文摘

背景。耐药结核病疫情在结核病高发国家,尤其是埃塞俄比亚,仍然是一个重大挑战。因此,我们调查了耐药性,常见的基因突变,分枝杆菌分离株的分子特征从疑似结核性淋巴腺炎患者(TBLN)。方法。横断面研究218 FNA TBLN病人样本接种Lowenstein-Jensen媒体。文化隔离标识为MTB的聚合酶链反应(PCR)和差别(RD9)测试区域。此外,基因型MTBDR+试验检测结核分枝杆菌第一和二线药物,和spoligotyping strain-dependent多态性测试确定。结果。在50培养阳性分离株中,14%(7/50)有耐药性基因突变引起的。其中,4(8%)隔离mono-resistant异烟肼药物,这是由基因突变引起的katG在该地区的审问密码子315年S315T1的氨基酸序列,和3(6%)隔离对利福平和异烟肼药物产生了抗药性。突变是观察katG(315密码子的氨基酸序列的改变S315T)rpoB(在530 - 533密码子的氨基酸序列的改变S531L (S450L))的基因。最普遍的spoligotypes是孤儿和SIT53菌株。结论。异烟肼的优势mono-resistance构成关键风险的潜在开发耐多药结核病,如异烟肼mono-resistance耐多药结核病的发生是一个典型的途径。孤儿和SIT53 (T)压力是最常见的在研究区,和一个耐药菌株引起的一种常见的基因突变可能表明clonal-resistant菌株的传播在社区。

1。背景

肺结核(TB)引起的结核分枝杆菌,仍然是一个全球健康问题导致显著的死亡率和发病率,尤其是在发展中国家。世界卫生组织报道,1000万人受到影响,130万人死亡和214000人感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)于2020年(1]。全世界的艾滋病毒阳性结核病患者的比例是8%。这个非洲南部部分地区的比例接近50%,在非洲大陆最重要的地方1]。此外,结核病占大约14%的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)相关死亡(1]。最常见的集中形式的结核病监测是肺结核(PTB)影响肺部的主要器官,这可能导致肺外结核(EPTB)[贬值2]。EPTB负责16%的2019年全球710万例结核病事件记录(3]。

耐多药结核病(mdr - TB),一个新兴的挑战世界上结核病控制,被描述为耐利福平(RIF)和异烟肼(INH)药物,有或没有显示抵抗其他一线药物4]。广泛耐药结核病(xdr - TB)也称为耐RIF,加上任何氟喹诺酮类,和至少一个额外的药物像linezolid或bedaquiline [1,5]。在全球范围内,2019年,大约有500000新发病例报道RIF阻力,其中有78%的耐多药结核病[3]。RIF,最强大的一线药物,占新病例的3.3%,和17.7%的以前结核病患者治疗MDR / RR-TB。在2019年,6.2%的耐多药结核病例估计广泛耐药结核(3]。

埃塞俄比亚是结核病中最高,耐多药结核病,全球结核—艾滋病毒负担国家(3]。然而,由于代表研究的局限性,耐药性结核病的范围和分布在TBLN情况下在埃塞俄比亚尚未为人所知。线性探针测定(基因型MTBDR试验)的同步检测异烟肼和RIF阻力是一个最近开发的方法来评估药物敏感结核病的临床标本和文化隔离的结核分枝杆菌复杂(MTBC) [6]。基因型MTBDR+试验检测耐RIF和基于检测异烟肼在培养样本最常见的突变rpoB和katG基因,分别。此外,MTBDRsl试验检测特定的基因突变与氟喹诺酮类(克)电阻(gyrA和gyrB基因)和二线注射药物(滑)(rrs和eisMTBC(基因)7,8]。

根据当前的基因组研究证据,MTBC由五human-adaptable血统(L1-4和地级)反映MTB狭义,另外两个human-adaptable血统(L5-6),历史上被称为分枝杆菌africanum,至少九要远远高于动物血统(9]。MTBC包含生物常见的动物,但可以传播人畜共患疾病。MTBC血统,血统2,血统3,和血统4被认为是新的血统,而血统1、5、6被认为是古老的血统。血统7是一个前现代家族系统位于古代和现代血统(10,11]。在埃塞俄比亚,当前和古老血统的存在。现代血统(L3、L4)是最普遍的类型(12]。此外,血统2(北京应变)很少被发现在埃塞俄比亚,一直与高速度的耐药性(13,14]。

