Mefloquine及其对映异构体对抗结核分枝杆菌体外和巨噬细胞

抽象的

客观的。结核病是一个严重的公共卫生问题。感染多药的结核病临床病例的数量增加（MDR）结核分枝杆菌需要开发新疗法。设计。我们调查了甲氟喹和两个对映异构体的效果（+）reythro--Floquine和（+）threo-mefloquine对结核分枝杆菌环境中的菌株类似于肉芽肿环境和巨噬细胞的各个方面。结果。结果表明，甲氟喹（消性混合物）和（+）红氟喹具有杀菌活性结核分枝杆菌酸性，低氧张力和巨噬细胞中的菌株。然而，在渗透压增加下，该活性受损。结论。鉴定病原体中甲氟喹的靶标将允许开发具有抗结核活性的新药物。

1.简介

尽管结核病是一种严重的人类病，与高死亡率有关，但多年来，该疾病的治疗几乎没有发展。该疾病的主要疗法仍基于40年前引入的抗生素。最近，新化合物在动物模型中显示出有希望的活动，目前正在临床试验中[1，，，，2]。尽管如此，还需要开发新抗生素的新靶标。例如，TMC207（Bedaquiline，Diarylquinoline）是一种具有新靶的化合物结核分枝杆菌[[2，，，，3]，用于ATP合酶的质子泵的亚基C。ATP合酶是一种利用质子流过细菌膜的酶来合成ATP。因此，该化合物非常吸引人，但是由于细菌具有多种ATP合成机制，因此耐药性会很快发展。此外，经过修饰以提供抗结核活性的光谱酰胺可能表明一种有效的方法来开发新型抗结核化合物[4]。MeropeNem，aβ- 抑制L-D转肽酶的lactam抗生素也已被证明可以实现结核分枝杆菌[[5]和班级β- lactams（碳青霉烯）正在越来越多地探索。β- lactams是安全的抗生素，因此可以选择。

测试一系列针对抗菌活性的喹啉分枝杆菌，我们确定了体外和体内有效的杀菌化合物，甲氟喹[6，，，，7]。尽管甲氟喹通常是针对疟疾的预防，但由于预防的持续时间短，因此其抗菌活性从未得到理解。在少数散布和肺部的患者中，甲氟喹的临床用途分枝杆菌据报道，感染显示成功[8]。此外，甲氟喹可以是三种不涉及大花环的药物方案的一部分，因为M. Avium在感染的实验模型中所证明的疾病[9]。

基于上述发现，我们决定调查甲氟喹的活动结核分枝杆菌。在人类感染过程中，结核分枝杆菌生活在吞噬细胞液泡和颗粒中遇到的环境中。

实际上，在这两种环境中，病原体都暴露于诸如低氧张力，高渗透和酸性pH的状态[10]。在巨噬细胞中结核分枝杆菌抑制吞噬体的酸化[11]。在感染过程的后期，细菌能够在Caseum遇到的酸性环境中生存。因此，抗结核活性的化合物需要用途广泛，并且在各种环境条件下具有对细菌的活性。这种特性并不总是用于治疗结核病的化合物的共同点，其中许多特性在疾病阶段的活性有限，并且在感染过程中遇到的某些疾病中缺乏最大活性。

几年前，我们确定甲酚素的甲氟喹体外具有杀菌活性分枝杆菌复杂的 [6，，，，7]。甲氟喹是一种用于治疗和预防疟疾的化合物[12]并且有一个很长的半衰期，每周一次管理一次。在小鼠中的研究表明，该化合物可以每三天给药一次以治疗分布M. Avium感染 [7]。此外，甲氟喹在细胞内达到了非常高的浓度，这是抗结核化合物所需的特性。

Mefloquine是一种对映异构体，由（+）红氟喹，（ - ）reythro-gefloquine，（+）threo-mefloquine和（ - ）threo-mefloquine制成。在这项研究中，我们评估了甲氟喹及其对映异构体对不同菌株的活性结核分枝杆菌在有氧和厌氧条件下，在高质量条件下，在酸性pH下。在所有条件下，活性对映异构体都是杀菌剂，尽管它们在高渗环境中的活性略有下降。

2。材料和方法

2.1。细菌

结核分枝杆菌H37RV和Erdman是从美国型培养物中获得的，并在37°C下用OAC（油酸，白蛋白和过氧化氢酶，DIFCO底特律，MI）培养到Middlebrook 7H10琼脂板上。检查菌落的纯度，并在7H9肉汤中用OAC放置5天。然后，将悬浮液离心（1,000倍RPM），然后将沉淀重悬于Hank的平衡盐溶液（HBSS）中。然后，使用McFarland标准将浓度调整为所需的生物体数量。还使用了从中国获得的两种不同的临床分离株（分离株400）和巴西（分离株368），对INH和利福平具有抗性。

