植物化学研究和抗菌和抗生素调节活性石榴(石榴)离开

摘要

本研究旨在测定其植物化学成分含量、抑菌特性及抗生素调节潜力石榴叶提取物:正己烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、水提取物以及富含总低聚物黄酮类化合物(TOFs)的提取物。TOF提取物中酚类和类黄酮含量最高。采用高效液相色谱法测定了芦丁、木犀草素、没食子酸和鞣花酸的含量。采用纸片扩散法和微量稀释法测定其抑菌活性金黄色葡萄球菌和大肠杆菌标准ATCC菌株和临床分离的耐药菌株。TOF提取物对所有供试菌株的活性最高。采用棋盘格法测定阿莫西林和头孢噻肟两种抗菌药物的协同作用p . granatum叶提取物。用TOF提取物联合与青霉素抗性的Amoxicillin结合的最佳协同相互作用大肠杆菌和抗金黄色葡萄球菌．这些结果可以归结为丹宁酸、类黄酮和酚酸p . granatum叶提取物。石榴叶提取物或从提取物中分离出的活性化合物可用于防治抗性菌株的出现和传播。

1.介绍

根据世界卫生组织(世卫组织)2014年的报告，抗菌素耐药性是一个日益严重的公共卫生问题，已达到令人震惊的程度。耐多药菌的出现使抗菌治疗无效，延长了病程和住院时间，增加了死亡率[1］.其中一个解决办法是联合使用抗生素和其他药物，以产生协同作用。许多项目旨在开发新一代植物药物，可单独使用或与抗生素联合使用。这种新一代的植物药物可能会给植物疗法带来新的合法性，它可能会治疗传统上用合成药物治疗的疾病[2］.

石榴L.常见的是石榴是Lythraceae家族的一小棵树。它是来自波斯的本土，在加利福尼亚州，中国，日本和俄罗斯等地区，在地中海国家和西班牙等地区，在地中海国家，以及在一定程度上，在地中海国家培养了广泛的培养[3.］.成分的p . granatum已经参与了许多不同的生物和药理活动。据观察，石榴叶中所含的酚类物质对其健康有益。这些酚类物质对不同的分子结构如蛋白质或糖蛋白具有很强的结合能力，可以拮抗细菌的抗性[2］.

因此，本研究旨在测定6种不同的石榴叶提取物的植物化学成分含量、抑菌性能和抗生素调节潜力。

2.材料和方法

2．1.植物材料

的叶子p . granatum(Gabsi品种)于2015年9月从突尼斯南部的Gabes地区采集。生药学实验室(突尼斯Monastir药学院)保存了一份代金券标本(Herbarium 23/2015)，以备将来参考。叶子被荫凉干燥，粉末，并储存在一个紧密封闭的容器中以备以后使用。

２.２.植物提取物的制备

通过连续的Soxhlet萃取（6小时）获得己烷，氯仿，乙酸乙酯和乙醇萃取物。将这四种提取物随着极性增加，浓缩至干，并在4℃下保持。

水提物取50 g植物材料，500 mL沸水煎煮20分钟。提取液过滤后冷冻干燥，4℃保存。

富含总低聚物黄酮类化合物（TOFS）的萃取物，如[4.，用丙酮/水(2v / 1v)的混合物浸渍。丙酮过滤后，减压蒸发，剩余水相用NaCl饱和。在4°C过夜形成的沉淀通过过滤去除。用乙酸乙酯进行液-液萃取。将有机相在减压下浓缩，然后倒入过量的氯仿中。所得絮凝剂对应于TOF。

对于植物化学研究以及抗菌和抗生素调节试验，将每种提取物溶解在适当的溶剂中。在相应的阴性对照中使用相同的溶剂。

２.３.植物化学的研究

2.3.1。植物化学的初步筛选

对提取物进行筛选，以确定是否存在次生代谢物，如单宁、黄酮类、皂苷、心脏苷、花青素和生物碱。通过使用特定试剂处理后所发生的特征颜色变化来定性检测次级代谢物[5.］.

2.3.2。酚类，黄酮类化合物和单宁的总含量的测定

植物提取物中酚类物质的总含量p . granatum是由福林-乔卡图法测定的[6.］.事实上,到100年μ2毫升碳酸钠(钠₂CO._3.)和0.1 mL Folin-Ciocalteu试剂在50%。在室温下孵育30分钟后，石油蓝色表示多酚的存在，这是在720 nm波长下测量的。以没食子酸为标准品，结果以毫克没食子酸当量每克干质量(DM)表示。

采用氯化铝比色法测定各提取物中黄酮的含量[7.］.这个方法包括添加75μl为5％纳米₂, 150年μL 10%全铝_3.，最后是500 μ1 N NaOH的L到250μ叶提取物溶液的L。将体积调至2.5 mL，室温孵育5分钟。在510 nm处测定吸光度。以槲皮素为标准，结果以每克DM的槲皮素当量(QEs)表示。

单宁含量由福林-丹尼斯测定[8.］.我们增加了10μ福林-丹尼斯试剂到50μL，其次是25μL饱和碳酸钠溶液，室温孵育90分钟。在760 nm处测量吸光度。单宁酸作为标准品，结果以每100克DM的毫克单宁酸当量(TAEs)表示。

