的多样性结核分枝杆菌从新的肺结核病例在亚的斯亚贝巴隔离,埃塞俄比亚

文摘

理解的遗传多样性结核分枝杆菌需要更好地了解结核病的流行病学和可能影响发展的新的诊断,药物和疫苗。结核分枝杆菌隔离是使用spoligotyping和特征与SpoIDB4瓜德罗普岛的巴斯德研究所的数据库。共有53个不同模式被确定在192隔离检查。169的隔离被分为一个33共享坐,而剩下的23与20个孤儿模式。54%的隔离是归因于T的家庭,一个家庭没有被良好定义的日期。其他著名的家庭是中科院,哈勒姆,LAM北京,和未知的占26%,13%,2.6%,0.5%,和2.1%,分别。艾滋病毒阳性患者,10模式中观察25隔离。T (38.5%)、H(26.9%),和CAS(23.1%)的家庭是最常见的艾滋病毒阳性的个体。的多样性结核分枝杆菌菌株在本研究发现非常高,没有家庭的分布差异在艾滋病毒阳性或阴性结核病患者除了H的家庭。在亚的斯亚贝巴结核病传播是由于只有现代结核分枝杆菌家庭(CAS, LAM T,北京,哈勒姆,和U)。

1。介绍

结核病仍然是一个主要公共卫生问题在埃塞俄比亚。目前埃塞俄比亚额定第七22 high-TB-burdened各国中,患病率为394每100000人口在2010年(1]。这种情况一直在恶化的艾滋病毒/艾滋病流行和新兴耐多药结核病(MDR)。结核病患者中艾滋病毒流行率为3.5%,2009年15%的人合并感染艾滋病毒和耐多药率是1.6新病例和12%再处理情况下2]。尽管高结核负担,非常有限的信息是可用的遗传多样性结核分枝杆菌菌株和艾滋病在这个多样性的影响。

分子打字技术被广泛用于形成物种株结核分枝杆菌参与结核病感染的分子流行病学研究结核分枝杆菌,提供洞察传播动力学,进化遗传学,和检测疑似暴发和人际传播的3]。尽管最近的研究建议使用健壮的标记,如单核苷酸多态性(SNP)或大型序列多态性(LSP)更好地理解应变血统(4),插入序列(6110)限制片段长度多态性(IS6110 RFLP)过去作为黄金标准输入方法(5,6]。然而,很昂贵,耗时和不容易标准化的实验室。

另一种技术是一种PCR-amplification-based技术,间隔寡核苷酸打字(spoligotyping),分析直接重复多态性(DR)地区。技术相对简单、快速和可靠的。该方法被广泛用于同时检测和打字结核分枝杆菌(7]。目前spoligotyping已成功应用于理解新兴的多重耐药性问题(MDR)和广泛耐药结核病(XDR)和调查的某些流行毒株的毒力结核分枝杆菌(如北京的压力),以及更好地理解结核和结核—艾滋病毒合并感染的流行病学8- - - - - -14]。最近的一项研究的分子分析结核分枝杆菌在埃塞俄比亚描述菌株的多样性虽然未能解决结核—艾滋病毒合并感染中的模式(15]。本研究旨在提供额外的洞察艾滋病毒阳性或阴性患者的临床分离株的生物多样性在亚的斯亚贝巴,埃塞俄比亚使用spoligotyping和比较模式获得与国际spoligotyping数据库,可用SpolDB4.0瓜德罗普岛的巴斯德研究所。

2。材料和方法

2.1。结核分枝杆菌菌株和DNA隔离

总共有192结核分枝杆菌分离收集2009年7月至2010年6月从涂阳新结核病例在亚的斯亚贝巴的4种不同的医疗中心。所有患者的人口统计学、流行病学和临床信息收集使用prestructured问卷,包括性别,年龄,和联系(家庭/亲密接触)数据。我们获得了机构和国家伦理间隙。参与者同意参与研究和签署了一份免费的知情同意的形式。的方法的修改后的彼托夫是用来消化和清除痰标本。100年一个整除μL样本然后接种到两个Lowenstein-Jensen (LJ)偏。细菌生长是每周读8周。文化没有增长八星期后被认为是负面的。结核分枝杆菌隔离被确定使用pcr基因分型结果与之前描述的方法RD9删除(16]。加热分离株分枝杆菌基因组DNA提取的80°C 60分钟,并储存在−20°C到spoligotyping所需。