全球通过遗传多样性包括结核病耐药菌株的出现。因此,它有助于流行病学研究来评估结核分枝杆菌的耐药基因突变造成的多样性及其应变,这是分散在一个特定的地理区域。已经有许多研究在埃塞俄比亚评估的模式耐药性结核分枝杆菌的遗传多样性与肺结核病人隔离。然而,需要更多的信息关于TBLN研究。考虑这一点,本研究旨在评估耐药性基因突变造成的,目前在全球结核病药物出现耐药菌株通过遗传多样性,在调查的变化在亚的斯亚贝巴TBLN病人MTBC菌株中,埃塞俄比亚。

2。材料和方法

2.1。研究区域、时间和设置

这项研究是由全部由非洲人组成的麻风病和结核病康复和训练中心(警报)和圣彼得结核病专业转诊医院1月1日至2020年4月在亚的斯亚贝巴,埃塞俄比亚。警报医院皮肤病作为转诊机制和每周报告批准结核病淋巴腺炎疑似病例。医院还提供了一个与病理学实验室诊断服务Armauer汉森研究所(AHRI)。圣彼得结核病专业转诊医院转诊结核病医院从全国各地。

2.2。研究设计

横断面研究的临床疑似TBLN病例进行了确定MTB菌株之间的变异和耐药模式由基因突变引起的。这项研究包括所有患者TBLN-suspected参观了研究区域在特定的时期。

2.3。抽样程序和细针吸活(FNA)

连续采样技术被用来招募了218名研究参与者,和大约50μL FNA标本收集的研究参与者。一位经验丰富的病理学家执行标准(FNA)过程15]。FNA标本收集从扩大节点使用一个21-gauge针上覆淋巴结后皮肤与70%乙醇消毒,正如其他解释(16]。

2.4。实验室方法

2.4.1。文化技术

执行文化218年总共招募了FNAC样本与FNA)流体和孵化鸡蛋Lowenstein-Jensen-glycerol媒体37°C进行为期八周,按照标准程序。每周观察接种文化存在的典型的分枝杆菌菌落。此外,Ziehl-Neelsen染色是用来证实所有积极的抗酸性LJ的文化。

Ziehl-Neelsen染色是用来证实所有积极的抗酸性LJ文化干,浅黄色,表面皱纹,粗糙,nonpigmented,米色的殖民地。在八周内没有增长在整个LJ媒体被记录为culture-negative [17]。

2.5。地区差异9 -聚合酶链反应(RD9)

Heat-killed文化隔离被用于基于聚合酶链反应(PCR),删除输入。RD9的存在与否是用来区分MTB使用以下引物:从其他MTBC物种RD9侧面F (5 - - - - - -GTG标记GTC AGC CCC ATC颈- 3 ),RD9 intR (5 - - - - - -CTG广汽CTC手枪广汽CAC TC-3 ),和RD9侧面R (5 - - - - - -GCC CAA CAG CTC广汽ATC-3 )。PCR扩增热循环中执行以下标准程序(18]。循环条件是10分钟的酶激活在95°C 1分钟紧随其后的变性在95°C, 0.5分钟的退火55°C, 2分钟的扩展在72°C,涉及总共35周期,最终72°C伸长了10分钟。产品在1.5%琼脂糖凝胶电泳1×TAE (Tris-acetate-EDTA)缓冲区。凝胶电泳,1:十溴化乙锭的比例,100年DNA碱基对梯,和橙色6×加载染料使用,结果可视化使用透照器(Bio-Rad实验室Inc .)。一个乐队的大小396个碱基对被认为是结核分枝杆菌阳性检测(18,19]。

