氦气孔是否会在腹腔镜检查期间降低脓毒动物中的高炎症反应？

摘要

背景/目的．对腹膜感染和随访手术手术的加剧反应的特征在于强烈的上炎症状态，其幅度与组织损伤的严重程度成比例。与开放手术相比，腹腔镜检查产生较低的组织损伤，并应诱导不那么明显的免疫反应。本研究的目的是确定氦镜是否辅助的腹腔镜，而不是二氧化碳肺肺胆管内溶扰物在脓毒症中诱导减毒炎症状态。材料和方法．将三十二次Wistar大鼠随机分成四个相等的组，其中两组被提交给二氧化碳或氦气肺术辅助腹腔镜连接和穿刺（CLP）诱导脓毒症和随后的腹部灌洗。将两组对照组提交以与二氧化碳或氦气相同的腹腔镜手术，作为嵌入剂气体，但没有CLP。24小时后，血清水平的肿瘤坏死因子α（TNF-α.)、白细胞介素1和6(分别为IL-1和IL-6)和皮质醇。结果．在接受二氧化碳或氦气腹腔腹腔镜检查的脓毒症动物组中，I - L-1和IL-6的平均浓度没有显著差异，但显著高于各自的非clp对照组。相反，TNF-的水平α.和皮质醇在两组败血性动物中是相似的，但没有显著不同于各自的非clp对照组。结论．由于促炎TNF-的水平，腹腔注射氦气与二氧化碳在炎症反应方面相似α.在这两种气体中，IL-1和IL-6和抗炎皮质醇的含量是相当的。

1.介绍

腹膜炎是外科手术中常见的一组严重程度不同的异质疾病的最终表现。弥漫性粪便腹膜炎是最严重的感染形式，可迅速导致腹部败血症，如不及时治疗，可发展为感染性休克、多器官衰竭和死亡[1］．

由腹膜感染诱导的炎症反应产生患者的生理和免疫改变，其由神经内分泌，代谢和免疫系统之间的复杂相互作用产生[2，3.］．此外，手术切口、组织剥离、脏器和血管操作、血管内皮暴露等引起的组织损伤与全身炎症反应密切相关[4］．对感染和任何伴随治疗的加重反应的特征是强烈的促炎期，而这种高炎症状态对个体是有害的，因为，矛盾的是，它会导致免疫抑制作用[5]，其程度与组织损伤的严重程度成正比[6］．由此产生的免疫障碍产生了可能是致命的各种术后临床并发症[7］．

腹腔镜手术与开放手术相比产生较低水平的组织损伤，从理论上讲，应诱导不太明显的免疫应答[7］．在此基础上，腹腔镜在涉及腹部脓毒症患者的复杂手术中的应用越来越多[8］．这种手术需要通过向腹腔内注入气体(如空气、二氧化碳、一氧化二氮或氦)来形成气腹[9］．

目前，二氧化碳肺胆碱最常用于涉及没有患者或败血症的患者的选修和应急手术中使用。一些研究人员据报道，二氧化碳肺胆管内含有诱导细菌腹膜炎的实验动物的死亡率[10.- - - - - -12.，表明二氧化碳对加重的炎症反应有保护作用。另一方面，Chekan等人[13.]观察到二氧化碳肺肺嘧啶在感染的小鼠中降低了腹膜内免疫反应单核细胞增多性李斯特氏菌与氦气相比，增加了控制传染病传播的难度。众所周知，二氧化碳的存在减少了促炎细胞因子的产生，如肿瘤坏死因子(TNF-)α.）和白细胞介素1和6（分别），表明气体暂时通过可能与局部或全身pH的减少相关的机制抑制巨噬细胞活性[14.- - - - - -18.］．根据Hanly等人[19.，在腹腔镜手术中，二氧化碳气腹介导的炎症反应的衰减是通过涉及腹膜细胞酸化的机制发生的。

