文摘gydF4y2Ba

黄曲霉gydF4y2Ba是一个aflatoxin-producing真菌,消费时对人类和动物是有毒的。检测真菌可以帮助防止这种危险。四分子的方法,即传统的等温扩增(灯),PCR,定量灯(qLAMP)和qPCR相比,决定他们的效率gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba检测。三十的样本收集花生、虾米从15个市场在泰国附近多个省份。样本人工感染10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba分生孢子/毫升gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba1小时和充实一天代表真正的污染。结果表明,敏感性检测gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba灯在PCR, qPCR, qLAMP 50 ng, 5 ng, 5 pg,分别和5 pg。gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba在30个花生、虾米从市场是所有四个方法发现的。检测率约为20%,60%,100%,和100%与PCR、灯、qPCR和qLAMP分别。分子检测技术,特别是灯、qPCR qLAMP,可以检测致病性真菌迅速与常规PCR相比,高灵敏度和可靠性。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

食品安全问题是重要的问题,是威胁人们的健康gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),尤其是在发展中国家。食品安全的主要问题是污染食物中毒的细菌和真菌等微生物。本研究强调只有真菌,尤其是属gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

属gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba包括超过600种;大约40种已知导致人类疾病(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。这种危险的物种产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是一组显示急性免疫和肝毒性的真菌毒素人类。黄曲霉毒素也表现出很高的致癌的潜在的慢性接触后(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba部分gydF4y2BaFlavigydF4y2Ba包括物种能产生多种毒素其中黄曲霉毒素是食品安全最重要。即使把真菌污染的各种各样的食物和谷物(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)等干果,坚果,可食用的种子(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),大米,香料(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),和香草(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。食品和饲料尤其容易被即使殖民gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba在温暖,干燥的天气。即使把真菌能产生毒素在食物链的几个阶段,收获前的、加工、运输和存储等(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

即使把真菌物种的真菌属分为三个部分gydF4y2Ba曲霉属真菌,gydF4y2Ba即。,部分sFlavi Nidulantes,gydF4y2Ba和gydF4y2BaOchraceoroseigydF4y2Ba(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。其中,部分gydF4y2BaFlavigydF4y2Ba包括16个物种能产生大量的有毒化合物(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。然而,gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba和gydF4y2Ba答:寄生gydF4y2Ba是很重要的,因为他们生产食品中黄曲霉毒素gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba和gydF4y2Ba答:寄生gydF4y2Ba产生有毒物质的不同配置文件。gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba产生黄曲霉毒素B1、B2、cyclopiazonic酸,aflatrem, 3-nitropropinic酸、杂色曲霉素,versicoloringydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,和aspertoxin,而gydF4y2Ba答:寄生gydF4y2Ba产生黄曲霉毒素B1, B2, G1, G2, versicoloringydF4y2Ba一个gydF4y2Ba(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在这项研究中,gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Banorsolorinic酸还原酶基因(NOR1)被选为与PCR分子检测,qPCR,灯,qLAMP。该基因参与黄曲霉毒素B合成。nor1编码norsolorinic酸还原酶。这种酶转换norsolorinic averantin酸。然而,研究人员调查了其他基因参与了黄曲霉毒素的生物合成。三个基因的多重PCR技术,gydF4y2BaaflMgydF4y2Ba,gydF4y2Ba妊娠,gydF4y2Ba和gydF4y2BaaflR,gydF4y2Ba被用来检测gydF4y2Ba黄曲霉gydF4y2Ba在花生,玉米,和三个昆虫通常存在于存储谷物(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。Reddy et al。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)使用gydF4y2BaaflRgydF4y2Ba和gydF4y2BaaflOgydF4y2Ba检测gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba污染的大米样品。然而,并不是只用于黄曲霉素生物合成基因决定的gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba污染。gydF4y2Ba

因此,有效的方法来识别和检测即使真菌在食品和原材料应该发达。目前,分子如聚合酶链反应(PCR)方法,实时PCR或定量PCR (qPCR)和loop-mediated等温扩增(灯)是有效的检测食品污染的微生物。gydF4y2Ba