2.6。行调查分析(LPA)基因型MTBDR+测试

Heat-killed细菌菌落生长在LJ媒体被用于基因型MTBDR+试验(海Lifescience、Nehren GmbH,德国)。收集细菌菌落接种环,悬浮在100年μL(裂解缓冲在95°C (A-LYS)和加热5分钟营养细菌灭活。经过短暂的旋转,一个额外的100人μL中和(A-NB)缓冲区是补充道。5分钟后上层清液,旋转DNA用于PCR扩增。主混合制备根据制造商的指示。变性的放大概要文件包括15分钟在95°C,紧随其后的是1的循环在95°C和2分钟30秒65°C,紧随其后的是一个额外的25秒的周期在95°C, 40秒50°C,在70°C和40秒,总共20周期,然后一个八分钟的扩展在70°C 1周期。TwinCubator(海Lifescience、Nehren GmbH,德国)用于杂交和检测(20.]。

2.7。Spoligotyping技术

根据标准程序,结核分枝杆菌分离确认使用RD9删除测试进一步具有spoligotyping [21]。热循环仪是用来放大直接用寡核苷酸重复(DR)地区和两个biotin-labeled底漆,半径标注:(5GGT TTT GGG TCT广汽GAC3 )和DRb: (5在20 AGA GGG广汽GGA AAC3 )。使用PCR反应产物被放大。目标序列杂交成43固定化寡核苷酸,每个相应的直接重复(博士)轨迹”独特的间隔的DNA序列。杂交后,DNA检测使用增强化学发光和x射线胶片曝光由制造商。

在最近的结核病洞察力(http://tbinsight.cs.rpi.edu/run_tb_lineage.html)和SITVIT2 (http://www.pasteurguadeloupe.fr: 8081 / SITVIT2 /)数据库,杂交模式编码到八进制和二进制格式和之前报道的菌株相比21,22]。

2.8。数据分析

统计分析是使用占据15版本(占据公司,大学城,TX)。社会人口信息、临床资料和实验室结果输入到红色帽安全的网络数据库。此外,Fisher精确检验是用来确定是否有相关性耐药性结核分枝杆菌引起的基因突变和特定血统和评估获得的值之间的差异是否显著。如果双边所有统计测试是重要的值小于0.05。

2.9。道德的考虑

这项研究是获取伦理批准后进行的医学实验室亚的斯亚贝巴大学健康科学学院(AAU-CHS)和警报/ AHRI伦理审查委员会(AAERC)。这项研究的目的是研究参与者解释,和知情同意。监护人或父母为孩子提供了书面同意。同意了从年长的孩子除了父母/监护人同意。研究过程的流程图(图1)。

3所示。结果

3.1。研究参与者的社会人口特征

研究参与者的平均年龄是29 (-14.45 + / SD)年,范围从5个月到76岁,平均年龄为28位差(20-38)。大多数研究参与者,52.3% (114/218),21 - 40。超过一半是女性,61.9%(135/218)(男女比例1:2)。百分之四十一的参与者(91/21)结婚,和29.4%(64/218)是单身。三分之二的参与者中,67.9%(148/218),来自城市地区。在这项研究中,19.7%(43/218)的参与者是失业。总的来说,年龄、性别、婚姻状况、居住面积、职业、和教育现状,研究参与者都发现没有统计协会。

3.2。临床研究参与者的地位

确诊的218临床结核病淋巴腺炎患者中,35.3%(77/218)的研究参与者对公开以前治疗风险。基于研究对象之前治疗的历史暴露在入学之前,83.3%(40/48)已经完成了药物的摄入量,而16.7%(8/48)已经停用抗结核药物。百分之十六的参与者(35/218),53.2%(116/218),80.7%(176/218)和41.7%(91/218)有接触已知的结核病患者,服用生奶的历史,没有BCG疫苗接种史,分别与牲畜,和生活在同一个家庭。此外,所有218名研究参与者同意了艾滋病毒检测,其中27.1%(59/218)是积极的。艾滋病毒确诊的59例,72.8%(43/59)有一个以前的抗艾滋病病毒治疗的历史。在这项研究中,盗汗,食欲不振,咳嗽,先前与结核病患者接触,原料奶利用的历史,生活在同一个家庭,摄入量,历史上任何公开的治疗,艾滋病毒状况,BCG免疫都发现没有统计协会。