然而，标准压力二氧化碳气腹相对于腹壁提升(有或没有低压气腹)或应用替代注入气体的优势尚未明确确立，特别是在局部和全身免疫反应方面[7］．在二氧化碳抑制炎症反应已被证明对个体免疫功能有害的情况下[13.]，诸如氦之类的惰性气体可用作替代烟囱[20.］．一些研究人员(10.，18.，21.]据说，与氦的二氧化碳相比是有利的，与在微创手术中的肺炎骨酮中的氦气中的氦气相比，因为它在限制炎症反应并保持个体的免疫状态方面更有效。然而，Sietses等人。［21.[致力于提交涉及二氧化碳或氦气孔的患者的患者，如IL-6等促炎细胞因子的水平相似。此外，Jacobi等人。［15.结果表明，在大鼠腹膜炎模型中，氦气比二氧化碳更能降低菌血症的发生率，并减少全身炎症。

考虑到腹部脓毒症的病理生理学和治疗结果尚不清楚，我们假设氦气腹可以降低腹腔镜治疗腹腔脓毒症大鼠的高炎性反应。本研究的目的是比较腹腔诱导脓毒症大鼠经腹腔注射二氧化碳或氦气后的全身免疫反应，并测定脓毒症的生物标志物皮质醇、IL-1、IL-6和TNF-的水平α.一组老鼠接受了不同的治疗。我们的结果增强了我们对气腹形成过程中不同气体的影响的理解。

2.材料和方法

该研究得到了米纳斯吉拉斯联邦大学动物伦理委员会的批准(2015年12月9日;协议没有。417/2015)，并按照国家动物实验控制委员会(concea)发布的人道主义使用动物指南进行。

2．1.动物与实验设计

本实验采用随机设计，采用米纳斯吉拉斯州联邦大学动物屋提供的12周龄雄性Wistar大鼠32只。动物被饲养在标准的木笼子里，在12小时的光周期下喂养自由用商业鼠食和水。实验动物随机分为4组，每组8只。两组患者分别进行盲肠结扎和穿刺(CLP)诱导脓毒症和随后的腹腔冲洗，包括腹腔镜手术中使用二氧化碳或氦气腹腔(SLC组和SLH组)。两个对照组接受相同的腹腔镜手术，使用二氧化碳气腹或氦气气腹(分别为CLC和CLH组)，但不使用CLP。SLC组、SLH组、CLC组、CLH组的平均体重(g±标准误差)分别为303.50±29.97、233.88±63.33、249.13±21.72、304.63±32.31 g。

2.2。外科手术

术前，所有动物均接受单次肌肉注射(30 mg/kg)抗生素头孢曲松(罗芬;罗氏公司，里约热内卢de Janeiro, RJ，巴西)，随后肌肉注射氯胺酮混合物麻醉(40 mg/kg;Cristália products Químicos e Farmacêuticos, Itapira, SP，巴西)和xylazine (8 mg/kg;先灵葆雅，Cotia, SP，巴西)。SLC组和SLH组的动物接受腹腔镜检查，并根据情况适当注入二氧化碳或氦气15分钟，以暴露盲肠，并按照标准技术进行CLP(图)1）[22.］．CLC和CLH组的动物接受了相同的程序，但没有进行CLP。手术开始后2小时，所有组的动物都进行腹腔镜腹腔检查，包括适当的二氧化碳或氦气灌注15分钟。在此过程中，用5 mL 0.9%生理盐水加热至37℃，对动物进行两次腹腔冲洗，并将多余的液体抽吸。术后给所有实验动物单剂量布洛芬(10 mg/kg)。术后24小时，每只动物经下腔静脉穿刺采集外周血2ml，转入不加抗凝剂的小瓶。血液样本以2500 rpm离心2次，离心10分钟，随后分离血清，并保存在−80°C的冰箱中，用于后续的促炎生物标志物和皮质醇水平的评估。然后对所有实验动物实施过量氯胺酮(120 mg/kg)安乐死。