如今,灯已成为有趣的方法来取代PCR由于其更快速,简单,和特异性反应。在现在,灯已开发和应用在许多应用程序中,例如性别决定在人类gydF4y2Ba17gydF4y2Ba),检测猪肉在清真食品gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),检测gydF4y2Ba鼠疫enterocoliticagydF4y2Ba在猪肉gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),和检测gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba感染鸡的样品(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)这个方法在等温条件下进行温度范围60°C - 65°C为60分钟(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。有两套引物;内引物和外底漆集用于灯在六种不同的DNA序列在特定目标DNA, DNA和初级放大由内部开始底漆。中介DNA结构特点形成的灯,称为茎环结构的DNA片段,生成,大量的DNA产品由一个摩托车反应(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

然后,本研究旨在比较PCR的效率,qPCR,灯和qLAMP方法检测aflatoxin-producing物种内gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba部分gydF4y2BaFlavigydF4y2Ba并将这些方法应用于检测真菌DNA纯化,孢子悬浮液人为污染样品,和自然污染的花生、虾米收集当地市场附近多个省,泰国。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。真菌隔离和文化条件gydF4y2Ba

协助。从微生物学教授博士Ladawan Wasinpiyamongkol部门,理学院,兰实大学,泰国,请提供所有的真菌文化(gydF4y2Baa . flavus a .尼日尔Pennicillium oxalicum,木霉属asperellum,gydF4y2Ba和gydF4y2Ba根霉gydF4y2Basp)。文化都是维护在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA、Difco、桶/美国)补充50 mg / l的Choloramphenicol Gentamycine 25 mg / l。琼脂板在孵化28°C±2°C为7 - 10天,然后每天监测真菌菌落的外观。孤立的真菌的DNA提取使用真菌DNA提取工具包(PrestoTM迷你gDNA酵母设备;Geneaid,新台北市,台湾),DNA浓度测量使用NanoDrop 2000 c Spectophotometer(热科学)。gydF4y2Ba

2.2。PCR引物设计和灯gydF4y2Ba

PCR引物组(Nor1-F和Nor1-R)和灯引物组(F3-nor1, B3-nor1、FIP-nor1 BIP-nor1)被设计为特定norsolorinic酸还原酶基因(NOR1)(改编自路德维希Niessen和他的同事们(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba])。每个引物的核苷酸序列如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

表1gydF4y2Ba
列表的引物PCR和灯的反应。gydF4y2Ba
2.3。PCR和qPCR反应gydF4y2Ba

PCR分析针对Norsolorinic酸还原酶基因与灯引物比较并行执行的检测效率,如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。SYBR绿色我染料用于提高qPCR反应的特异性。PCR扩增包含1×Taq DNA聚合酶缓冲区,1.2毫米核苷酸,0.8gydF4y2BaμgydF4y2BaM F3和B3引物,8 U Taq DNA聚合酶(新英格兰生物学实验室),和5 ng的DNA提取作为模板在最后一卷25gydF4y2BaμgydF4y2Bal。循环条件组成的一个初始变性在95°C 3分钟之后35周期在90°C 30秒(变性),56°C 30秒(退火),72°C 30秒(扩展),和最后一个在72°C扩展步骤5分钟。PCR扩增后,550个基点的产品被使用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析,分析凝胶DocgydF4y2BaTMgydF4y2BaXR +与图像实验室gydF4y2BaTMgydF4y2Ba美国软件(BIO RAD)。gydF4y2Ba

2.4。灯和qLAMP反应gydF4y2Ba

所有灯反应进行跟踪的方法Kanchanaphum和VichaibungydF4y2Ba20.gydF4y2Ba包含5毫米MgSO]gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,400 mM甜菜碱(σ),1.2毫米核苷酸,0.8gydF4y2BaμgydF4y2BaM F3和B3引物2gydF4y2BaμgydF4y2Ba工厂检验计划和毕普引物,和8 U Bst DNA聚合酶(新英格兰生物学实验室)。灯后反应,产品被使用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析,分析凝胶DocgydF4y2BaTMgydF4y2BaXR +与图像实验室gydF4y2BaTMgydF4y2Ba美国软件(BIO RAD)。qLAMP放大是由添加0.5gydF4y2BaμgydF4y2BaL我SYBR绿色染料(表达载体,卡尔斯巴德,CA)正常灯反应。gydF4y2Ba

2.5。PCR的特异性和敏感性,qPCR灯,qLAMPgydF4y2Ba

的特异性测试,5gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/gydF4y2BaμgydF4y2BaL DNA模板gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba和非gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba受到PCR和灯的方法。gydF4y2Ba