3.3。影响淋巴结的分布

218名研究参与者的大多数淋巴结肿大是单边左42.2%(92/218)和右40.8%(89/218)位于淋巴结病。另一方面,后和前颈部淋巴结病占25.2%(55/218)和39.9%(87/218),分别。其次是锁骨上11.5%(25/218),腋窝10.1%(22/218)(表1)。总招募FNA)的样本,3.2%(7/218)孵化期间受到了污染。媒体的视觉特征,如颜色变化从浅绿色到蓝色,液化,柔软的增长,并打破整个媒体,都被认为是污染的文化。文化的积极性相对收益率高咬从双边淋巴结位置收集的样本中,34.3%(12/35),其次是单方面的左侧右侧21.6%(19/88)和21.8%(19/87)的临床疑似病人。

3.4。遗传多样性和细菌分离株的家庭模式

本研究分析了218例疑似结核性淋巴腺炎。因为污染的FNA标本接种LJ媒体孵化期间,7例被排除在最终的研究。五十或23.7%(50/211)隔离从LJ媒体积极培养和收获。在所有这些培养阳性分离株中,100%(50/50)被确认为MTB pcr RD9删除输入(图2)。

spoligotyping由50截然不同的模式根据结核病的洞察力和SITVIT2数据库的网站。在聚类分析,五十隔离被分为11个集群基于spoligotyping模式。的主要spoligotype隔离,62%(31/50)以前在国际数据库,和38%(19/50)孤儿/新发现的模式。根据国际spoligotype(坐)分类,主要是SIT-53 22% (11/50), SIT-37 16%(8/50),坐- 149 10%(5/50),其余占2% (1/50)。使用结核病的洞察力和SITVIT2网站,他们的血统是观察到的分布分为欧美血统(L4)为78%(39/50),18%(9/50)东非印度血统(L3),其次是6%(3/50),和Indo-Oceanic血统(L1)。

基于(L4)家庭类别,38.4%(15/39)属于欧美(T)欧美(T3) 25.6%(10/39), 15.3%(6/39),欧美(T3-ETH), 7.7%(3/39),欧美(H3),和其他欧美(H3-Ural-1),欧美(X1)、和欧美(T2)。在L1,每个由Indo-Oceanic (CAS-Delhi) 54.5% (6/11), (CAS1-Kili) 27.2%(3/11),每个(T5-RUS1)和(Manu2)(图3)。

3.5。药敏的隔离

一线对公开药物(RIF和异烟肼)进行了基因型的药敏检测,其次是二线基因型的DST 50 TB隔离。

百分之十四(7/50)的隔离是对任何药物(异烟肼和RIF)评估。任何单一药物抵抗和RIF被确认为6%(3/50),其次是14%(7/50)的异烟肼(表2)。

只有异烟肼基因突变所致katG在密码子315年在该地区审问S315T1氨基酸序列导致比例最高,为8%(4/50)的单一耐药隔离。另一方面,合并(异烟肼和RIF)观察耐药在6% (3/50)。他们的基因突变katG和rpoB审问地区315密码子的氨基酸序列的变化S315T1和密码子530 - 533不同的氨基酸序列S531L (S450L),分别。

本研究发现百分之六(3/50)的MDR / RR-TB(表3)。对于那些一线MDR基因型的抗结核药物(耐异烟肼和RIF)隔离,基因型的二线(克,菅直人/ AMK /帽,菅直人/帽/ VIO,菅直人。AMK /帽/ VIO,低级DST是菅直人)。幸运的是,没有检测到二线基因型的DST阻力。两个三个耐多药/ RR-TB隔离被认为在艾滋病毒阳性患者。

3.6。耐药基因突变引起的结核分枝杆菌血统

多药耐药性基因型毒株的方差在18.2% CAS1-Delhi T3-ETH(血统3)和9%(血统4)压力。然而,抗结核药物的耐药性之间的关系由基因突变引起的结核分枝杆菌和主要血统不是统计学意义(确切概率法:0.118; )。

