- - - - - -33]。用板的OD检出限读者,细菌悬液,大约是1×10⁶200年细胞/好对应0.030 ODμL,因此高10倍细菌细胞数(3×10⁶细胞/)必须用于杀死实验。H₂O₂先前的实验中使用浓度不够高,不足以表达任何减少OD。只有2毫米H₂O₂在2μ克MPO和20毫米H₂O₂在缺乏MPO显示减少OD,即溶菌作用(图2)。总之,中性粒细胞的抗菌药物,H₂O₂,HOCl显示明显的杀灭能力,很容易的使用大肠杆菌勒克斯。这些代理在高浓度甚至能够溶解细菌细胞。

3.2。杀死中性粒细胞的活性

当中性粒细胞,代替H₂O₂被添加到反应,MPO杀死曲线(图相似3)记录在以前的实验。值得注意的是中性粒细胞淬火部分提单自初始相对发光单元(RLU)值降低了40%的细菌后立即添加2.5×10⁵中性粒细胞的混合物。这并不是由于CFU值没有立即减少死亡。

的实际杀死微生物开始大约50 - 60分钟后的孵化大肠杆菌勒克斯调理的,0.4%血清(OPS)和90 - 100分钟后没有调理素(nop)(数据3(一个)和3 (b))。

杀灭率41%测量180分钟后,空操作为96%,运维衡量RLU(图3(一个)空操作)和49%和92%的行动来衡量CFU(图3 (b))。白细胞中断来找出是否摄入细菌被杀死。由于没有区别RLU打乱了样本和正常样本和CFU(数据未显示),这是得出的结论是,所有摄入细菌被杀死。

没有中性粒细胞,RLU信号降低了4%,0.4%血清的存在(图3(一个))。相同的降低CFU为75%(图3 (b))。这两个值之间的差异是彻底研究在另一篇论文29日]。

当luminol-amplified CL被记录在同一反应条件提单和CFU时间达到最大CL响应(图4)是一样的爆发时间杀死(图3)。

4所示。讨论

大肠杆菌-lux-based实时提单测量提供了一种新方法的细菌杀死中性粒细胞和MPO的抗菌活性。杀害活动的动力学的抗菌药物可以连续记录;因此,传统的动力学参数等和可以获得。从动力学曲线,甚至杀死细菌细胞的绝对数量可以派生。很明显,不同的清除剂和抑制剂的机制功能,如牛磺酸函数在这项研究中,可以探索。

在目前的工作,RLU和CFU价值观总体上良好的相关性。两个例外被注意到。首先,有一个初始RLU后减少40%的中性粒细胞。这并不是出现在CFU测量。我们注意到,这个减少的程度依赖于中性粒细胞的数量补充说,即使他们热灭活(数据没有显示)。结论是中性粒细胞淬火的提单大肠杆菌勒克斯通过吸收排放或绑定的细菌,从而改变提单性质。

第二个例外是CFU值的减少引起的0.4%的血清(图3 (b))。补充化合物存在于这个低血清浓度与转让大肠杆菌勒克斯细胞到盘子和隔夜孵化期间继续活动,造成了相当大的减少细菌生存的盘子。我们已经描述了这一现象(早些时候29日]。

的溶菌作用的目标大肠杆菌勒克斯在存在H₂O₂观察和/或HOCl OD的减少信号(图2)。这些药物引起的快速丧失生存能力(RLU值数据1(一)和2并在图CFU值1 (b))紧随其后的逐渐消散慢得多大肠杆菌lux(图2)。我们将进一步研究背后的机制是什么₂O₂——HOCl-induced溶菌作用。

luminol-amplified CL化验(MPO版本)时,与可行性分析相比,MPO的最大速率释放高峰(CL)爆发之际,杀戮,这表明某一阈值浓度HOCl杀戮开始前必须达到。

