涂片镜检在苏丹东部肺结核诊断中的应用

摘要

背景．在苏丹，与许多其他低收入和中等收入国家一样，结核病诊断在很大程度上依赖临床症状和涂片镜检。本研究的目的是探讨痰涂片阳性对苏丹东部肺结核患者的阳性预测价值。方法．2014年6月至10月和2016年1月至7月，采用直接Ziehl-Neelsen (ZN)染色和光镜对两份有结核病症状患者的痰标本进行了调查。如果其中一个样本涂片阳性，则将两个样本合并，在−20°C下存储，并送往德国国家参考实验室(NRL)。去污后，对样本进行重复显微镜观察和培养。采用聚合酶链反应(PCR)对培养阴性/污染样本进行调查。结果．研究了总共383个样品。重复显微镜被分类为123（32.1％）为阴性，其中31种培养阳性。当PCR和培养结果被认为在一起时，这增加到80。共有196个样品培养阳性，其中171（87.3％），14（7.1％）和11（5.6％）M.Tuberculosis，M.细胞内和混合物种。总的来说，15.6％（57/365）的样本没有证据结核分枝杆菌，阳性预测值为84.4%。结论．在苏丹当地实验室和德国国家医学实验室进行的涂片镜检结果不一致;此外，相当多的样本没有证据结核分枝杆菌．涂片显微镜的改善质量控制和更具体的诊断至关重要，以避免可能的过度处理。

1.背景

在全球范围内，2016年估计发生了1040万例新结核病例，其中大多数病例来自低收入和中等收入国家[1]．这些案件中的三分之一以上仍未核查。快速和准确的结核病诊断对于及时启动治疗以及最终对疾病的控制至关重要。XPERT MTB / RIF，专为测试低级实验室和初级医疗诊所测试临床标本的分子试验而改变了诊断景观[2，3.]．Xpert MTB/Rif已成为许多低收入和中等收入国家结核病诊断算法的一个组成部分[3.- - - - - -5]．然而，尽管Xpert MTB/Rif成功推出，涂片镜检仍然是大多数资源匮乏环境中结核病的主要诊断工具。

据报道，在被动结核病病例中，涂片镜检诊断结核病的敏感性和特异性分别为30-89%和93-100% [6，7]．在结核病流行调查的背景下，已报告了较低的特异性[8]．假阳性涂片显微镜的一些根本原因是实验室误差，例如分析误差或样本混合，并且涂片显微镜的无法无法区分结核分枝杆菌复合结核杆菌(MTBC)和非结核分枝杆菌(NTM)。在许多低收入和中等收入国家，已经作出了相当大的努力来实施涂片镜检的外部质量保证计划，以解决分析错误[9]．苏丹，更具体地说，苏丹东部，拥有外部质量保证计划。EQA方案根据定期重新检查多个随机选择的幻灯片[10]．涂片镜检无法区分MTBC和NTM感染，而呼吸道NTM感染在临床和放射学上类似于肺结核的事实进一步复杂化。因此，涂片镜检诊断结核病的特异性受诊断质量和NTM感染流行率的影响，这对临床决策具有重要意义。

在苏丹，与许多其他低收入和中等收入国家一样，结核病诊断主要依赖临床症状和涂片镜检[11，12]．更先进的诊断方法，如Xpert MTB/Rif或聚合酶链反应(PCR)和培养，目前还不能用于结核病的常规诊断。本研究旨在探讨Ziehl-Neelsen (ZN)涂片镜检在苏丹东部地区的阳性预测价值(PPV)，其诊断特异性和患病率均受该疾病的影响。

2.材料和方法

2．1．研究背景

这项研究在苏丹东部的三个地点进行，即Kassala、苏丹港和El-Gadarif(图)1）.东苏丹与埃塞俄比亚、厄立特里亚和埃及接壤，与苏丹的五个州接壤。选定的三个抽样地点是结核病和呼吸系统疾病的转诊诊所，而且非常接近国际边界。大约有60万人居住在这三家诊所的集水区。这些人主要是贝贾人、阿拉伯人、努比亚人、西非人，以及亚洲和欧洲的少数民族。在接受调查的三家医院中，每家医院每年登记的结核病病例为700至1300例。涂片阳性率约为40%-50% [13- - - - - -15]．一般而言，苏丹东部的艾滋病毒流行率据记载高达0.5%，而结核病患者的流行率则高达18.3% [15，16]．总的来说，在苏丹登记的所有结核病病例中，只有17%的人知道艾滋病毒的状况[1]．长期以来，苏丹东部一直存在武装冲突。在政府和反叛组织签署和平协议后，停火于2006年结束。