２.３.免疫测定

使用荧光偏振免疫分析(FPIA)试剂盒测定皮质醇，使用Quantikine™大鼠IL-1测定IL-1β试剂盒(R&D Systems, Thermo Fisher Scientific, Minneapolis, MN, USA)、IL-6和TNF-α.使用Legend MAX™RAT IL-6和TNF评估α.Elisa套件（Biolegend，圣地亚哥，CA，美国）。在室温和等分试样中解冻血清样品（50 μ.l）将96孔微孔板与50一起转移到96孔 μ.L磷酸盐缓冲液和18 μ.l根据测定套件供应商的指示。将平板在室温下孵育2小时，用500洗涤 μ.L缓冲液，2500 rpm离心10分钟。取各孔上清液，用200稀释μ.L缓冲液，使用ASYS专家加分光光度计（Biochrom，UK）测定450nm和550nm处的吸光度差异。

２.４.统计分析

采用1989年的IBM®SPSS®Statistics软件进行统计分析。将数据提交到Kolmogorov-Smirnov正态检验，使用单因素方差分析(ANOVA)比较正态分布的变量，然后使用Bonferroni的多重比较检验或两两学生的比较t以及。采用多元Kruskal-Wallis检验或Mann-Whitney检验对呈现非正态分布的变量进行比较U比较两个样本平均值的检验。组间差异被认为有统计学意义 ．

3.结果

CLP和腹腔镜检查表现后24小时进行的测定显示，抗炎皮质醇和促炎细胞因子TNF-的平均水平α.在SLC和SLH动物中没有显着差异（ ）来自各自的控制CLC和CLH（表1）.此外，SLC组和SLH组动物的皮质醇水平相似，TNF-组也是如此α.．

另一方面，SLC和SLH动物中IL-1的平均浓度显著升高(和0.0001分别比各自的对照，尽管SLC和SLH组的动物之间的差异不显着（ ）.同样，SLC和SLH动物的IL-6平均浓度显著升高(虽然没有显着差异（ ）两组之间关于这种细胞因子的水平。

4。讨论

在本研究中，我们评估了TNF-的水平α.，IL-1，IL-6和皮质醇在腹部败血症的鼠模型中，并表明，与其各自的非CLP对照相比，腹腔镜手术在腹腔镜手术后24小时，促炎白细胞介素的水平明显高。这些细胞因子的升高与急性条件的发育兼容，并且无论腹腔镜手术中使用的腹部腹部类型如何都会发生。有趣的是，对于TNF的水平没有观察到显着的改变α.和皮质醇在CLP组与他们各自的非CLP对照组进行比较。

急性腹膜炎的发病率和死亡率很高，仔细控制感染源仍然是成功治疗的关键[8，23.］．微创手术技术的使用，特别是经皮液体引流和腹腔镜，在复杂的腹部感染的患者边缘的生理状况，如糖尿病、肥胖、高龄和免疫抑制，腹腔镜手术的负面影响，虽然是控制感染的基础，但可能会超过益处[23.］．虽然经皮引流在大多数情况下是可行的，但一些复杂的情况，如袢间、瘘管和缺血区域之间的解剖部位或脓肿，需要切除，导管引流不可行[23.］．由于这些原因，腹腔镜手术在外科医生中获得了腹部败血症患者困难操作的普及[8］．

知识人体反应，特别是免疫应答，微创手术是重要的，因为它为医生提供了关于使用小说方法或接入路线治疗其患者的风险和益处的决策的基础。腹部败血症领域的台式转化药物目前是相当大的兴趣，并且需要调查该综合征的演变中的具体方面和干预因素，鼓励寻找繁殖人类免疫系统行为的动物模型．已经使用几种方法在动物模型中诱导腹膜炎，包括腹腔沉积粪便，接种特定菌株和微生物量，并打开肠道并建立连续性的路径以提供内源性粪便污染来源[24.］．后一种模型包括CLP技术，本研究采用CLP技术，因为它被认为是评估脓毒症情况下免疫反应的标准方法，及其与侵袭性操作的相关性[25.］．实验模型的选择对于研究的临床应用是重要的，因为它受到兴趣变量的影响，并影响所获得的整体结果。