DNA检测的敏感性gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba从5系列稀释10倍gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/gydF4y2BaμgydF4y2Ba50 L pg /gydF4y2BaμgydF4y2Ba我为所有的四种方法。gydF4y2Ba

2.6。人工污染的花生、虾米gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba

实验、花生、虾米样本转移到无菌容器中,然后,Kanchanaphum和Vichaibun[的方法gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba),Shapira et al。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba],Siruguri et al。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba随访。然后,所有样本干在层流罩在紫外线照射下3分钟。之后,花生、虾米注射10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba分生孢子/毫升gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba。样本孵化1、3、6、24小时。,分别。然后,受感染的样本在PDA培养1和2天浓缩时间。之后,真菌DNA提取。gydF4y2Ba

2.7。的检测gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba花生、虾米样本来自当地市场gydF4y2Ba

三十个花生样品和三十虾米样本收集的15府省当地市场,泰国。购买后,所有的样品都是存储在一个冰盒,立即送到实验室进行DNA提取和进一步的实验。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。PCR的特异性试验和灯gydF4y2Ba

PCR的特异性测试结果和灯方法如图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba,分别。这两种方法证明了特异性与非测试时的100%gydF4y2Ba曲霉属真菌flavusgydF4y2Ba菌株。gydF4y2Ba

(一)gydF4y2Ba
(一)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba
PCR的特异性测试(a)和(b)灯。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba= DNA标记。巷1 =gydF4y2Ba黄曲霉gydF4y2BaDNA。巷2 =gydF4y2Ba黑曲霉gydF4y2BaDNA。巷3 =gydF4y2BaPennicillium oxalicumgydF4y2BaDNA。巷4 =gydF4y2Ba木霉属asperellumgydF4y2BaDNA。巷5 =gydF4y2Ba根霉sp。gydF4y2BaDNA。gydF4y2Ba
3.2。qPCR PCR的灵敏度测试,灯,qLAMPgydF4y2Ba

十倍稀释的DNA模板被用来比较和确定检测这四个方法的局限性。PCR分析,550个基点PCR产品中发现了1和2,如图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba。PCR测定的检出限是50 ng。灯的检测极限的反应是5 ng,如图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba。因此,灵敏度qPCR和qLAMP 5 pg,如图gydF4y2Ba2 (c)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 (d)gydF4y2Ba。的gydF4y2BaRgydF4y2Ba2gydF4y2Ba值标准曲线的周期从qPCR阈值是0.9996,和gydF4y2BaRgydF4y2Ba2gydF4y2Ba值标准曲线的时间来检测从qLAMP为0.9292,如图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

(一)gydF4y2Ba
(一)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
(c)gydF4y2Ba
(c)gydF4y2Ba
(d)gydF4y2Ba
(d)gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba
PCR (a)的敏感性测试,灯(b), qPCR (c)和qLAMP (d)。gydF4y2Ba
(一)gydF4y2Ba
(一)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba
循环阈值的标准曲线qPCR (a)和时间的检测qLAMP (b)。gydF4y2Ba

在图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba,gydF4y2Ba(我)gydF4y2Ba车道gydF4y2Ba米gydF4y2Ba= DNA标记gydF4y2Ba(2)gydF4y2Ba巷1 =gydF4y2Ba黄曲霉gydF4y2BaDNA 5gydF4y2BaμgydF4y2BaggydF4y2Ba(3)gydF4y2Ba巷2 =gydF4y2Ba黄曲霉gydF4y2BaDNA 500 nggydF4y2Ba(iv)gydF4y2Ba巷3 =gydF4y2Ba黄曲霉gydF4y2BaDNA 50 nggydF4y2Ba(v)gydF4y2Ba巷4 =gydF4y2Ba黄曲霉gydF4y2BaDNA 5 nggydF4y2Ba(vi)gydF4y2Ba巷5 =gydF4y2Ba黄曲霉gydF4y2BaDNA 500 pggydF4y2Ba(七)gydF4y2Ba巷6 =gydF4y2Ba黄曲霉gydF4y2BaDNA 50 pggydF4y2Ba

所以,每个方法的敏感性(PCR、qPCR灯,和qLAMP)总结表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

表2gydF4y2Ba
四种检测方法检测的灵敏度gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba感染。gydF4y2Ba
3.3。的检测gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba在攀升和自然受污染的花生和虾米样本市场gydF4y2Ba