2．2.研究总体和抽样

本研究共纳入383例经涂片镜检、临床表现及胸片检查确诊为肺结核患者的痰标本。在2014年6月至10月和2016年1月至7月两个招募期间，从苏丹东部的卡萨拉、苏丹港和El-Gadarif教学医院的门诊部招募患者。从每个病人身上采集两份痰标本，一份斑点和一份清晨。这些痰标本在采集处进行直接锌显微镜观察[6]．如果至少有一个样本涂片阳性，则将两份痰标本合并，在−20°C下存储，并分两批运送到德国博尔斯特尔的国家参考实验室(NRL)。样品保存时间最长为6个月。所有在招募期间收集的样本一起运送。第一批样品从苏丹到德国的过境时间为3天，第二批样品从苏丹到德国的过境时间更长。所有样品均在室温下装运。

2．3.德国NRL实验室程序

根据现行指南，用氢氧化钠/ n -乙酰半胱氨酸(NALC-NaOH)去污染和消化样品[17]．部分重悬的痰颗粒用于涂片镜检。2014年收集的样本( )使用Kinyoun方法结合自动染色系统(ZN Aerospray®TB玻片染色器/细胞离心机，Wescor, Logan，美国)进行染色，并使用光镜(油浸透镜，100倍)进行读数。2016年收集的样本( )，金胺O染色，荧光发光二极管(LED)显微镜(40倍)读取。结果记录为涂片阳性或涂片阴性。根据世界卫生组织(WHO)的分级系统，所有涂片阳性标本均分为缺乏(+/ -)、1+、2+和3+。

无菌接种分枝杆菌生长指示管(MGIT;Becton-Dickinson，海德堡，德国)与生长补充剂和抗生素(PANTA™;正欲,德国海德堡)。MGIT在BD MGIT 960仪器中培养最多42天。此外，在Löwenstein-Jensen和Stonebrink斜坡(自产或德国莱比锡Enclit)进行抗生素补充培养，并在37°C下最多培养56天。

用Kinyoun染色显微镜检查阳性培养物的抗酸杆菌，并将其接种于哥伦比亚血琼脂(Becton-Dickinson, Heidelberg, Germany)以排除污染。使用市售的线探针法(HAIN基因型CM和基因型TBC;HAIN Lifescience GmbH, Nehren, Germany)和内部转录间隔(ITS)测序。将染色和血琼脂上显示有污染物的flag阳性MGIT在Löwenstein-Jensen斜坡上进行继代培养，并在37°C下再培养28天。如果三种培养物或传代培养物中至少有一种分枝杆菌生长，则培养结果报告为阳性;如果在任何液体和固体培养基中没有生长，则为阴性;如果三种培养物和传代培养物都被污染，则为污染。

如前所述，使用内部实时PCR检测MTBC或NTM对2016年培养中未显示任何分枝杆菌阳性结果的沉积物进行了检测[18]．为此，根据制造商说明，使用QIAamp®DNA Minikit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)对储存的痰粒进行脱氧核糖核酸(DNA)提取。

2．4．分析

数据被输入一个Excel数据库。使用社会科学统计软件包(SPSS) (version 20.0, SPSS Inc, Chicago, Illinois)计算比例和95%置信区间(CI)。使用卡方检验比较比例。

3.结果

分析共纳入383个样本:来自El-Gadarif、Kassala和Port Sudan的分别为161(42%)、133(34.7%)和89(23.2%)(图)2）.患者的中位年龄为35（四分位数25; 45）。一小部分患者在15岁以下（ ，3.4％）;大多数是男人（ ，64％）。

在苏丹和德国NRL测定的涂片评分是不同的(图)2）.样本的三分之一( 在苏丹的涂片检测呈阳性，而在德国的NRL则被归类为涂片阴性(见表)1）.其中苏丹89例(72.4%)、22例(17.9%)和7例(5.7%)的涂片评分分别为1+、2+和3+，缺失5例(4.0%)。