2.2。抗生素

Mefloquine的外消毒混合物由Walter Reed陆军研究所（Bethesda MD）提供。如所描述的[13]。所有化合物均根据NIH合同N01-AI-5402从Walter Reed陆军研究所获得。

INH和利福平购自Sigma Chemicals（密苏里州圣路易斯）。

2.3。体外测试

如前所述进行最小抑制浓度（MIC）[6]。将接种物准备为10⁵生物（通过用OAC镀到7H10琼脂上，确认）。对照包括不添加药物的细菌。每天监测细菌生长，并在20天后记录结果。

为了确定甲氟喹在受限氧张力的条件下是否活跃，我们使用韦恩系统测试了H37RV和Erdman菌株[14]。在非复制状态下，对细菌评估了甲氟喹（+）红细胞和（+）threo-氟喹。浓度来自2 μg/ml至128 μ使用G/mL。

此外，使用等摩尔浓度（0.3 m）和pH 5.5（使用0.1 n HCl建立）的葡萄糖补充7H9肉汤的高质量和酸性条件被用作检查甲氟喹活性的环境。将细菌保持在描述的24小时的状态下，然后暴露于甲氟喹，红氟喹和threo-氟喹。

2.4。巨噬细胞测定法

还使用巨噬细胞模型确定了甲氟喹及其对映异构体的活性。将THP-1巨噬细胞播种为10⁵24孔中的细胞，并与5孵育 μG/ml乙酸凤梨酸猴（PMA，Sigma，圣路易斯，密苏里州）。12小时后，洗涤粘附细胞，然后与1×10孵育⁵H37RV 1 h。吞噬作用后，用HBS洗涤巨噬细胞单层以去除细胞外细菌。然后，将单层用不同浓度的甲氟喹和对映异构体处理4天，然后如前所述裂解单层[6]。对照孔并行运行，以确保缺乏与药物相关的毒性。然后将巨噬细胞裂解物稀释并铺在7H10琼脂板上，以定量细胞内可行细菌的数量。

2.5。统计分析

使用学生的测试和单向方差分析（ANOVA）分析了结果的重要性。A等于或低于0.05的值被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1。麦克风在体外

确定结核分枝杆菌在体外与甲氟喹和映异构体分离株，细菌菌株暴露于不同浓度的甲氟喹，（+）threo-氟喹，（ - ）threo-甲氟喹，（+）红氟喹和（ - ）红氟喹和（ - ）红细胞。桌子1显示了两种多药抗性菌株的麦克风结核分枝杆菌，以及H37RV和Erdman菌株。结果表明，甲氟喹和（+）红细胞对H37RV和Erdman更为活跃结核分枝杆菌菌株比（ - ）红氟喹，（+）threo--Floquine和（ - ）threo-mefloquine。当针对MDR菌株进行测试时，结果与针对H37RV和Erdman菌株获得的结果相似，表明该化合物对Rifampin和INH没有交叉抗性。

3.2。在氧气张力降低的环境下的活动

许多人结核分枝杆菌在体内遇到细菌的氧气很差[10]。由于许多抗结核药物在耗尽氧气耗尽的环境中失去活性，因此我们在微型恐惧症环境（非复制细菌，NRB）下进行了测定MIC分析。据确定，甲氟喹和（+）红细胞和（ - ）红细胞素的麦克喹的麦克风与在具有氧气的环境中获得的麦克风相似（表2）。

3.3。在高渗环境和酸性pH下的活性

由于肉芽肿的环境是高质性和酸性的，因此可能影响微生物对抗菌剂的敏感性的特征，因此在两种条件下孵育24 HS，然后暴露于甲氟喹或映体剂。如表中所示3，在渗透压增加（0.3 m的葡萄糖）下暴露于甲氟喹，但在酸性pH下不影响该化合物抑制的能力结核分枝杆菌生长。当以0.1 m浓度的葡萄糖浓度测试甲氟喹时，获得的MIC为8 μH37RV和Erdman菌株的G/ML，表明高渗透性对易感性的影响取决于浓度。

3.4。巨噬细胞的活性

检查甲氟喹和对映异构体对细胞内的活性结核分枝杆菌，我们用H37RV应变进行了巨噬细胞感染结核分枝杆菌并用4个处理受感染的单层 μg/ml的化合物。4的浓度 μg/ml是甲氟喹的血清浓度。已知该化合物集中在红细胞和肝细胞中最多80倍[12]。甲氟喹和红细胞对映异构体对细胞内H37RV显着活跃（表4）。没有观察到单层的毒性。