其中3 MDR / RR-TB菌株,分离与耐药基因突变造成的,SIT498, SIT53,孤儿坐在显示阻力的基因突变katG,而SIT149和孤儿被显示rpoB基因突变。异烟肼耐药基因突变造成的(katG)和RIF (rpoB)观察drug-resistant-associated基因位点。四个分离的耐异烟肼药物测试katG基因只有基因缺失katG/ WT和基因插入MUT1 (S315T1氨基酸序列的变化)显示突变赋予异烟肼耐药性。没有阻力韩国仁荷基因被观察到。的基因缺失rpoB/ WT8突变和rpoB的杂交/ MUT3 (S531L氨基酸序列的变化)中确定两个rifampicin-resistant MTB隔离spoligotype国际SIT149和孤儿病毒类型。相比之下,基因缺失rpoB/ WT7基因与相应的杂交rpoB/ MUT1 (H526Y氨基酸的变化)被确认的结核分枝杆菌利福平耐药性隔离spoligotype国际孤儿应变(表的类型3)。

4所示。讨论

在目前的研究中,86%(43/50)结核分枝杆菌的分离是对一线抗结核药物敏感。百分之十四的分析菌株对公开抵制对至少一个一线治疗。突变基因也在评估MDR-associated基因位点katG和rpoB。四个分离的耐异烟肼药物测试katG基因只有基因缺失katG/ WT和基因插入MUT1 (S315T1氨基酸序列的变化)授予异烟肼耐药性。没有韩国仁荷在这项研究中观察到药物resistance-associated基因突变。最近的一些研究看着INH-resistant隔离与基因突变韩国仁荷启动子区域,发现0.8%,10 - 12%的频率韩国仁荷(没有katG在埃塞俄比亚)突变(23- - - - - -25),分别高于30.8%和43%,(26,27]。这表明,它也可能在乙硫异烟胺的发展阻力发挥有限的作用[28),因为它同样的目标管理的作用机理和高剂量的异烟肼耐多药结核病患者可能会有微小的影响。我们还发现4/7的比例最高,为57%(4/7)造成的katG基因突变在该地区审讯315密码子和INH-resistant MTB S315T1插入区域隔离,比例为67% (26在类似的研究[]和100%29日- - - - - -31日]。

RIF的情况,我们也发现了一个密码子突变在该地区接受审问,530 - 533年的氨基酸序列的变化S531L插入。这是最常用在异烟肼,RIF结核分枝杆菌耐药隔离从TBLN隔离在埃塞俄比亚26和肺结核27,32,33]。此外,我们已经确定的基因缺失rpoB/ WT7基因与相应的杂交rpoB/ MUT1 H526Y氨基酸的变化RIF结核分枝杆菌耐药性隔离在这个研究。我们的研究结果报道罕见的RIF从TBLN分离株耐药基因突变造成的26]在亚的斯亚贝巴和肺结核病例[24,27]。

同样的研究相比,结果是高于患病率在结核病耐药在埃塞俄比亚淋巴腺炎(34[印度]和低于报告35]。这项研究发现,6%的耐多药/ RR-TB淋巴腺炎患者在三个结核病淋巴腺炎患者。最近的一份报告在埃塞俄比亚进行(36]表示1.4%的耐多药结核治疗的新的和以前TBLN患者和0%37从亚的斯亚贝巴,而1.6%来自印度(35]。异烟肼mono-resistance为8%(4/50)在目前的调查,这是高于来自埃塞俄比亚的报道,3.6%36]。

在最近的研究中,两个耐多药/ RR例阳性艾滋病毒,和异烟肼mono-resistance更与艾滋病患者。因为研究网站被转诊医院,尤其是圣彼得结核病例,患者来自全国各地不同的抗生素治疗后治疗试验,这可以解释为什么他们不应对一线抗结核药物。异烟肼mono-resistance耐药性是初始走向公开反对,镇静和共同途径是促进耐多药结核病[38]。

50隔离进一步以RD9 deletion-based PCR spoligotyping[紧随其后30.,39),没有米。宝被发现。这一发现与研究一致在埃塞俄比亚的各个部分(30.,39- - - - - -41]。缺席的情况下米。宝的病原体TBLN可能表明,牛结核病的病人在人类扮演一个次要角色。也发现了结核分枝杆菌在不同菌株,包括11种不同的坐着孤儿/新菌株。大多数的隔离(78%)属于欧美血统(L4),紧随其后的是印度东非(L3), 18%。最近的一项研究在埃塞俄比亚的亚的斯亚贝巴(地理上类似于我们的研究位置)报道,63.3%的隔离是欧美,和58.3% Indo-Oceanic [39]。研究从埃塞俄比亚北部(Dessie)报道,57.1%是欧美,28.6%是Indo-Oceanic, 14.3%是East-African-Indian [30.]。这可能表明,欧美血统更广泛分布,主要比所有血统相结合。

