恶二唑啉和木脂素对菌结肠酸生物合成及超微结构变化的影响结核分枝杆菌

抽象的

结核病是一种重要疾病，在世界各地造成数千人死亡。已有对现有抗结核药物产生耐药性的报道;因此，需要研究新的有效的抗细菌分子。对三种木脂素和两种合成腙的抗真菌活性进行了评估结核分枝杆菌H37Rv抗细菌微量稀释试验(TEMA)。其中，恶二唑啉(AC451)和木脂素(乙氧基立方体素)活性最高(MIC 6.09和62.4)μ.m，resp。）。用质谱分析用两种化合物检测治疗细菌的近几种变化。另外，乙氧基脲素治疗中氰酸的还原水平与细菌形态的破坏相关。

1.介绍

大约33％的人口被感染了结核分枝杆菌,全世界每天有4200人死于肺结核。有几个事实被认为是大流行进展的主要因素[1］．40多年前发现的抗亚尿嘧啶药物，[2，3.由于长时间的治疗，出现了耐药菌株，随着人口迁移的增加，潜伏和持续感染在世界各地蔓延。此外，正如最近所述，"艾滋病毒/艾滋病继续加剧结核病流行，特别是在非洲" [4］．在这种情况下，迫切需要寻找新的抗真菌物质作为药物开发的模板，以解决目前的疾病状况。此外，研究新分子的作用机制有助于设计更有效的抗细菌化合物。

种分枝杆菌相关属合成氰酸（MAS），这是细胞壁（CW）的重要脂质组分，与保护有关玉米菌菌抗脱水，化学损伤，宿主免疫系统，进入亲水性抗生素[5］．因此，MAS新陈代谢是一个重要的目标分枝杆菌例如，异烟肼是抑制MAs生物合成的一线抗结核药物[6］．

在本文中，我们报告了三种木质素和两种氧氮杂胺衍生物的抗致细菌活性玉米菌菌H37RV通过质谱分析和透射电子显微镜分析，评估最活跃分子对MAS生物合成的影响及该病原体的超微结构变化。

2.材料和方法

2.1。植物材料和化合物

的叶子Virola flexuosa2007年2月在波多贝里奥(安蒂奥基亚-哥伦比亚)采集;收据存放在安蒂奥基亚大学植物标本室(HUA 8967)。

2.2。提取制备和分馏

通过使用己烷和乙醇（EtOH）渗透干燥和地植物材料（1.0kg）。在真空下浓缩萃取物，产生粗提取物（Ce），使用己烷-CH在Sephadex LH-20（Sigma）柱上分离。₂Cl₂-MeOH（2：1：1，v / v）获得几个级分。随后，分析级分¹手^13.碳核磁共振谱检测木脂素，最后检测木脂素1-3（70,40和20mg）分别通过使用硅胶60h（Merck）和己烷-EtOAc梯度的柱色谱方法获得。

合成的化合物
将1.2ml乙酸酐加入吡哆醛Isonicotinoyl腙（35mg，0.122mmol）中。将溶液在105℃下搅拌2小时，然后工作（用CH提取₂Cl₂）.溶剂去除溶液，硅胶柱色谱法（己烷-EtOAc，3：2）提供了化合物4色谱分离后(12.14 mg, 0.037 mmol, 30.3%)。

合成的化合物
hydroxycinnamaldehíde苯腙(50 mg, 0.198 mmol)中加入乙酸酐1.5 mL;在151°C下搅拌3 h，然后搅拌(CH萃取)₂Cl₂）.溶剂去除得到固体物质，硅胶柱层析分离得到化合物5 (14.08 mg (0.048 mmol, 24%)。
¹手^13.在CdCl 3中的Bruker AMX 300光谱仪上记录C NMR光谱（化合物1，2,3.)或DMSO d6(化合物4和5）.

化合物：¹H-NMR：
H-5，δ.7.22（S，1小时);H-10,δ.8.29，（年代、1 h);H-13,δ.7.59, (d, 5.4 Hz，2h）;H-14，δ.8.58, (d，5.4 Hz，2h）;H-16，δ.2.07（S，3 h);H-17,δ.5.13, (d,12.9赫兹,1小时);H-17,5.31，（d,12.9赫兹,1小时);19-CH3,δ.1.85, (S，3h）。^13.C-NMR：c - 5,δ.89.16;c - 2,δ.168.94;其他,δ.130.79;即δ.155.57;8,δ.145.94;C-10,δ.149.21;C-11，δ.135.87;技术,δ.132.97;C-13，δ.121.46;碳14,δ.152.12;C-16，δ.19.27;18-c = o，δ.171.21;19-CH3,δ.19.99。