脓毒症临床表现的严重程度不仅取决于所涉病原体的毒力，还取决于在疾病发展过程中宿主产生的免疫功能障碍的程度[5，25.］．细胞因子，特别是tnf-α.和IL-1，是免疫反应的重要调节因子，败血症中的病理生理作用已被广泛研究[26.］．TNF-的释放α.从巨噬细胞开始在煽动事件后30分钟内开始，而IL-1以类似的时间框架释放，主要来自活性巨噬细胞。虽然这两种细胞因子作用于不同的靶细胞（巨噬细胞，内皮细胞和中性粒细胞），但通过激活免疫细胞分泌诸如促炎细胞因子，炎症的脂质介质和反应性氧气和氮气物种的免疫细胞阵列，均可扩增炎症级联。．以这种方式，tnf-α.IL-1协同作用诱导一种以血管通透性、严重肺水肿、出血和发热为特征的休克样状态。

促炎细胞因子IL-6由多种细胞产生，包括巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞、内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞，响应脂多糖、IL-1和TNF-的刺激α.．IL-6的浓度在诸如手术应力，创伤，多器官衰竭和TNF之后的脓毒症休克和峰值的条件下升高α.和IL-1。实际上，IL-6的血浆水平被认为是疾病严重程度的可靠指标。然而，尽管其促炎特性，IL-6也已被证明通过抑制TNF的释放来促进抗炎反应α.和IL-1，并提高抗炎介质IL-10、转化生长因子(TGF-)的水平β）和糖皮质激素皮质皮质醇[26.］．

皮质醇的浓度是通过一连串的事件控制的，包括下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活，下丘脑开始释放促肾上腺皮质激素(CRH)。这种激素促进脑下垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)的产生，ACTH反过来刺激皮质醇的合成。在脓毒症的急性期，全身的皮质醇浓度升高，并且已经证明在脓毒症过程的前24小时内的皮质醇水平是一个很好的预后指标[27.］．全身皮质醇水平升高的机制尚不完全清楚，但可能是CRH和ACTH的直接增加或间接抑制皮质醇在HPA轴上的负反馈作用引起的。此外，有研究表明TNF-具有刺激作用α.、IL-1和IL-6在HPA轴[28.，29.］．

最近关于败血症病理生理机制的研究表明，促炎细胞因子的加剧释放（所谓的“细胞因子风暴”），如TNF-α.，IL-1和IL-6，由某些抗炎细胞因子抵消，包括IL-10，转化生长因子（TGF） -β和IL-4，试图恢复免疫学稳定性[26.］．邓等人[5]采用CLP小鼠模型，然后静脉注射铜绿假单胞菌为了证明在12小时的峰值峰值后细胞因子水平随着峰值的峰值而增加，但在24小时后，促炎和抗炎细胞因子的水平，而细菌载荷保持高。这些作者结论是CLP手术后的一天是过度释放到免疫抑制的转折点。

虽然二氧化碳是腹腔镜手术中最常用的气体[9]但它作为灌篮器的优点受到挑战。据称，二氧化碳吹气有助于通过涉及腹膜腔的酸化的机制和炎症细胞因子IL-1和TNF的可逆抑制的机制有助于减毒免疫应答。α.［14.，18.］．在此背景下，Hanly等人[10.]报道二氧化碳气腹使血浆IL-10增加35%，TNF-减少α.结果表明，il -10介导的TNF-下调可降低死亡率α.．其他研究表明，二氧化碳吹入量增加存活率并阻止鼠模型中的死亡率与诱导腹膜炎[10.，11.]甚至可以显示保护效果[12.］．然而，一些研究人员已经证明氦气吹入优于维持免疫反应的二氧化碳[13.]及降低菌血症及局部及全身炎症[15.］．其他影响局部和全身炎症的变量是使用的气压和腹腔镜检查的持续时间。Schietroma等[30.[腹腔镜肾上腺切除术，表明炎症标记（中性粒细胞弹性蛋白酶，IL-6和IL-1和C反应蛋白）的水平显着降低，减压CO₂在术后24小时内进行评估。