根据SITVIT2和结核病洞察力数据库,spoligotyping国际输入(坐)数字,本研究中最常见的共享类型新/孤儿株(38%),SIT53 (22%)、SIT37(16%),和紧随其后的是SIT149 (10%)。这些发现与以前分享异同埃塞俄比亚报道,SIT149 SIT53紧随其后的主要菌株和SIT26 [39),后以更高的速度和新菌株不同坐数字(30.]。此外,SIT53和孤儿菌株是主要的菌株在亚的斯亚贝巴,埃塞俄比亚(30.,39]。

需要更多的信息关于EPTB的耐药模式,特别是在高负担国家如埃塞俄比亚。这被认为是有限数量的实验室的难度在这个国家拥有设施执行文化,从肺外结核分枝杆菌药敏试验(DST)标本。此外,即使DRTB的流行病学需要更好的理解在埃塞俄比亚(42]。因为这些问题,我们强烈建议进一步细化。

5。结论

本研究发现3 MDR / RR-TB病例和异构TBLN患者结核分枝杆菌菌株。很大程度上的异烟肼mono-resistance艾滋病患者是一个关键的风险的潜在开发耐多药结核病,如异烟肼mono-resistance耐多药结核病的发生是一个典型的途径。孤儿和SIT53 (T)菌株研究中是最常见的spoligotypes人口。此外,耐药菌株引起的突变被发现在集群菌株,表明clonal-resistant菌株的传播在社区。

结核分枝杆菌的工具,我们用来描述菌株(spoligotyping)倾向于集群研究物种进化和低分辨率的权力。然而,这为未来的研究强调了需要使用一个更好的工具来了解耐药结核病的传播动力学和歧视必须特别留意TBLN和其他肺外结核病更集成控制策略等于肺结核。进一步的类似的研究应该和其他领域的埃塞俄比亚支持综合信息因为TBLN不是直接感染肺结核。然而,TBLN耐药性可能是一个水库,除非患者定期检查。

数据可用性

所有可用的数据完全没有限制。

伦理批准

伦理批准获得从亚的斯亚贝巴大学健康科学学院的临床实验室科学(DRERC)协议号码:DRERC / 469/19 /毫升和AHRI /警报伦理委员会项目注册。不。P012/14(请求的初始审查上述研究项目是充分考虑和批准AHRI /警报伦理审查委员会在其例行会议1月07年,2019)。支持信件从亚的斯亚贝巴大学获得医学科学和Armauer汉森研究所实验室。达成共识,每个参与者简要说明研究的目的和它的好处。药敏试验结果报告给相应的卫生设施进行进一步的管理病人。此外,本研究证实了耐多药结核病病例发现被称为一个耐多药结核病治疗中心。

同意

那些同意参与这项研究签署知情同意书,并登记。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Gebeyehu,。,Abraham, A., Kassu, D., Shambel, A., Selfu, G., Kidist, B., Adane, M., and Melaku, T. participated in the conception and design of the study as well as in the preparation and reviewing of the manuscript. Elena, H., Nigatu, E., Adugna, A., Shiferaw, B., Getu, D., Biniyam, D., and Yordanos, M. coordinated and analyzed the laboratory work. Tsegaye, H. contributed to data management and analysis. All authors read and approved the final manuscript. Gebeyehu Assefa, Selfu Girma and Melaku Tilahun contributed equally to this work.

确认

作者感谢亚的斯亚贝巴大学医学实验室的部门和AHRI援助。先生,我们也感谢我们的研究参与者Tewodros Tariku,和所有AHRI同事提供了洞察力和专业知识和极大地帮助这个项目的发展。这项工作是支持的AHRI核心预算。AHRI收到Sida核心支持,北美防空司令部和埃塞俄比亚政府。