MGIT 960药敏试验二线系统的评价结核分枝杆菌

摘要

许多实验室通过BACTEC MGIT 960系统验证二线药物的DST。本研究的目的是评估二线药物的临界浓度并进行DST。我们评估了193株临床菌株结核分枝杆菌从韩国患者中分离。使用MGIT 960测试六种二线药物的临界浓度，并与L-J比例法进行比较。确定临界浓度以确定MGIT960系统中产生耐药性和敏感性差异的最大浓度。以下结果符合良好结果发现：0.5的一致性为95% μ莫西沙星的g / mL;93.6%, 1.0μg/mL左氧氟沙星；97.5%，2.5% μ卡那霉素g/mL；90.6%，2.5% μ卷曲霉素g/mL；86.2%，5.0 μg/mL乙酰胺；和90.8%，2.0 μ克/毫升-氨基水杨酸。四种药物（莫西沙星、左氧氟沙星、卡那霉素和卷曲霉素）的临界浓度一致且可靠，可用于检测二线耐药性。进一步研究乙酰胺和ρ-需要氨基水杨酸。

1.导言

结核病是一个重大的公共卫生问题，特别是由于耐多药结核病(MDR TB)的数量不断增加。特别是在发展中国家，广泛耐药结核病(XDR结核病)继续构成严重问题[1- - - - - -5].耐多药/广泛耐药结核病发病率的增加促使采用有效的诊断方法，以便对感染患者进行适当的治疗[6- - - - - -8]。许多研究报告，MGIT 960（Becton Dickinson Diagnostic System，Sparks，MD）在从临床标本中检测和回收分枝杆菌以及药敏试验（DST）方面提供了可靠和快速的结果用于一线药物异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素和吡嗪酰胺的结核分离株[9，10］．最近，实验室在为二线药物提供DST以确保使用MGIT 960系统有效治疗MDR/XDR TB方面面临巨大障碍[11- - - - - -16]然而，在大多数研究中，二线抗结核药物的试验数量有限，二线药物的临界浓度范围也不一致[11- - - - - -13]。尽管世卫组织在2008年建议使用MGIT 960的二线DST使用液体介质，但由于难以确定临界浓度，因此仍然不可靠[16］．使用改变的条件来校准新开发的DST方法并不容易。在体外二线药物的DST结果受药物临界浓度和临界比例等耐药性测量标准的影响。例如,DST L-J固体媒体建立了麦克风,被定义为的药物浓度< 20殖民地被发现,而960年MGIT麦克风被定义为每天的药物浓度变化的增长小于单位1:100控制17］．

韩国结核病研究所(KIT)是成立于1970年的政府运营研究所。KIT一直是开展国家结核病规划的主要机构，包括诊断、基础研究和疫苗生产。根据韩国结核病指南，建立耐多药结核病患者治疗方案的5个实用方法。第一步包括可用的一线药物:吡嗪酰胺和乙胺丁醇。第二步:选择一种注射药物:卡那霉素、阿米卡星、链霉素、卷曲霉素。第三步:选择一种喹诺酮类药物:左氧氟沙星、莫西沙星、氧氟沙星。第四步:在IV组中选择可用药物:ρ-氨基水杨酸、环丝氨酸、丙硫酰胺。第5步：如果在第4步之前未合成4种药物，则可考虑第V组药物：阿莫西林/克拉维酸盐、克拉霉素、大剂量异烟肼、氯法齐明、利奈唑胺、硫代乙酮（不适用于HIV患者）。

长期以来，韩国一直在一线和二线夏时制中使用L-J比例法，但最近一线夏时制开始改用MGIT 960比例法。在这项研究中，我们测试了各种临界浓度的二线结核病药物，莫西沙星，左氧氟沙星，卡那霉素，卷霉素，乙硫酰胺，和ρ-氨基水杨酸，并以L-J比例法与MGIT 960体系进行比较。

2.材料和方法

2.1.菌株

对从韩国公共卫生中心提交给韩国结核病研究所的培养物进行了评估结核分枝杆菌共检测134株全敏感株和59株耐药株，其药敏结果均由L-J测定。所有分离株均按治疗史的患者分类进行分析1）.所有分离株均在L-J培养基上新鲜传代后使用MGIT 960进行检测。

2.2.化学品

所有药物均为化学纯粉末状。左氧氟沙星（LEV）、卷曲霉素（CPM）、卡那霉素（KM）、乙酰胺（ETH）和ρ-氨基水杨酸(PAS)从Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)获得，莫西沙星(MXF)从拜耳(Bayer Health Care AG, Germany)获得。按照制造商的建议，将粉末储存在−20°C的干燥器中。LEV、CPM、KM和PAS在去离子水(DW)中溶解，MXF在0.1 N NaOH中溶解，随后在DW中稀释，ETH在DMSO中溶解，随后在DW中稀释。所有原液经0.22膜过滤灭菌μm-孔径Millex GS过滤装置（马萨诸塞州贝德福德市Millipore）。所有储备溶液储存在−80°C小份。解冻后立即使用冷冻药物溶液，剩余的药物溶液丢弃，不再储存在冰箱中。从储备溶液中新鲜制备工作溶液，并进行系列稀释以达到所需浓度。

