荧光和Ziehl-Neelsen染色技术在肺结核诊断中的诊断产量：区卫生机构的比较研究

摘要

背景．尽管最近诊断方法取得了进展，但涂片显微镜仍然是加纳等高负担国家诊断肺结核的金标准。尽管如此，荧光染色技术提供了一种更有效的检测方法结核分枝杆菌积极的涂片。因此，本研究旨在评估荧光显微镜(FM)和Ziehl-Neelsen (ZN)染色技术在肺结核诊断中的作用。方法．对100例在Kade政府医院门诊(OPD)或直接观察治疗(DOT)中心报告的疑似肺结核患者进行了对比研究。各取2例痰标本。这包括一个斑点和一个早晨的样品。涂片制备，FM和ZN染色。Xpert MTB/RIF检测。结果．采用FM、ZN和XPERT MTB/RIF检测的200份样本中，71份(35.5%)、46份(23.0%)和84份(42.0%)肺结核阳性。FM的平均阅读时间比ZN快3倍，接受度很好(1.5min: 4.6min)。荧光染色对XPERT MTB/RIF检测的敏感性和特异性分别为84.5%和100%，ZN染色的敏感性和特异性分别为54.8%和100%。结论．在资源有限的情况下，我们的研究表明，与常规ZN技术相比，荧光染色技术是诊断肺结核更敏感的检测方法。

1.介绍

结核病造成的结核分枝杆菌仍然是一个重大的公共卫生问题，约有三分之一的世界人口受到影响。2017年，有1000万人感染了结核病，160万人死于这种疾病。95%以上的结核病死亡发生在低收入和中等收入国家。[1］．

一种更快、更简单、更准确、更便宜的结核病诊断方法，对于控制结核病感染者和防止其在社区传播是必要的[2］．各种检查可用于帮助诊断结核病，其中包括胸片、临床怀疑、抗酸杆菌染色、分枝杆菌培养和核酸扩增检测。痰涂片镜检是目前最常用的快速检测方法，广泛应用于肺结核的检测和诊断[2，3.］．痰液中的杆菌可用锌染色法或荧光染色法检测。痰镜检查有助于评估对治疗的反应，并在治疗结束时确定治愈或失败。

在许多发展中国家，结核病的诊断大多基于ZN染色技术[4］．然而，据报道，锌法痰涂片镜检的灵敏度较低且变化不定，范围在20%至80%之间，通常取决于收集标本、制作涂片和检查涂片染色的勤奋程度[4- - - - - -7］．这种方法使得大量病例未被发现，特别是当它成为唯一的诊断手段时。引入FM以改善痰涂片镜检结果。传统FM的灵敏度远优于ZN，可以提供更好的成品率和阳性涂片的检测，而且执行时间更短[8- - - - - -10］．然而，FM的特异性仍有一个挥之不去的疑问，因为存在假阳性的可能性，这可能是由于无机物体加入了氟铬染料[11，12］．此外，成本限制是FM的一个限制[13尤其是在加纳等中低收入国家。

在加纳，肺结核的诊断包括使用常规光镜检查锌染色的直接涂片。FM正在逐渐取代ZN染色涂片镜检，而使用分子技术诊断结核病主要限于教学和地区医院。目前，该国没有书面证据对诊断肺结核技术的应用进行评估。因此，本研究比较了这三种方法对肺结核肺部诊断的诊断效果。

2.材料和方法

这项前瞻性研究是由训练有素的生物医学科学家在东部地区的卡德政府医院进行的。每天上午8时至中午12时采集样本。研究人群包括在Kade政府医院门诊部/DOT中心报告的疑似肺结核患者。总共招募了100名患者进行研究。

２.１.样品采集与制备

研究对象(100名患者)被要求提交两份痰样本，每一份都装在一个干净、无菌、防漏的宽口容器中。共采集样本200份。每位患者的一份样本当场采集，并为受试者提供第二个预先标记的容器，以便在家中采集早晨的样本。涂片染色的准备工作如别处所述[14］．对于每个样品，涂片都是一式两份。同时制备阳性和阴性对照涂片。