化合物：¹H-NMR：
H-6A，δ.2.20 (米，1h），17-ch3，δ.2.22 (年代、3 h);H6b,δ.2.35（米、1 h);H-7，δ.2.72（米，2h）;H-5，δ.6.25（d，2.7和5.9 Hz，1h）;H-9和H-10，δ.7.15 (米，4h）;H- 13和H-14，δ.7.40（米，4h）;H-11和H-15，δ.7.75（米2 h)。^13.C-NMR：17-CH3,δ.20.10;C-6,29,59;即δ.35,11，C-5，δ.92.74;技术,δ.125年,08年;C-11 C-15,δ.126年,53个;c13和碳14,δ.127,33;C-9和C-10，δ.128.84和δ.128.88;8,δ.140,85;c - 2,δ.156,51;18-c = o，δ.171.21。

2.3。生物和生长条件

结核分枝杆菌H37RV（ATCC 27294）首次在Lowestein Jensen（LJ）培养基上生长在37℃下15天。来自LJ培养物的细菌悬浮液在补充0.2％（通过Vol.）甘油（Sigma），10％（通过Vol。）OADC（油酸，白蛋白，葡萄糖，过氧化氢酶; Difco）的甘油（Sigma）的嗜汤（Becton Dickinson）中生长。和0.05％（由Vol。）吐温80（西格玛）。在100rpm和37℃下在旋转振荡器上在200ml瓶中在200ml瓶中温育培养12d。

２.４.抗细菌的活动

对抗细菌性易感性进行玉米菌菌采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)微量稀释法(TEMA测定)，如Porras等[7］．最小抑菌浓度(MIC_90.）被定义为抑制细菌生长90％的最低浓度。在不同的日期进行了三种不同的实验，并一式三份评估了每种化合物。

化合物的原液溶解在DMSO中，4℃保存使用，实验中DMSO的最终浓度小于等于1%。

2．5．霉菌酸的分析

玉米菌菌H37RV培养物（50ml，1：20稀释的细菌悬浮液调节1mcFarland），或没有化合物生长3.和4在MIC下，持续24、48和72 h。细菌培养物在4℃、1048 g条件下离心5 min，用卡可迪酸缓冲液(CB, 0.1 mol l-1;pH值7.2)。真菌酸的提取和重氮甲烷衍生物的操作如下所述[8］．通过质谱（MS）分析甲酯霉菌提取物（MEMEN）。MEMES在CHCL中重新悬浮_3.：ACN（1：1，通过Vol。）并通过质谱仪APCI-IT中的气动辅助泵注射（Agilent系列6300）。在负模式中获得质谱并从200至2000m / z扫描。进行三种不同的每种提取物，并将其归一化数据标准化并与先前在文献中报告的数据进行比较。

2.6。透射电子显微镜

如上所述在MS分析中，将细菌培养物处理，离心并洗涤并洗涤。用2.5％戊二醛，1％钌红色和100mM赖氨酸在4℃下用2.5％戊二醛，1％钌红色和100mM赖氨酸固定。用相同的缓冲液洗涤后，将它们在4℃下用1％锇四氧化锇和0.05％Ruthenium Reving 2 H后固定。将细胞在一系列乙醇中脱水，以不同比例（2：1和1：1，Vol）和肌肉树脂在旋转树脂和环氧丙烷中嵌入混合物中。最后，将它们在68℃下聚合2d。用甲苯胺蓝染色薄切片并在光学显微镜下观察。用乙酸铀酰染色超薄部分（60-90nm）并氟酸盐铅。最后，在Zeiss EM 109电子显微镜中分析并拍摄它们。

2.7。细胞毒性测定

根据MTT方法测定细胞毒性[9］．使用的细胞系为VERO和MDBK。50%抑制浓度(IC_50.)，用对数回归分析计算。化合物在3个重复中进行了评价。

3.结果与讨论

木酚素dihydrocubebin (1），hinokinin（2)和乙氧基立方体素(3.)(图1)Virola flexuosa(肉豆蔻科)和已报道的其他植物，并通过核磁共振波谱和物理性质的比较确定了它们的结构[8，10.］．

表中报道了木脂素和恶二唑啉的抗真菌和柠檬酸毒性活性1．化合物3.和4表现出最有效的抑制作用玉米菌菌H37RV（MIC，24和2 μ.克毫升⁻¹、职责)。然而,模拟化合物2和5不太活跃。参考药物的麦克风均按照所用细菌菌株的抗生素敏感性。与其抗致细菌活性相比，所有化合物都表现出低细胞毒性作用，除了化合物5，他的麦克风_90.与IC相似_50.．

由于抗细微细菌活性和化合物的低才能毒性3.和4分析了它们对霉菌酸生物合成和超微结构的影响。MEMES的质谱与先前报告的模型数据相似玉米菌菌H37Rv。然而，我们采用的MS方法与其他作者报道的方法存在差异[11.，12.］．该分析允许在分析的样品中鉴定α，酮和甲氧基霉菌酸(表2）.另外，存在[m⁺+Na]加合菌酸的确定是通过饱和的MEMEs与钾盐的报道[13.］．