2.3.采用MGIT960方法进行药物敏感性试验

对生长于L-J斜坡的菌株进行MGIT DST测定，鉴定为结核分枝杆菌锌染色。从L-J培养物中制备接种菌，将4 mL Middlebrook 7H9肉汤加入到无菌管中，无菌管帽中含有6 ~ 10个2mm玻璃微珠。用无菌环从不超过14天的生长培养物中提取1~2个菌落。菌落悬浮在Middlebrook 7H9肉汤中，漩涡2-3分钟，以打破较大的块。悬浮液放置30分钟，使沉淀物沉淀到管的底部。然后将上清液转移到另一无菌管中，再静置15分钟。使用7H9肉汤，将悬浮液调整到0.5麦克法兰标准。将1 mL调整后的悬液用4 mL无菌生理盐水(1:5稀释)稀释。将0.5 mL 1:5稀释剂接种到含试验药物的试管中。在制备二线药物生长控制管时，将0.1 mL上述悬浮液移入共10 mL无菌生理盐水中，制备1:100 GC悬浮液(1%生长控制)。 The GC suspension was mixed thoroughly by gently inverting 3 to 4 times and then inoculated with 0.5 mL of the 1 : 100 GC suspensions into MGIT tubes. To interpret the results for 2nd drugs, the standard protocol recommended by the first-line drug manufacturers was followed for DST by the MGIT 960 method. When the growth unit (GU) of the growth control reaches 400 within 4–13 days, the GUs values of the drug-containing vials were evaluated. The GU of the drug-containing tubes were found 100 and >100; the result reported susceptible and resistant strains, respectively. Evaluated concentrations of each drug are listed in Table2．

2.4。L-J比例法药敏试验

L-J比例法为本研究的参考方法。所有菌株以前都在L-J培养基上用标准程序检测MXF 2.0浓度μg/mL，2.0级 μg / mL, 40公里μg/mL，每分钟40次 μ40 g / mL,乙μg/mL, PAS 1.0μ克/毫升(18］．

2.5.基因型特征

在MGIT960和L-J DST之间显示出差异的菌株用两种方法重新测试。此外，我们还对以下基因的关键区域进行了DNA测序分析;喹诺酮和gyrB对于MXF和LEV，rrs对于KM和CPM，特利亚CPM,韩国仁荷发起人，韩国仁荷，埃塔和乙酰胆碱乙。

3.结果和讨论

共193株菌株，包括134株泛敏感菌株和59株具有不同药物敏感性的耐药菌株（19株菌株对MXF和LEV耐药，16株菌株对KM耐药，11株菌株对CPM耐药，8株菌株对ETH耐药，17株菌株根据L-J法对PAS耐药）进行二线药物敏感性试验。确定最小抑菌试验浓度（MIC）对于6种药物，我们使用MGIT 960分析了12份具有二线药物DST数据的参考文献。为了确定临界浓度，它基于可区分的易感和耐药菌株。表中给出了每6种药物的DST结果3.．对敏感菌株和耐药菌株进行检测，得到临界浓度为0.5μ对于MXF，g/mL，1.0 μg/mL用于LEV, 2.5μg/mL for KM, 2.5μ克/毫升，用于CPM，5.0 μg/mL, ETH为2.0μ在MGIT 960和L-J比例法之间，观察到MXF、LEV、KM和CPM的临界浓度结果具有良好的一致性。

MXF的mic据报道在0.125到2.0之间μg/mL和该药物的耐药菌株具有较高的MIC[12，13，19，20］．例如，根据MGIT960方法报道了临床分离株和泛敏感株的MIC [12]。此外，据报喹诺酮突变株高于泛敏感株和耐药株[21］．我们评估了在0.25~4.0之间的扩展浓度μg/mL，以确定本研究中MXF抗性菌株的MIC（表2）.