2.2。Spoligotyping

Spoligotyping进行使用的商用工具罗勒属Biosolutions,印度,根据制造商的指示。简单地说,正向重复(博士)地区与引物放大半径标注(生物素化的5′末端)、DRb和放大DNA杂交inter-DR间隔寡核苷酸共价绑定到一个膜。DNA牛结核分枝杆菌波士顿咨询公司和结核分枝杆菌H37Rv被用作积极控制,而高压蒸气养护的超纯水作为消极的控制。放大DNA随后杂化一组43个寡核苷酸探针反向线印迹。逆电流器的存在是可视化在电影黑色方块与streptavidin-peroxidase孵化后与增强化学发光检测系统检测液体(Amersham,小都,联合王国)。

2.3。艾滋病毒检测

所有参与者进行抗体检测hiv - 1和2在预处理和后续测试咨询使用快速测试(统计包,KHP和Unigold领带制动器)按照埃塞俄比亚国家引导线。

2.4。数据库比较

spoligotyping结果准备八进制和二进制格式的Microsoft Excel电子表格;spoligotype模式被指定为43-character-long字符串组成的黑白方块代表个体的存在或缺少垫片,分别。spoligo模式在二进制,八进制进入,由比较spoligotyping结果与国际spoligotyping数据库中已经存在的名称,SpolDB4.0 [17)(http://www.pasteur-guadeloupe.fr: 8081 / SITVITDemo /)。在这个数据库中,两个或两个以上的病人隔离共享相同的spoligotype模式被定义为坐(spoligotype国际类型)在单一spoligo模式被定义为“孤儿”隔离。SpolDB4定义了62个基因家庭/亚科,包括各种特定的签名结核分枝杆菌复杂的成员如牛分枝杆菌,m . caprae m . microti m . canettii m . pinipedii和m . africanum,以及包括规则定义的主要科、亚科米。肺结核。的匹配分析,更新SpolDB4.0含有39609分布在121个国家的2881种共享模式。模式没有发现在使用SpotClust SpolDB4.0被分配到科和亚科项目,这是建立在SpolDB3数据库(http://cgi2.cs.rpi.edu/_bennek/SPOTCLUST.html)。

3所示。结果

3.1。人口统计信息

抽样的192名患者,26(13.5%)是HIV阳性,136 (70.8%)HIV阴性,剩下30(15.6%)没有了艾滋病毒检测。的平均年龄为28.7岁(范围18 - 72)。有男性参与者略高于女性(56.9%)。艾滋病毒阳性患者,意味着当时的cd4细胞计数细胞/μl

3.2。遗传多样性和家庭作业

192类型的隔离中,169(88%)被分为一个33共享国际类型根据SpolDB4.0(坐)。剩下的23隔离生成20个不同spoligotypes新共享spoligotypes (3在每个集群),并没有先前所描述的数据库。在总53 spoligotype模式在目前的研究中,特征20模式(包括3个新的集群模式)对应于集群2-41隔离每个集群,占非常高集群率为88% (169/192)。33的模式,没有形成集群,17代表真正的孤儿SpolDB4.0以前不存在的模式和16个代表pseudoorphans在场为单身人士在研究中却发现SpolDB4.0 (ST和家庭聚集菌株总结在图的分布1)。

家庭作业显示T家庭构成最主要的家庭在我们的研究中,构成104年(54.2%)隔离以下分配:T3_ETH(44岁的22.9%);T1(34岁的17.7%),T2 (8 4.2%);T2-T3 (0.5%)、T3 (16 8.3%), T5 (1 0.5%)。CAS家庭(48岁,26%)是第二个主要家庭CAS1_DELHI (25, 13%);CAS_KILLI(14 7.3%)和中科院(9 4.7%)。其他家庭发现哈勒姆(H)(24日13.2%)以下分配:H1 (1 0.5%), H3 (15 7.8%), H4(最近的结果表明,H4 sublineage属于不同于一个新的“乌拉尔”血统,哈勒姆)(8 4.2%);林家族(5 2.6%):LAM9 (4 2.1%), LAM7_TUR (0.5%);北京家庭(0.5%);家庭34 (0.5%);家庭36(0.5%)和4(2.1%)菌株的主要结果是待定(spoligotyping分析总结在表1)。

总32集群之间的隔离,总共126隔离(65.6%)从8种不同的系统集群形成主要隔离和43隔离(22.4%)从25集群(包含16个共享类型包含只有一个病人,三种共享只包含两个病人,三种共享只包含三个病人,和两个共享类型包含四个病人)形成了小隔离。16个隔离pseudoorphans而生成23隔离20独特spoligotypes没有先前所描述的数据库。spoligotype模式的孤儿隔离总结在图2。