本研究的结果表明，由于促炎TNF-的水平，在小鼠腹腔脓毒症模型中，无论使用二氧化碳还是氦气来创建气腹，炎症反应都是相似的α.在这两种气体中，IL-1和IL-6和抗炎皮质醇的含量是相当的。选择最合适的气腹气体仍然取决于医生，因为它取决于各种因素，包括麻醉类型、生理相容性、毒性、使用的便利性、安全性、输气方式和成本。

我们的研究在一定程度上受到了样本量小和生物标志物评估时间短(24小时)的限制。特别是，意外发现TNF-α.在24小时内没有上升的皮质醇水平可以归因于检测所采用的测定方法的限制，使得细微改变保持不可检测。我们工作的力量居住在采用的适当控制中。进一步的研究应该解决这些限制，并专注于对氦气和二氧化碳肺肺卟啉基对其他变量的相互作用的研究。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中（表格1）.

利益冲突

作者宣布关于本条的出版物没有利益冲突。

参考

1. E. P. Weledji和M. N. Ngowe，《腹腔内败血症的挑战》国际外科杂志，第11卷，第5期。4, pp. 290-295, 2013。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
2. C. Ingels, J. Gunst，和G. Van den Berghe，《败血症的内分泌和代谢改变及其对治疗的影响》，关键护理诊所第34卷第3期1, pp. 81-96, 2018。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
3. A. J. Lewis, T. R. Billiar, M. R. Rosengart, R. Matthew，和M. R. Rosengart，“败血症的生物学和代谢:先天免疫、生物能学和自噬，”手术感染，第十七卷，第二期3, pp. 286-293, 2016。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
4. M. G. Davies和P.-o。哈根，“全身炎症反应综合征”，英国外科杂志(第84卷)7，第920-935页，1997。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
5. 邓东，李新民，刘超等，“CLP小鼠模型从过度炎症到免疫抑制的转折点及其特征的系统研究”，国际免疫药理学，第42卷，第2期1，第49-58页，2017。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
6. W.L.BIFFL，E. M. Moore，F.A. Moore和V.M.Peterson，“受伤患者中白细胞介素-6。炎症损伤或介质的标记？“手术史第224期5，第647-664页，1996。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
7. Y.W.Novitsky，D.E.M. Litwin和M. P. Cally，“腹腔镜手术的净免疫优势”，手术内窥镜检查，卷。18，不。10，pp。1411-1419,2004。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
8. R. Cirocchi, S. Afshar, S. Di Saverio等人，“急性结肠憩室炎继发腹膜炎手术的历史回顾:从Lockhart-Mummery到循证医学，”世界急诊手术杂志，第12卷，第2期1, 2017。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
9. “腹腔镜腹部手术中形成气腹的气体”，Cochrane系统评论数据库，卷。6，物品ID CD009569,2017。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
10. E. J. Hanly, J. M. Fuentes, A. R. Aurora等人，“二氧化碳气腹可防止败血症的死亡率，”外科内窥镜和其他介入技术，第20卷，第2期。9, pp. 1482-1487, 2006。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
11. 梅泽尔德，库布勒，下高原，d - h。Chang, G. Vieten和B. Ure，“CO₂气腹可提高多微生物性腹膜炎小鼠的存活率。欧洲小儿科手术杂志，卷。18，不。3，pp。171-175,2008。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
12. A. A. Sorbello, J. L. M. C. Azevedo, J. T. Osaka, S. Damy, L. M. França, E. C. Tolosa，“二氧化碳对大鼠细菌性腹膜炎的保护作用”，手术内窥镜检查，第24卷，第2期8，页1849-1853,2010。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
13. E. G. Chekan, C. Nataraj, E. M. Clary等，“腹腔内免疫与气腹”，手术内窥镜检查，卷。13，不。11，pp。1135-1138，1999。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
14. M. A. West, J. Baker和J. Bellingham，“巨噬细胞暴露于一氧化碳中，lps刺激的细胞因子释放减少的动力学₂”,外科研究杂志，第63卷，第2期1，第269-274页，1996。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
15. C. A. Jacobi, J. Ordemann, E. Halle, H. D. Volk，和J. M. Müller，“在腹膜炎动物模型中，二氧化碳和氦腹腔镜检查对局部和全身炎症的影响，”腹腔镜与高级外科技术杂志，第9卷，第5期。3，页305-312,1999。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