2．2.Ziehl-Neelsen (ZN)染色程序

涂片按顺序排列在染色桥上，涂片面朝上，用过滤后的0.1% Carbol Fuchsin浸泡。涂片蒸染5分钟，用水冲洗，沥干。用25%硫酸脱色5分钟，用水冲洗，沥干。然后用0.1%亚甲基蓝溶液复染1分钟，用水冲洗。涂片允许风干，并使用油浸(100倍)物镜进行显微镜检查。

2.3。荧光显微镜染色程序

涂片用过滤过的0.1%金胺浸泡至少20分钟。然后用水冲洗并排水。用0.5%酸醇脱色液涂抹在涂片上30 ~ 60秒，用水冲洗，沥干。然后用0.5%高锰酸钾复染剂浸泡，最长1分钟，用水冲洗。涂片风干后，使用LED照明荧光显微镜(蔡司primo star LED)干物镜(40倍)进行显微镜检查。

２.４.专家MTB/RIF分析程序

XPERT MTB / RIF测定遵循制造商的协议（Cepheid Inc.，Sunnyvale，CA，USA）的协议进行。将样品收集在设置的容器中并用样品试剂的比例均为2：1，并在室温下温育15分钟。将两种毫升（2mL）的试剂处理的样品移液到XPERT盒的样品室中。然后将Xpert墨盒放入Genexpert仪器系统中并运行。结果在90分钟后产生。

2.5。道德考虑

凯德政府医院的当局寻求研究批准。在招聘前从所有参与者寻求书面知情同意书。记录严格保密。

3.数据分析

数据录入Microsoft软件，使用SPSS 23.0 (IBM Inc.)软件进行统计分析。不同变量的数据以百分比表示。采用Kappa检验确定诊断试验之间的相关性，采用受试者工作特征曲线确定试验的敏感性和特异性。P-value <0.05认为有统计学意义。以Xpert MTB/RIF法为参照，比较锌和荧光显微镜检查。GeneXpert阳性和阴性的样本被认为是真阳性和真阴性。

4.结果

采用ZN和荧光显微镜染色技术对来自100个个体的200个样本进行抗酸杆菌(AFB)检测。在无培养条件下，Xpert MTB/RIF扩增并检测特异性靶基因结核分枝杆菌,用作参考。

表格1显示研究中使用的诊断测试的结果。采用ZN染色法、荧光染色法和Xpert MTB/RIF法检测的200例标本中，46例(23.0%)、71例(35.5%)和84例(42.0%)肺结核阳性。在招募的100名受试者中，FM检测出37人(37%)，而ZN染色确定其中25人(25%)感染了AFB。

表格2将ZN和荧光染色结果与Xpert MTB/RIF试验进行比较。84份阳性标本中ZN染色漏检38份(45.2%)，FM漏检13份(15.5%)。荧光和ZN染色技术与Xpert MTB/RIF诊断技术呈正相关;荧光染色与ZN染色相关性较强(kappa=0.864, p≤0.001,kappa=0.584, p≤0.001)。还可以观察到，Xpert MTB/RIF检测阴性的样品，ZN和荧光染色均为阴性。

表3.和4比较锌和FM的诊断性能。荧光染色与ZN染色技术呈正相关(kappa=0.680, p≤0.001)。可见，荧光显微镜下锌染色阳性的样品中有25份(35.2%)未检出，而锌染色阳性的样品中只有1份(0.8%)未检出。两种检测的特异性相同(100%);荧光染色的敏感性(84.5%)高于锌染色(54.8)。ROC分析(图1当将测试与参考相比，还经过比Zn染色（AUC = 0.774），还证明荧光染色（AUC = 0.923）是更好的诊断试验。