人工感染,样本1小时,然后孵化培养1天的PDA。样本孵化1、3、6、24小时。,分别。然后,受感染的样本培养在PDA 1和2天浓缩时间。之后,真菌DNA提取。gydF4y2Ba

总共30花生样品和30虾米样本收集来自15个市场附近多个省,泰国,是丰富的一天。与所有四个DNA提取和放大后化验,结果,如表所示gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

表3gydF4y2Ba
的数量gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba感染样本来自15个市场(30样品)的PCR, qPCR,灯,qLAMP方法。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

在这项研究中,gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Banorsolorinic酸还原酶基因(NOR1)选择与PCR分子检测,qPCR,灯,qLAMP因为它是高度有效的检测gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba污染的食物。这些引物显示高特异性和敏感性。NOR1之外,内部转录间隔区区域1和2 (ITS1和ITS2)也用于检测曲霉菌。莱文(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)报道,ITS1和ITS2 PCR引物的敏感性gydF4y2Ba答:寄生gydF4y2Ba哥伦比亚广播公司(CBS) 126.62 9.03 pg,而我们的结果为使用nor1基因的PCR检测的目标是500 ng。我们的敏感度很低而莱文和同事gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。所以,PCR条件如镁离子的浓度可能会调整灵敏度越好。PCR的灵敏度主要取决于三个因素:反应的物理化学条件,DNA模板的浓度,和特定的引物gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。然而,我们的研究结果为灯反应是50 ng,这很类似于罗等人的发现曾经acl1 (ATP柠檬酸裂解酶亚基1)来确定污染(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。灯的敏感性结果反应是20 ng (gydF4y2Ba27gydF4y2Ba),这意味着灯方法的敏感性比PCR方法。gydF4y2Ba

qPCR和qLAMP用于提高性能。雀斑等。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)使用qPCR方法检测和特征gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba物种。Schabenreiter-Gurtner et al。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)也使用qPCR检测不同gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Ba针对2地区物种的真菌。两个Frickle s . et al。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)和Schabenreiter-Gurtner et al。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)杂交探针用于执行qPCR检测、昂贵和复杂。gydF4y2Ba

因此,在这项研究中,一个方法使用SYBR绿色荧光。这是更多的成本效益和更少的复杂比杂交探针方法或TaqMan方法,基于双重olignonucleotide标记。这项研究的结果证明了qPCR (50 pg)灵敏度比常规PCR检测10000倍(500 ng)敏感性检测。像qLAMP qPCR方法,方法改进传统灯的效率的方法。qLAMP方法的性能(50 pg. DNA) 1000倍比传统灯的方法(50 ng。DNA)。这些结果是根据Marmiroli和大师gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。他们报告说,溴化乙锭染色的检测极限大约60 ng DNA(目视检查)和pg DNA SYBR绿色我gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。溴化乙锭染色的检测极限大约60 ng DNA(目视检查)和pg DNA SYBR绿色我gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

从这项研究中,可以看出的检出率gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba花生、虾米感染使用PCR从市场非常低,花生和13.33%正面积极的20%虾米(从表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。大量的负面结果的主要原因是PCR的限制。PCR技术的效率是50 ng DNA的病原体,而灯的效率和qPCR和qLAMP都是10和10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba次,分别高于PCR。所以灯比PCR熟练3倍,而qPCR和qLAMP有大约5 - 7.5倍水平比普通PCR(从表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

检测低数量的分析的能力gydF4y2Ba答:flavusgydF4y2Ba在花生、虾米被证实。另一方面,所有四个方法需要复杂的设备,如凝胶电泳装置或实时PCR仪,检测DNA扩增。进一步的研究可以发展横向流试纸或最小的致命剂量方法检测DNA扩增的产品,因为它是更容易和更少的复杂。最晚完成日期的方法也可以检测放大产品没有凝胶电泳装置,它是有用的领域研究。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

结果表明,PCR,灯,qLAMP, qPCR方法可以检测到gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba污染的花生、虾米。特别是,灯和qLAMP方法更快速、可靠和健壮gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba检测样品和可能是有用的分子工具的常规测试。此外,qLAMP和qPCR方法最有效的灵敏度。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者要感谢协助。博士教授Laddawan Wasinpiyamongkol,微生物学,理学院,泰国兰实大学提供真菌在这项研究。作者真诚地感谢斯图尔特·米勒批判纠正英语语法。这项工作是支持的兰实大学的研究所,泰国(批准号50/2562)。gydF4y2Ba