16. T. Matsumoto, S. Tsuboi, B. Dolgor, T. Bandoh, T. Yoshida，和S. Kitano，“腹腔气体对大鼠模型细胞因子反应和细菌易位的影响”，手术内窥镜检查，第15卷，第5期。1，页80-84,2001。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
17. M. Kos，J.F. Kuebler，N.K.Jesch等人，“二氧化碳差异地通过细胞外pH的改变来影响巨噬细胞群的细胞因子释放”外科内窥镜和其他介入技术，第20卷，第2期。4，页570 - 576,2006。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
18. E. Hanly，A. aurora，J. Fuentes等，“与CO的腹部吹蛋导致腹膜酸度独立于全身pH值，”胃肠外科杂志，第9卷，第5期。9，pp。1245-1252，2005。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
19. E. J. Hanly, A. A. Aurora, S. P. Shih等，“腹腔镜手术中腹膜酸中毒介导免疫保护，”手术，第142卷，第2期。3，页357-364,2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
20. S. J. Neuhaus, A. Gupta, D. I. Watson，“腹腔镜的氦和其他替代注入气体”，手术内窥镜检查，第15卷，第5期。6，pp。553-560,2001。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
21. C. Sietses，M. E.Von Blomberg，Q. A. J. Eijsbouts，R. H. J. Beelen，F. J. Berends和M. A. Cuesta，“CO.Cuesta”的影响₂而氦气注入或腹壁提升技术对全身免疫反应的影响外科内窥镜和其他介入技术，卷。16，不。3，PP。525-528,2002。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
22. P. R. R. Bicalho，L.B.Ima，D.G.D。Alvarenga，I. Duval-Araujo，T. A. Nunes和F. A. D。REIS，“对大鼠腹腔镜诱导的腹膜炎的临床和组织学反应，”Acta Cirurgica Brasileira，第23卷，第2期。5，第456-461页，2008。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
23. M. Soop和G. L. Carlson，《复杂腹腔内感染外科治疗的最新进展》，英国外科杂志，第104卷，第104号2, pp. 2 - 4, 2017。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
24. E. A.船只，“腹部感染的啮齿动物模型”震惊，第24卷，第2期1，页19-23,2005。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
25. L. Dejager, I. Pinheiro, E. Dejonckheere和C. Libert，“盲肠结扎和穿刺:多微生物败血症的金标准模型?”微生物学的趋势第19卷第2期4, pp. 198 - 208,2011。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
26. W. Schulte, J. Bernhagen，和R. Bucala，“脓毒症中的细胞因子:有效的免疫调节和潜在的治疗靶点——更新的观点”炎症介质，卷。2013年，第165974号，16页，2013年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
27. R. de Castro，D.Ruiz，B.-A。Lavín等人，“皮质醇和肾上腺雌激素作为脓毒症患者死亡率的独立预测因子”普罗斯一体第14卷第2期4、文章编号e0214312, 2019。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
28. F. Sweep, C. Rijnkels和A. Hermus，“通过细胞因子激活下丘脑-垂体-肾上腺轴”，Acta Endocrinologica，卷。125，没有。6，pp。84-91,1991。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
29. M. J. M. van der Meer, C. G. J. Sweep, C. E. M. Rijnkels等，“IL-1ß、TNF对下丘脑-垂体-肾上腺轴的急性刺激α.和IL-6:剂量反应研究，”内分泌调查杂志第19卷第2期3，pp。175-182,1996。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
30. M.Schietroma，B. Pessia，D.Stifini等，“腹腔镜肾上腺切除术中的腹部炎症和免疫反应的”低和标准腹腔内压力的影响：一项前瞻性随机研究“MINIMAL访问手术杂志CHINESS，第12卷，第2期2, pp. 109-117, 2016。视图:出版商网站|谷歌学术搜索

版权

版权所有©2020 Paulo Roberto Rodrigues Bicalho et al。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。