对于莫西沙星，0.5时的一致性为95% μg/mL。我们发现四株结果不一致的菌株。其中一株菌株在1.0 μ当使用MGIT960方法重复时，g/mL为假抗性。当使用L-J方法测试时，三个菌株敏感，但耐药（在<0.5 μg/mL）和敏感（在≥1 μg/mL)4).历史上，这些分离株来自随访中的每位患者。为了阐明对MXF易感性降低的分离株，我们分析了与MXF耐药性相关的突变。尽管喹诺酮或gyrB未检测到突变，这些菌株可能携带位于QRDRs之外的突变，或者耐药性可能由其他机制引起。

LEV的mic推荐在0.5到2.0之间μ前几篇论文中的g/mL[22，23]根据Sanders的论文，他们测试了泛敏感菌株和抗性菌株的MIC。抗性菌株的MIC（2.0 μg/mL)高于泛敏感株(1.0 .μg/mL），显示出类似MXF的双峰模式[24］．我们评估浓度在0.25~8.0之间μg/mL LEV测定耐药菌株的MIC(表12)对于左氧氟沙星，1.0时的一致性为94% μg/mL。应用1.0 μg/mL时，19株耐药菌株中有18株产生耐药，40株敏感菌株中有37株产生敏感，敏感性为94.7%，特异性为92.5%。3个敏感品系在>1.0时均感病μ使用MGIT960方法测试时，g/mL。对于三种易感菌株，我们分析了这些不一致菌株的基因序列，并且没有发现喹诺酮和gyrB突变（表1）4）.

KM的mic建议为1.25～4.0 μg/mL [19，20］．该药的临界浓度通常建议在2.5 - 5.0之间μg/mL，但大于20 μg/mL，如使用km耐药菌株[6，11，19］．MIC范围为0.625~10μg/mL评估我们研究中KM的MIC（表2）.

对于卡那霉素，使用2.5 μg/mL的MGIT960方法的一致性为97.5%。16个耐药菌株中有16个产生耐药，40个感药菌株中有38个产生感药。这两种不同的菌株并没有藏匿病毒rrs突变（表1）4）.我们建议KM的临界浓度为2.5μg/mL，以产生敏感菌株和抗性菌株之间的最佳区分。

CPM的mic为1.0~5.0μ克/毫升(19，23，25]我们在0.625~5.0之间评估了CPM的MIC μg/mL（表1）2)在卷曲霉素试验中，两种DST方法之间的一致性为91%。应用2.5 μg/mL对于MGIT法，11个耐药菌株中的10个产生耐药结果，40个敏感菌株中的37个产生敏感结果（敏感性90.9%，特异性90.3%）。3个不一致的敏感菌株在>2.5%时敏感 μ使用MGIT960方法测试时，g/mL。对这些菌株进行了测序rrs和特利亚用于基因分析的基因，但在这两个基因中未检测到突变（表1）4).发现抗性菌株在>0.625时敏感 μ该分离物来自第4次随访样本中的XDR-TB患者。该菌株也证明在>0.625时易感 μg/mL, L-J法抗。报道了对氟喹诺酮类药物的耐药性;在治疗期间开发了氨基糖苷[26].虽然在治疗过程中从患者身上分离出，但使用MGIT 960仪器比使用比较L-J方法获得更敏感的结果。

ETH推荐值在0.5～2.5之间 μ克/毫升(19，23，25，27].我们在0.625~5.0之间进行评估 μ乙二醇的g/mL（表1）2）.

对于乙酰胺，我们建议使用5.0 μg/mL MGIT960的临界浓度。使用浓度为5.0μg/mL, 1株结果不一致的菌株为假耐药，敏感性为75%。该菌株含有S266R埃塔与ETH抗性相关的突变（表4)。根据ETH的建议浓度，MGIT960试验结果与L-J方法的结果相比较差，一致性为86.2%。虽然发现了86.2%的一致性，但该群体具有抗性。这种不一致性不是一个新的观察结果，尽管其程度比先前研究中观察到的更大[12，28］．急性ETH DST一直难以获得，因为该药物是耐热的[29]ETH是治疗耐多药结核病的重要药物，需要进一步的DST测试和研究。

对于PAS，麦克风为4.0 μg/mL [19]PAS在0.5～16.0之间进行检测 μ本研究中的g/mL（表2）.

PAS，当应用2.0时μg/mL，一致性为91%(灵敏度为94.1%，特异度为87.5%)。来自新病例患者的一种差异菌株具有低水平耐药性(0.5μg/mL），但在>1.0时易受影响 μ克/毫升。

ETH和PAS的一致性很低，因为我们无法确定100%的耐药菌株在药物存在下生长的浓度以及100%的敏感菌株受到抑制的浓度。需要更大规模的研究来确定进一步的敏感性试验。

综上所述，MGIT960和L-J比例法用于二线DST结核分枝杆菌建立了六种药物。莫西沙星的临界浓度为0.5μg/mL，左氧氟沙星1.0 μ克/毫升，卡那霉素2.5 μg/mL，为卷曲霉素2.5μ乙酰胺5.0克/毫升 μg / mLρ-氨基水杨酸2.0 μg/mL使用MGIT 960。这些临界浓度对检测二线耐药是可靠的。ETH和PAS均较低的两种药物需要进一步DST测试和研究。

致谢

本研究得到了大韩民国疾病控制和预防中心（CDC）的研究资助（资助号：2009-E00479-00）。特别感谢Byungchul Ahn先生、Jangho Park和Heekyung Yu女士准备材料。

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