这项研究的结果表明的可行性大肠杆菌勒克斯可以快速有效地评估实时基础上没有乏味而耗时的板数。

引用

1. k·l·安德森,k . a . Smith, f . Pio b . e . Torbett和r . a . Maki“中性粒细胞缺乏PU.1不晚期分化或功能成为主管,“血,卷92,不。5,1576 - 1585年,1998页。视图:谷歌学术搜索
2. j·g·利伯,韦伯,b . t . Suratt et al .,“体外生产和中性粒细胞从胚胎干细胞的特征,“血,卷103,不。3、852 - 859年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. f . Hayashi t . k .意味着,公元光泽,“toll样受体刺激人类嗜中性粒细胞功能”,血,卷102,不。7,2660 - 2669年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. m·a·Cassatella m . Locati, a .多亏尤文和“永远不要低估一个中性粒细胞的力量,”免疫力没有,卷。31日。5,698 - 700年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. d . c .戴尔l .拳击手和w·c·Liles说,“吞噬细胞:中性粒细胞和单核细胞,”血,卷112,不。4、935 - 945年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. s . j .借阅,“髓过氧物酶:朋友和敌人,”《白细胞生物学,卷77,不。5,598 - 625年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. s . j .借阅,“过氧化Myeloperoxidase-halide-hydrogen抗菌系统”细菌学期刊,卷95,不。6,2131 - 2138年,1968页。视图:谷歌学术搜索
8. e . b . Kurutas o . Arican, s . Sasmaz“超氧化物歧化酶和髓过氧化物酶活动在寻常痤疮的多形核白细胞,”Acta Dermatovenerologica阿尔,Pannonica Adriatica,14卷,不。2,39-42,2005页。视图:谷歌学术搜索
9. k . m . Mullane r . Kraemer和b·史密斯,“髓过氧化物酶活性的定量评估嗜中性粒细胞浸润为缺血性心肌,”药理学杂志》上的方法,14卷,不。3、157 - 167年,1985页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. p•库马尔k . Pai惠普Pandey,和美国桑达尔,“氧化反应,NADPH-oxidase和髓过氧化物酶活动的内脏利什曼病病人,”医学微生物学杂志》,51卷,不。10日,832 - 836年,2002页。视图:谷歌学术搜索
11. j . Nuutila Hohenthal,即Laitinen et al .,“定量分析的补充受体,CR1 CD35和CR3 (CD11b),在中性粒细胞改善发热患者的细菌和病毒感染之间的区别:与标准临床实验室数据,”《免疫学方法,卷315,不。1 - 2、191 - 201年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. p . j . Nuutila Jalava-Karvinen, Hohenthal et al .,”c反应蛋白/ CD11b比率:参数检测革兰氏阳性脓毒症,”人类免疫学,卷70,不。4、237 - 243年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. j . Nuutila和e . m . Lilius流仪定量测定摄入的吞噬细胞需要绑定的区别的重叠和消化细胞,”血细胞计数部分,卷65,不。2、93 - 102年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. j·l·卡彭铁尔d·p·卢j.p. Paccaud et al .,“内化途径在人类中性粒细胞及其transmodulation C3b受体的化学引诱物受体刺激,”细胞调节,卷2,不。1,41-55,1991页。视图:谷歌学术搜索
15. a·坎普和m·w·特纳“调理素的作用在空泡的密封和酵母聚糖的摄取人类中性粒细胞,”免疫学卷,59号1,第74 - 69页,1986。视图:谷歌学术搜索
16. c·h·t·a·盖瑟称,锤子,j . e . Gadek“乳沟的膜结合C3b和C3bi可行的人类中性粒细胞(中性粒细胞),“分子免疫学,20卷,不。6,623 - 635年,1983页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. f·w·Asselbergs j . w . c . Tervaert r . a . Tio et al .,“髓过氧物酶的胸痛患者预后价值,”《新英格兰医学杂志》上,卷350,不。5,516 - 518年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. c . Cougoule p .常数g . Etienne m . Daffe i Maridonneau-Parini,“缺乏融合嗜苯胺蓝的颗粒与时间在人类中性粒细胞吞噬smegmatis分枝杆菌的不积极控制细菌,”感染和免疫,卷70,不。