化合物处理过的细菌的模因谱4对于24小时表示α和氧化菌丝酸的增加，M /Z≥1225（MA链等于或大于82个碳），氧化氰酸的增加增加，并且在αmycolates中也表现出接近50％的减少m /z≤1189（图2）.同时，化合物3.导致所有霉菌酸的显著减少。然而，48和72 h处理的菌结肠酸谱与对照相似(数据未显示)。

用化合物处理的细菌的超微结构分析3.表现出异常形态，不规则边缘，不破坏膜和细胞壁的24小时至72小时（图3.，治疗72小时的图像未显示)。然而，复合处理的细菌的形态4没有受到影响。一些控制细菌可能由于离心过程而表现出轻微的形态改变。

但化合物引起的形态变化明显不同。在正常和异常细胞中，细胞壁(cw)是一个中等致密层。质膜(pm)似乎是由一个低密度空间分隔的双层膜组成。内层似乎与细菌细胞质紧密相连，而质膜外层则与细胞壁紧密相连。此外，TEM分析mberculosis.细菌显示出与中间体组（M）的相似的层状结构。在图3(一个)，质膜用黑色箭头表示。此外，在细胞质中还观察到一些大小不一的小球，可能含有培养的残余物质。在图3 (b)，在小箭头所示区域内，细胞质几乎没有变化，形状非常不规则、杂乱。

在本研究中，我们评估了3种木质素和2种合成氧基唑的抗细管活性玉米菌菌H37RV为了在氰酸生物合成上找到活性的新物质。如表所示1， 化合物3.是最活跃的木田测试。在这种类型的化合物中，乙氧基取代基的存在对于活性至关重要，进一步通过化合物之间的活性差异来证明2和3.．尽管化合物中没有呋喃环1，两种化合物之间没有显着差异1和2，这表明二苄基 - 亚甲基 - 二恶烷部分对这些类型化合物的活性的重要性。由于观察到患有低含量的胞虫毒性，这些木质人具有很有希望。另外，先前报道了Hinokinin的抗原毒性作用[14.］．

Oxadiazoline4是最活跃的复合玉米菌菌由于MIC，细胞毒性最低_90.是IC的60倍_50.．其他研究报告与吡啶系统相似的氧基亚唑啉4具有前景抗致细菌活动在体外［15.，16.］．治疗玉米菌菌H37RV与4处理24 h, MAs谱线发生改变，尤其是酮和甲氧基MAs水平增强。然而，TEM分析处理过的细菌4显示正常的形态。一些MAs的过量产生可能是克服该化合物对MAs代谢影响的一种机制，可能与化合物处理后细菌正常形态的维持有关4.有证据表明一些突变体和重组菌株玉米菌菌产生更高比例的氧化MAs并不呈现异常形态，正如它发生在细菌处理4［17.］．

另一方面，在玉米菌菌用木兰治疗3.对于24小时，可以与细胞壁的异常组成有关，因此，引起的异常细菌形态与24小时相同的治疗中证明的异常细菌形态。报道了对霉菌酸生物合成和超微结构改变的类似效果玉米菌菌和米府用异烟肼治疗的培养物，一种抑制霉菌酸生物合成的抗胆管前药[18.］．到目前为止，还没有关于单呋喃木脂素对真菌酸生物合成有作用的报道。

如上所述，用化合物治疗24小时，在MAS型材的改变中证明了MAS型材的变化3.和4．然而，两种处理48和72 h的MEMEs质谱显示出与对照相似的MAs谱。这可能意味着细菌正在恢复MAs的正常水平。然而，在治疗的情况下3.尽管尽管恢复型材，但仍有72小时的待遇也可以证明异常形态。这是由于细胞壁缺乏形式的逆转，这是一种复杂的过程，即使在理想条件下也不能完成大多数情况19.］．

总结，我们发现木烷乙氧基脲素和氧基唑啉AC451有前途的抗细细菌化合物都对氰酸代谢产生影响玉米菌菌H37Rv。这些化合物可以是有用的模板，用于开发更有效的抗微生物衍生物，这些衍生物可以作为抗细胞药物使用。还研究这些化合物的作用机制可用于理解与MAS生物合成有关的代谢过程。

4。结论

本文报告了两种物质对重要代谢途径的抗致细菌活性玉米菌菌，即霉菌酸生物合成。这些发现表明，AC451和乙氧基脲素是有前途的抗细管抗细菌，影响霉菌酸代谢。这些分子是化学模板，以获得更有效的衍生物。

承认

本研究由COLCIENCIAS赞助(批准号:no。1115-12-17822)，Universidad de Antioquia和SubdireccióndeConvestigacióndelInstituto Nacional de Salud de Colombia。

参考

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