4。讨论

甲氟喹是用于疟疾预防的喹啉。该药物每周一次为穿越疟疾流行区域的个体提供一次。甲氟喹具有杀菌活性的发现结核分枝杆菌和M. Avium复合物是显着的，并得到了以下事实的支持：另一个喹啉TMC207（Bedaquiline）活跃于结核分枝杆菌也[2，，，，3，，，，6]。然而，观察到，暴露于bedaquiline会导致选择抗性突变体，而暴露于甲氟喹则与对化合物的抗性发展无关[15]表明，细菌上的靶标的是（S）不相同，或者甲氟喹对分枝杆菌的靶标的靶标的。

在这项研究中，我们检查了甲氟喹和对映异构体的活动结核分枝杆菌。类似于观察到的M. Avium[[6，，，，7]甲氟喹和（+）红细胞素都是最活跃的化合物，而threo-inantiomers的活性较差。我们还评估了在肉芽瘤内遇到的条件下的化合物的活性。抗结核疗法的局限性之一是，在有氧和厌氧条件下，并非所有使用的抗生素都同样活跃。因为肉芽瘤内部的环境是微粒细胞的[10]新化合物应该能够在这些条件下表现良好。实际上，在颗粒瘤的厌氧环境下，结核分枝杆菌不复制（NRC）使大多数抗生素作为靶向复制机制（DNA），而不是活性或活性受损。Mefloquine和（+）红氟喹具有活性的发现结核分枝杆菌在厌氧条件下，该化合物的靶标不在细菌复制机械中。我们还评估了结核分枝杆菌在酸性pH和高质量条件下。

甲氟喹以及（+）红细胞素在酸性pH下活跃。该药物的这种特征也很重要，因为在Caseum中遇到的酸性条件下，仅抗结核化合物中的吡嗪酰胺完全活跃[15]。关于空洞颗粒瘤的有趣问题之一是为什么结核分枝杆菌在颗粒瘤中的酸性pH中生存，但花费能量来抑制溶酶体与巨噬细胞中吞噬体的融合。解释可以是多因素的，但一种可能性是结核分枝杆菌在蛋白酶的酸性条件下或吞噬体中，行为可能有所不同。

这些测定还表明，当在高渗条件下获得MIC时，检测到对抗菌剂的不同反应。尽管在高渗透环境中的活性较低，但甲氟喹和（+）红氟喹都可能达到Caseum中的较高的杀菌浓度。研究M. Avium在小鼠中，这些化合物可有效杀死肺，肝脏和脾病变[6，，，，7]。与结核分枝杆菌小鼠的肉芽肿，未发生坏死的小鼠M. Avium肉芽肿液化与蛋白酶形成[16]。

尽管药物的细胞外浓度仅为4 μg/mL，而体外MIC已确定为8 μg/ml。这些发现表明，甲氟喹和（+）红细胞素可以在吞噬细胞内浓缩，这在任何抗结核化合物中都是理想的特征。

研究M. Avium与甲氟喹相比，（+）红细胞素对细胞内细菌的活性增加。也是如此结核分枝杆菌目前尚不清楚。

总而言之，我们的研究表明，甲氟喹AN（+）红氟喹具有抗结核杀菌活性。甲氟喹具有与人类中枢神经系统（CNS）相关的副作用[17];但是，（+）红氟喹似乎与之相关[7]。甲氟喹的靶标的发现可能允许设计具有抗结核活性的化合物，但与CNS副作用相关。