196个样品(51.2%)显示分枝杆菌生长，136个样品(35.5%)未显示分枝杆菌生长，51个样品(13.3%)被污染(图)2）.绝大多数( (87.3%)结核分枝杆菌， 14株(7.1%)m . intracellulare11株(5.6%)为混合培养，其中7株为混合培养结核分枝杆菌和m . intracellulare组,一个结核分枝杆菌和M. Fortuitum.,一个结核分枝杆菌和m . asiaticum,一个结核分枝杆菌和棒状杆菌属一种是混合的m . intracellulare小组和一个未知分枝杆菌物种。共培养阴性或污染标本187份(48.8%)，其中169份经实时PCR检测，MTBC DNA阳性者127/169份(75.1%)，NTM DNA阳性者8/169份(4.7%)。

在那些涂片镜检结果呈阴性的样本中( ；32.1%)， 31例(25.2%)为MTBC培养阳性。结合PCR和培养结果，检出率为80份(71%)1）.除了仅通过培养物或PCR的缺点证据的23个样品之外，PCR的34种培养阴性样品并未显示任何分枝杆菌DNA的证据。总体而言，57（15.6％）样品没有通过培养或通过PCR的MTBC证据，而通过培养或PCR MTBC可以证明308个样品，导致涂片显微镜的阳性预测值为84.4％（95％CI：80.7-88.1）（表1和图2）.

4.讨论

这项研究显示，在苏丹，10%的涂片阳性样本没有任何分枝杆菌的证据，在德国，采用培养或PCR作为参考标准。由苏丹当地镜检中心和德国NRL确定的涂片评分一致性不佳。在苏丹被归类为涂片阳性的样本中，有三分之一在德国的NRL被发现为阴性。

在大多数资源有限的情况下，结核病是根据涂片镜检和临床发现诊断的。在被动病例发现的情况下，涂片阳性通常为10%-15%。假设特异性为98-99%，涂片阳性率为10%-15%，阳性预测值为75%-91%2) ［19]．非洲和亚洲研究人员报告的阳性预测值差异很大(60-98%)[20.- - - - - -26]．结果的异质性可能是因为肺结核患病率和涂片特异性的差异。不幸的是，本研究既没有评估患病率，也没有评估特异性，排除了任何关于低阳性预测值的潜在原因的确切结论。

一般来说，涂片对肺结核的不佳特异性是由于两个原因:(i)镜检错误和(ii) ntm的存在。在本研究中，特异性降低同样可归因于阅读和染色错误以及ntm的存在。除一份培养及PCR阴性样本外，其余均为阴性样本( )在NRL重复检查时涂片阴性。最好通过适当的培训、定期监督和国家外部质量保证计划来解决阅读和染色错误[6，9]．区分结核分枝杆菌ntm需要分子诊断，如Xpert MTB/Rif或培养。

在这项研究中，在当地医院诊断为涂阳肺结核的7名患者中，有1人没有任何证据表明患有涂阳肺结核结核分枝杆菌在德国进行的细菌培养或PCR检测。这些患者开始接受四联疗法，使用可能有毒的药物，但可能没有患结核病。最好的情况是，如果这些患者真的没有患结核病，他们不会从治疗中获益，而是会在患有慢性肺病(如支气管扩张)的情况下存活下来。在最坏的情况下，这些人可能会因潜在疾病恶化和/或死亡，如肺癌、慢性阻塞性肺病、纤维化或NTM感染等其他疾病。然而，在资源匮乏、诊断和治疗选择有限的环境中，除了急性肺炎和结核病外，几乎没有什么方法可以为患有潜在致命肺病的患者提供治疗。这需要与接受结核病治疗的个人及其家庭将承受与治疗相关的巨额费用这一事实进行权衡。医疗保健系统亦须累积成本[27，28]．

这项研究有几个优点。这是一项在苏丹东部三家公立医院进行的多地点研究，使研究结果适用于类似的情况。培养和分子诊断在资源丰富的国家参考实验室进行。将分子诊断法与一种液体和两种固体培养相结合，减少了将样本误分类为阴性的可能性。

该研究的局限性包括缺乏关于这种环境中涂片显微镜的敏感性和特异性的数据，并且在提出调查中的个人中未知的结核病患病率。此外，长时间的过渡时间可能导致一些样品被错误地归类为文化负数。然而，这是通过用分子方法调查培养阴性样品来解决的。临床数据如艾滋病毒状态，胸部放射线照相结果和治疗结果。汇集了来自每位患者的两个样品。如果其中一个样品被涂抹阴性并且另一个稀释阳性阳性，则汇集样品可以在NRL处被分类为涂片阴性。