艾滋病毒阳性患者,spoligotyping一共11个不同的模式。26名患者中,25例(92.3%)被分为10共享国际类型之一根据SpolDB4.0(坐)。剩下的1隔离产生了独特的spoligotype模式并没有先前所描述的数据库。在总11 spoligotype模式特征在目前的研究中,5个模式对应于集群2 - 5隔离每个集群被确定,剩下的5 pseudoorphans模式。一个spoligo模式代表真正的孤儿模式在SpolDB4.0之前不存在。hiv阳性个体家庭作业还透露,模糊T家庭构成最主要的家庭(38.5%),其次是h .家庭构成26.9%和CAS_DELHI (23.1%)。尽管艾滋病毒阳性受试者的小样本大小不允许我们做出强烈的对比与艾滋病毒阴性,我们并没有发现显著差异的分布在两组不同的家庭。hiv阳性个体的孤立的spoligo模式总结在图3。

4所示。讨论

分析和及时更新的结核分枝杆菌应变分布在一个特定国家和比较全球模式提供了洞察传导机制,尤其是毒性菌株耐药性的出现,与信息相关的新的诊断方法的发展,药物和疫苗。

这项研究已经在艾滋病毒阳性或阴性患者为了更好地理解到的人口结构结核分枝杆菌在亚的斯亚贝巴。Spoligotyping作为主要输入工具,因为它易于使用,简单的编码和全球的国际数据库隔离进行比较分析。

的主要演化支的分布结核分枝杆菌菌株显示不同人群之间的差异(17]。在我们的研究中,大多数的隔离(83.2%)属于三个主要的家庭:T家庭(54.2%)、中科院(26%)和H(13.2%)和没有区别在家庭的分布在病毒呈阳性或阴性的受试者(图4)。

尽管T在这项研究中,家庭是最普遍相信这个家庭并不代表一个进化枝严格的进化意义,因为它包含默认菌株不能分类的一个建立家庭的phylogeographical特异性(17]。因此它常常被称为“模糊”的家庭结核分枝杆菌这是发现世界。

T3_ETH是占主导地位的家庭,和先前的报道也显示这个spoligotype出现在高比例在埃塞俄比亚(15),它被认为是特定的埃塞俄比亚和这圣很少被报道在其他国家(17]。CAS的家庭,这是第二个最频繁spoligotype在这项研究中,在以前的研究报道在埃塞俄比亚(15在坦桑尼亚[],也普遍18)在肯尼亚CAS1_KILI主要和35.6%的73例孤立CAS的家庭(19]。H家庭构成总数的13.2%家庭在我们的研究和它的广泛传播等世界不同地理区域的亚洲,欧洲,中东,和非洲被记录在阿根廷与暴发相关的一些报道(20.和在捷克共和国21]。

其他家庭LAM和北京由5和1分离,分别。林家族中我们有两个菌株,LAM7_TUR LAM9。的LAM7_TUR被认为是限制应变在土耳其(22]而LAM9报道来自世界不同地区包括非洲。SIT1对应于北京基因型是第一个报告从埃塞俄比亚但需要确认与其他分子方法spoligotyping限制了基因型分类。北京家庭近年来在全球范围内传播,并被视为一个指标为最近的进口压力结核分枝杆菌进入设置。近年来一些国家报道的随着时间增加结核病的比例由于北京基因型菌株包括在该地区的国家(18,19]。

5。结论

尽管存在的主要类型、共享的多样性结核分枝杆菌本研究中发现的非常高;192隔离spoligotypes 53个不同。本研究中观察到的家庭超过62个家庭总数的85.5%目前在第四国际注册spoligotyping数据库,SpoIDB4。Spoligotyping少歧视性的权力;因此,对于更好地理解和确认的多样性,更有识别力的技术需要。此外,这种多样性的影响结核分枝杆菌传输和应变的差异,是否会引起不同的免疫反应还不清楚,需要进一步研究。不同的研究指出结核分枝杆菌菌株有不同的免疫原性和毒性23- - - - - -25]。也建议做后续研究结合接触者追踪和流行病学联系为了获得一个清晰的molecular-epidemiological北京和其它菌株的概述。本研究做了几个健康中心在首都亚的斯亚贝巴,这里我们的发现可能并不代表整个国家;因此,我们建议未来更广泛的研究更好的分子方法更好的歧视权力像单核苷酸多态性(SNP)打字和分枝杆菌点缀重复units-variable串联重复序列的数量(MIRU-VNTR)在埃塞俄比亚详细阐明菌株的多样性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者承认这个研究的宝贵的贡献由Bamlak Tessema,老Semegne Tesfaye和老Etsegenet Aseffa在招聘和研究参与者。这项研究是非洲的一部分欧洲肺结核财团(AETBC)项目支持的欧洲和发展中国家临床试验伙伴关系批准号IP_2009_32040。

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