道德认可

本文不需要道德批准。所有报告的研究均在体外进行。

利益冲突

作者宣称，关于本文的发表没有利益冲突。

作者的贡献

路易斯·伯穆德斯（Luiz E. Bermudez）进行了测定，分析了数据并撰写了论文。劳拉·米克（Laura Meek）进行了测定和分析数据。

致谢

作者感谢贝丝·尚布林（Beth Chamblin）准备了这篇论文。他们得到了法案和梅琳达·盖茨基金会的赠款的支持。

参考

1. H. Saito，H。Tomioka，K。Sato和S. Dekio，“新的Quinolone的体外和体内抗菌活性，Du-6859a”，”，”抗菌剂和化学疗法，卷。38，不。12，第2877–2882页，1994年。查看：发布者网站|谷歌学术
2. A. H. Dioncon，A。Pym，M。Grobusch等人，“用于多药耐药性结核病的日二素素氨酸TMC207”，”新英格兰医学杂志，卷。360，不。23，第2397–2405页，2009年。查看：发布者网站|谷歌学术
3. R. Rustomjee，A。H。Dioncon，J。Allen等人，“二二叶氯喹啉TMC207的早期杀菌活性和药代动力学治疗肺结核的治疗”，”抗菌剂和化学疗法，卷。52，不。8，第2831–2835页，2008年。查看：发布者网站|谷歌学术
4. R. E. Lee，J。G。Hurdle，J。Liu等人，“ Spotinamides：一种克服天然药物外排的新的半合成抗结核药”，”自然医学，卷。20，否。2，第152–158页，2014年。查看：发布者网站|谷歌学术
5. K. England，H。I. M. Boshoff，K。Arora等人，“ Meropenem-Clavulanic Acid显示出针对的活性体内结核分枝杆菌，”抗菌剂和化学疗法，卷。56，不。6，第3384–3387页，2012年。查看：发布者网站|谷歌学术
6. L. E. Bermudez，P。Kolonoski，M。Wu，P。A。Aralar，C。B。Inderlied和L. S. Young，“ Mefloquine在体外活跃，体内对抗分枝杆菌复杂的，”抗菌剂和化学疗法，卷。43，不。8，第1870- 1874年，1999年。查看：谷歌学术
7. L. E. Bermudez，C。B。Inderlied，P。Kolonoski等人，“（+） - 红细胞甲基喹作为活性对映异构体的鉴定，其功效比甲状甲虫针对小鼠的藻类感染更大，”，”抗菌剂和化学疗法，卷。56，不。8，第4202–4206页，2012年。查看：发布者网站|谷歌学术
8. J. Ramirez，C。Mason和J. Ali，“在多药中使用甲氟喹分枝杆菌HIV阴性患者的复杂肺部疾病，”当前的治疗研究，临床和实验，卷。68，不。6，第421–429页，2007年。查看：发布者网站|谷歌学术
9. L. E. Bermudez，P。Kolonoski，M。Petrofsky，M。Wu，C。B。Inderlied和L. S. Young，“甲氟喹，Moxifloxacin和Ethambutol是含大脂蛋白方案的三重药物替代品分枝杆菌疾病，”传染病杂志，卷。187，没有。12，第1977–1980页，2003年。查看：发布者网站|谷歌学术
10. M. C. Tsai，S。Chakravarty，G。Zhu等人，“鼠和人肺中结核性肉芽肿的特征：细胞组成和相对组织氧张力，”细胞微生物学，卷。8，不。2，第218–232页，2006年。查看：发布者网站|谷歌学术
11. K. Rohde，R。M。Yates，G。E。Purdy和D. G. Russell，“结核分枝杆菌和吞噬体中的环境”，”免疫学评论，卷。219，没有。1，第37-54页，2007年。查看：发布者网站|谷歌学术
12. J. M. Vinetz，J。Clain，V。Bounkeua，R。T。Eastman和D. Fidock，“疟疾化学疗法”，INGoodman＆Gilman的治疗药物基础，麦格劳 - 希尔公司（McGraw-Hill Companies），编辑，第1383–1418页，麦格劳 - 希尔（McGraw-Hill），纽约，纽约，美国，第12版，2011年。查看：谷歌学术
13. F. I. Carroll和J. T. Blackwell，“ Ary 1-2二甲醇乙醇抗疟药的光学异构体。制备，光学纯度和绝对立体化学，”药化学杂志，卷。17，不。2，第210–219页，1974年。查看：发布者网站|谷歌学术
14. L. G. Wayne和L. G. Hayes，“一种体外模型，用于顺序研究结核分枝杆菌通过非重复持久性的两个阶段的转移，”感染和免疫力，卷。64，不。6，第2062–2069页，1996年。查看：谷歌学术
15. Y. Zhang和D. Mitchison，“吡嗪酰胺的奇怪特征：评论”，国际结核与肺部病杂志，卷。7，不。1，第6–21页，2003年。查看：谷歌学术
16. “大环内酯类和乙酰胺醇，但不是甲氟喹的分枝杆菌，在厌氧条件下”国际抗菌剂与化学疗法会议论文集，L。E. R. S. Bermudez，R。Bildrell，L。Kuzucu和L. S. Young编辑，美国加利福尼亚州旧金山，2009年。查看：谷歌学术
17. W. R. J. Taylor和N. J. White，“抗疟药毒性：综述”，毒品安全，卷。27，否。1，第25–61页，2004年。查看：发布者网站|谷歌学术

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