3、1591 - 1598年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. p . j . Nuutila Jalava-Karvinen, Hohenthal et al .,“比较容易脱粒的可活动的细胞内颗粒由人类吞噬细胞在健康受试者和传染病患者,”人类免疫学,卷70,不。10日,813 - 819年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. r . Ihalin j . Nuutila诉Loimaranta m . Lenander j . Tenovuo和e . m . Lilius“易感性的梭菌属nucleatum杀死了过氧化peroxidase-iodide-hydrogen组合缓冲溶液和人类整体的唾液,“厌氧生物,9卷,不。1,23-30,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. m·a·Cassatella f . Mosna a米凯莱蒂et al .,“toll样receptor-3-activated人类间充质基质细胞显著延长生存和中性粒细胞的功能,“干细胞卷,29号6,1001 - 1011年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. l . Selloum h . Djelili l . Sebihi, j .这些“清道夫黄酮醇对HOCl-induced鲁米诺化学发光,“发光,19卷,不。4、199 - 204年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. 诉Loimaranta j . Nuutila p . Marnila j . Tenovuo h . Korhonen和e . m . Lilius Colostral牛接种蛋白与变异链球菌/ S。sobrinus支持人类白细胞吞噬作用的变形链球菌链球菌和杀戮,”医学微生物学杂志》,48卷,不。10日,917 - 926年,1999页。视图:谷歌学术搜索
24. s . Nikoskelainen s Verho k Airas, e . m . Lilius“鱼吞噬细胞引起细菌的粘附和摄取活动气单胞菌属salmonicida可以从高度稀释的杰出和直接测量全血的鱼,”发展和比较免疫学卷,29号6,525 - 537年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. e . m . e . Lilius和j·t·j . Nuutila”粒子诱导髓过氧物酶释放在连续稀释全血量化的数量和血液中性粒细胞的吞噬活动和调理素作用能力的等离子体,“发光,21卷,不。3、148 - 158年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. a . Lojek m . Ciz p . Marnila m . Duskova和e . m . Lilius”测量全血白细胞在纯种老鼠的化学发光,“生物荧光和化学发光》杂志上,12卷,不。5,225 - 231年,1997页。视图:谷歌学术搜索
27. r·m·罗马p v . Camargo f·k·博尔赫斯,a·p·罗西尼和c a . Polanczyk“髓过氧物酶在冠状动脉疾病的预后价值:比较不稳定和稳定心绞痛病人,”冠状动脉疾病,21卷,不。3、129 - 136年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. e . Cavusoglu c . Ruwende c Eng et al .,“基线血浆髓过氧化酶水平的有效性作为一个独立的预测心肌梗死的急性冠状动脉综合征患者两年,”美国心脏病学杂志》,卷99,不。10日,1364 - 1368年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. j . Atosuo j . Lehtinen l . Vojtek和e。Lilius。”大肠杆菌k - 12 (pEGFPluxABCDEamp)。工具,分析抗菌药物的细菌杀死,人类一个实时的基础上补充活动,”提交国际期刊的抗菌药物。视图:谷歌学术搜索
30. 卡恩斯和r·道森Jr .)“Cytoprotective牛磺酸对次氯酸毒性效应PC12细胞,”实验医学和生物学的发展卷,483年,第570 - 563页,2000年。视图:谷歌学术搜索
31. m . Rozenberg-Arska j . c . Porsius e . y . Jaarsma和j . Verhoef”杀菌,杀菌的人类血清对大肠杆菌和调理素的活动,“医学微生物学杂志》,22卷,不。2、143 - 149年,1986页。视图:谷歌学术搜索
32. p·w·泰勒,“一些光滑的大肠杆菌菌株的敏感性正常人血清杀菌作用,”临床病理学杂志,27卷,不。8,626 - 629年,1974页。视图:谷歌学术搜索
33. p·w·泰勒:“血清对革兰氏阴性细菌的杀菌和溶菌的活动,“微生物学检查卷,47号1,46 - 83年,1983页。视图:谷歌学术搜索

版权

版权©2011 j . t . Atosuo和e。Lilius。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。