表格5显示荧光和锌染色技术染色的斑点和清晨痰标本诊断率的比较。在37份AFB检测阳性的清晨标本中，34份(91.8%)对应的斑点标本检测阳性，3份(8.1%)荧光染色阴性。Cohens Kappa(0.935)表明，在清晨和现场样品之间具有很强的一致性;但差异有统计学意义(p<0.05)。在25份AFB检测阳性的清晨标本中，21份(84.0%)对应的斑点标本检测阳性，4份(16.0%)检测阴性。

荧光染色技术的平均阅读时间比ZN技术快3倍，接受度非常好(1.5 min: 4.6 min)(图2）

5.讨论

文化中AFB的生长检测被认为是TB诊断的最敏感方法不是经常在我们的健康设施中完成的，这主要是由于细菌的增长缓慢以及测试所需的设备缺乏设备。因此，TB的提示诊断通过AFB涂片显微镜，主要是由Zn技术，最近通过荧光显微镜和Xpert MTB / RIF，在很少的设施中具有它们。与Xpert MTB / RIF试验进行比较Zn染色涂片和荧光染色的结果，以检测痰液样品中的AFB。

本研究结果显示，Xpert MTB/RIF在筛查的200个样本中比FM高出约15%，比ZN高出45%。许多研究已经证实Xpert MTB/RIF在诊断肺结核方面优于荧光显微镜和锌显微镜[15- - - - - -18］．在我们的研究样本中，FM比ZN染色技术具有更高的诊断率。这一发现证实了之前报道的FM在AFB检测方面优于传统ZN技术[19- - - - - -21］．相比之下，荧光显微镜产生读数的速度大约是ZN技术的3倍，因此帮助每个幻灯片节省大约2分钟(66%)，这证实了Marais, Brittle[的研究结果][22］．因此，LED-FM的引入将节省时间，并允许高质量的显微镜。

该研究显示，ZN染色技术的假阴性比例(45.2%)高于FM(15.5%)，这与在尼泊尔Sinamangal进行的一项研究一致[19]， FM染色假阴性率仅为2.78%，与ZN假阴性率为40.27%形成鲜明对比。FM也能比ZN发现更多的少杆菌病例。FM优于ZN的病例检出率可与几项研究中发现的报告相媲美[8，23- - - - - -25］．

替代诊断方法的一个重要基准是它与金标准建立线性关系的能力。有趣的是，FM和ZN技术与Xpert MTB/RIF诊断技术呈正相关。荧光染色与ZN染色呈较强的线性关系(kappa=0.864, p≤0.001;kappa=0584, p≤0.001)。另外，Stella等人在FM和ZN技术与PCR方法比较时发现了类似的结果(kappa FM vs PCR=0.60;ZN对PCR=0.54) [26］．

在理想情况下，诊断技术应为100％特定和100％敏感。我们的结果表明，与Xpert MTB / RIF的Zn和FM技术均显示出类似的特异性（100％）;然而，与XPERT MTB / RIF相关，FM（84.5％）比Zn染色更敏感（54.8％）。一般来说，据报道，在肺结核的诊断中，与Zn相比，荧光染色技术提供更好的敏感性和特异性[27，28］．

本研究表明，无论是FM染色还是ZN染色，与斑点样品相比，清晨样品产生的AFB更多。有趣的是，现场采集的痰液涂片呈阳性，早上采集的痰液标本也呈阳性。这与Myneedu等人进行的一项研究一致，该研究表明，与早晨的样本相比，立即在实验室附近采集的第一个痰液样本(点样本)显示出较低的涂片阳性率。同样，他们还报告了所有AFB阳性斑点样本在清晨涂片中也呈AFB阳性[29］．为了减少误诊，这一结果要求重新审视标准的2天方案，即连续两天收集诊断肺结核的样本。当采用一次性样品采集时，清晨的样品被证明是理想的。

综上所述，FM技术比ZN技术具有更高的诊断价值。该方法灵敏度高，可准确检测出少杆菌病例，对肺结核的早期治疗具有指导意义。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

信息披露

作者没有获得任何资助机构的资助。这项研究是由来自Cape Coast大学的作者雇佣的。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

参考文献

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