总而言之，在苏丹当地实验室和德国国家医学实验室进行的涂片镜检结果不一致。此外，涂片镜检在苏丹东部的阳性预测值小于90%。一半的假阳性结果是由于阅读和染色错误，而另一半是由于ntm的存在。前者需要通过质量保证计划、培训和监督来解决;后者将需要更具体的确认试验，如Xpert MTB/Rif，其他分子诊断，或培养，以避免可能的过度治疗。这在主动发现病例的情况下更为重要，因为前测概率低于被动发现病例[29]．

缩写

PPV:	阳性预测值
MTBC:	结核分枝杆菌复杂的
特种加工:	Nontuberculous分枝杆菌
聚合酶链反应:	聚合酶链反应
锌:	Ziehl-Neelsen
海军研究实验室:	国家参考实验室
NALC-NaOH:	氢氧化钠/ n -乙酰半胱氨酸
领导:	荧光发光二极管
人:	世界卫生组织
MGIT:	分枝杆菌生长指标管
背景:	脱氧核糖核酸
其:	内部转录的垫片
置信区间:	置信区间
SPSS:	社会科学统计软件包
艾滋病毒:	人类免疫缺陷病毒。

数据可用性

经与批准本研究的医学伦理委员会协商，由于参与者的隐私保护，本研究的数据不能公开。因此，共享一个匿名和识别的数据集是不可能的。

伦理批准

这项研究得到了苏丹喀土穆联邦卫生部国家研究伦理委员会和苏丹喀土穆大学医学院机构审查委员会的批准。85-03-09)。

同意

书面知情同意参加该研究是从个人或儿童监护人的情况下获得的。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

Eltahir A. G. Khalil、Ulrich E. Schaible、Lothar H. Wieler、Mohammed A. M. Bakheit、Saad E. Mohamed- noor、Mohamed A. Abdalla、Elvira Richter、Susanne Homolka、Sönke Andres、Doris Hillemann和Stefan Niemann参与了研究的设计、协调以及手稿的审查和修正。Yassir A. Shuaib收集了样本并进行了实验室工作。Yassir A. Shuaib、Knut Lonnroth和Katharina Kranzer参与了数据分析和解释。Yassir A. Shuaib和Katharina Kranzer起草并审阅了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

致谢

作者想要感谢所有的研究参与者和技术人员的重要帮助。感谢卫生部在卡萨拉、埃尔-加达里夫、苏丹东部港口、德国博尔斯特尔研究中心和德国柏林福大学达勒姆研究学院完成这项工作的贡献。第一作者是DAAD奖学金获得者，资助项目编号为。57076385.

参考文献

1. 谁,全球结核病报告，世卫组织，瑞士日内瓦，2017年。
2. 国际药品采购机制，《结核病诊断技术和市场概况》，B D，编辑，2017年，世卫组织:日内瓦，瑞士。p。90。
3. W. Sikhondze, T. Dlamini, D. Khumalo等，“Xpert的全国推广^®斯威士兰MTB/RIF:实施的头三年，”公共卫生行动，第5卷，第5期。2, pp. 140-146, 2015。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
4. 高捷，A. Somoskïvi, j - l。Berland等人，“海地耐多药结核病新诊断算法的逐步实施”，国际肺结核和肺病杂志，卷。18，不。2，pp。220-226,2014。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
5. S. C. Van Kampen, N. H. Susanto, S. Simon et al，“引进专家MTB/RIF对印度尼西亚耐药结核病患者诊断和治疗的影响:一项前后干预研究，”《公共科学图书馆•综合》，第10卷，第5期。6、文章编号e0123536, 2015。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
6. 谁,改进痰涂片镜检用于肺结核诊断的方法专家组会议世卫组织，瑞士日内瓦。
7. A. Cattamanchi, J. L. Davis, M. Pai, L. Huang, P. C. Hopewell，和K. R. Steingart，“漂白剂处理是否增加痰涂片镜检诊断肺结核的准确性?”临床微生物学杂志，卷。48，没有。7，pp。2433-2439,2010。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
8. A. H.Van't Hoog，H. K.Meme，K.F. Laserson等，“结核病患病率调查的筛选策略：胸部射线照相和症状的价值，”《公共科学图书馆•综合》，第7卷，第5期7、Article ID e38691, 2012。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
9. 谁,DOTS规划中痰液显微镜检查的质量保证:西太平洋国家的区域指南马尼拉,菲律宾，瑞士日内瓦，2003年。
10. FMH，“苏丹结核病项目的深入审查”，刊于苏丹国家结核病规划(NTP)，E.遵守，ed。，p。75，联邦卫生部，苏丹喀土穆，2009年。视图:谷歌学术搜索
11. R. Singhal和V. P. Myneedu，“显微镜作为肺结核的诊断工具”，国际分枝杆菌学杂志，第4卷，第4期。1, pp. 1 - 6, 2015。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
12. 谁,苏丹肺结核概要，世卫组织，瑞士日内瓦，2016年。
13. T. M. Abdallah和A. A.A.Ali，“苏丹东部结核病流行病学”热带生物医学亚太杂志，第2卷，第2期12，页999-1001,2012。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
14. T. E. M. Abdallah, F. E. M. Toum, O. H. Bashir等人，“苏丹东部非肺结核的流行病学”，热带生物医学亚太杂志，第5卷，第5期。6, pp. 505-508, 2015。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
15. T. M. Abdallah，M.F. Siddig和A.A.Ali，苏丹东部喀萨拉核心病患者艾滋病毒感染的Seroprevalence，“艾滋病和HIV研究杂志，第3卷，第2期。8，页161-163,2011。视图:谷歌学术搜索
16. 提前,苏丹HIV流行病学分期和分析，卫生部，喀土穆，苏丹，2013。
17. 《分枝杆菌学实验室手册》Mycobacteriology实验室手册M. Matsumoto等。，世卫组织，瑞士日内瓦，2014年。视图:谷歌学术搜索
18. D. Hillemann, R. Warren, T. Kubica, S. Rusch-Gerdes, S. Niemann，“Real-Time PCR快速检测结核分枝杆菌北京基因型株”，临床微生物学杂志，第44卷，第5期。2，第302-306页，2006。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
19. H. L. Rieder, V. D. Armand, M. K. Kai等，低收入国家结核病细菌学服务的优先事项，国际结核病和肺病联盟(联盟)，巴黎，法国，2007年第2版。
20. N. Alfred, L. Lovette, G. Aliyu等人，“在资源有限的环境中优化结核分枝杆菌检测”，BMJ开放，第4卷，第4期。3、文章编号e004093, 2014。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
21. M.Bhalla，Z. Sidiq，P. P. Sharma，R.Singhal，V.P.Myneedu和R. Sarin，发光二极管荧光显微镜的表现为诊断结核病，“国际分枝杆菌学杂志，第2卷，第2期3, pp. 174-178, 2013。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
22. G. George, P. Mony, and J. Kenneth，“环介导等温扩增、荧光涂片镜检和培养对诊断结核病的效果比较”，《公共科学图书馆•综合》，第6卷，第2期6、文章编号e21007, 2011。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
23. B.Gelaw，Y.Shiferaw，M. Alemayehu和A. Bashaw，“Loop介导的等温扩增测定和涂片显微镜的比较”培养型结核病诊断准确性“《BMC传染病》杂志，卷。17，不。1，物品号。79,2017。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
24. D. A. Geleta, Y. C. Megerssa, A. N. Gudeta, G. T. Akalu, M. T. Debele，和K. D. Tulu，“Xpert MTB/RIF分析用于诊断远程医疗机构痰标本中的肺结核临床微生物学和疫苗”，BMC微生物学，卷。15，不。1，物品号。566,2015。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
25. L. E. A. Kivihya-Ndugga, M. R. A. Van Cleeff, W. A. Githui等人，“在资源贫乏的城市环境中，Ziehi-Neelsen和荧光显微镜诊断结核病的综合比较，”国际肺结核和肺病杂志，第7卷，第5期12，页1163-1171,2003。视图:谷歌学术搜索
26. M. Bonnet, L. Gagnidze, W. Githui等人，"内罗毕周边卫生中心基于led的荧光显微镜诊断结核病的性能"，《公共科学图书馆•综合》，第6卷，第2期2、文章编号e17214, 2011。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
27. T. Tanimura, E. Jaramillo, D. Weil, M. Raviglione和K. Lönnroth，“低收入和中等收入国家结核病患者的经济负担:系统综述”，欧洲呼吸杂志号，第43卷。6, pp. 1763-1775, 2014。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
28. Y. V. Laurence, uk Griffiths, and A. Vassall，“卫生服务和治疗结核病患者的成本:系统文献综述”，药物经济学第33卷第3期9, pp. 939-955, 2015。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
29. 谁,活动性肺结核的系统筛查:原则和建议，世卫组织，瑞士日内瓦，2013年。

版权

版权所有©2018 Yassir A. Shuaib等。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。