2.3.3。TOF萃取的高效液相色谱表征

采用梯度洗脱和二极管阵列检测的高效液相色谱法测定TOF提取物中的酚酸(没食子酸、鞣花酸)和黄酮类化合物(芦丁、木樨草素)。

使用Shimadzu LC-2030 3D加（突出-I）色谱仪进行HPLC分析。流动相含有1％乙酸水溶液（溶剂A）和乙腈（溶剂B），将流速调节至0.7ml / min，将塔在28℃下恒温控制，并将注射体积保持10 μL.通过改变溶剂B与溶剂A的比例进行梯度洗脱:在10% ~ 40% B条件下洗脱28 min，在40 ~ 60% B条件下洗脱39 min，在60 ~ 90% B条件下洗脱50 min。在55分钟内，将流动相成分恢复到初始条件(溶剂B:溶剂A: 10:90)，再运行10分钟，然后再进样。采用Chrom-CloneTM C18色谱柱(5μm粒径，250 × 4.6 mm)，采用254 nm的二极管阵列紫外检测器检测[9.］.

用甲醇(0.1 mg/mL)制备没食子酸、鞣花酸、芦丁和木樨草素的标准溶液。将1 mg TOF提取物溶于1 mL甲醇中制备样品溶液。标准溶液和样品溶液都通过Whatman 0.45进行过滤μm注射器过滤器。反应被测量为峰值面积和浓度。

2.4。抗菌活性

2.4.1. 菌株

抗菌活性的p . granatum测定提取物对革兰氏阳性菌的抑制作用(金黄色葡萄球菌)革兰氏阴性菌(大肠杆菌)．提取液对从美国型培养物(金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923和大肠杆菌ATCC 25922)和从Monastir大学医院微生物科获得的临床分离株，耐药谱见表1．

测定抗性调节活性，抗抗性菌株：抗青霉素金黄色葡萄球菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,抗大肠杆菌，以及多药耐药大肠杆菌．

2.4.2。纸片扩散法

根据国家委员会委员会标准（NCCLS）报告的方法进行盘扩散方法。用不同的萃取液浸渍6mm直径的无菌纸盘，然后风干。每个磁盘包含大约20个 μ提取液的浓度为5 mg/mL。用浸渍过溶剂的空白圆盘作为阴性对照。这些纸圆盘被放置在Müller-Hinton琼脂上接种了被测试的细菌(10^8.CFU /毫升)。在37°C孵育24小时后，以毫米为单位测量抑制带的直径。

2.4.3。采用方法

采用96孔板微量稀释法测定最小抑菌浓度(MIC) [10那11］.接种量为100μL中的每种菌株悬浮在Müller-林顿肉汤中的最终浓度为10^6.96孔微孔板采用CFU/mL。每个收到100μ每个提取溶液的L。使用两倍连续稀释，提取物的最终浓度从5到0.04 mg/mL不等。在37°C孵育24小时后，40μ每孔加入浓度为0.2 mg/mL的MTT。在孵育30分钟后，mic(抑制生长所需的最低浓度)被记录为抑制细菌悬浮液变色为蓝色所需的最低浓度。

2．5．抗生素调制

常用来测定抗生素与天然抗菌素协同作用的棋盘法用于抗生素调节试验[12］.该方法与分级抑制浓度(FIC)指数的计算相结合。为了评估我们的提取物与阿莫西林和头孢噻肟的协同作用，我们首先确定了这些抗生素的MIC (MIC)_作为)和提取物的MIC (MIC_Ext)，然后我们确定它们合并后的新MIC (MIC’_作为和麦克的_Ext)．必须确定FIC来判断抗生素和天然提取物之间的相互作用:

菲莎 = 菲莎_一种 + FIC_B.与膜集成电路_一种=麦克风'_作为/麦克风_作为和膜集成电路_B.=麦克风'_Ext/麦克风_Ext

“协同效应”由FIC指数定义 ≤ 0.5. 当FIC指数介于0.5和4.0之间时，表明两种药物之间“没有相互作用”。菲莎指数 = 4.0将表明两个代理之间存在“对抗”。

四唑盐微量稀释法[10测定植物提取物的MIC和阿莫西林、头孢噻肟的MIC。根据其MIC值确定制剂的初始浓度，然后分两步连续稀释。

3.结果与讨论

3．1.植物化学的研究

在这项研究中，从粉末叶中制备六种提取物p . granatum．提取物的产率取决于提取溶剂和提取方法，各不相同0.5至20.07％（表2)．用含水提取物得到最高提取产率，并用乙酸乙酯提取物获得最低产率。

初步的植物化学研究表明，黄酮和可水解单宁存在于乙醇提取物、水提取物和TOF提取物中。我们的结果与之前发现的酚酸，黄酮类化合物和水解单宁的发现相比较p . granatum叶子(13-15］.但是，一些报告发现，除了类黄酮和单宁，其他次生代谢产物，如生物碱[16]和花青素[17］.

根据初步的植物化学研究结果，测定了黄芩叶提取物中酚类、黄酮类和鞣质的总含量p . granatum测定。结果如表所示2．TOF中酚类物质含量最高(382.27±6.46 mg GAE/g DM)，类黄酮含量最高(492.88±19.25 mg QE/g DM)，其次为水提物(262.98±5.11 mg GAE/g DM)和287.33±15.55 mg QE/g DM)。水提物单宁含量最高(125.92±3.9 mg TAE/100 g DM)，其次是乙醇提物(96.81±2.27 mg TAE/100 g DM)。正己烷提取物中不含酚类、黄酮类和单宁。在氯仿提取物中也未发现黄酮类化合物。极性提取物比非极性提取物含有更多的次级代谢产物。事实上，类黄酮和单宁等多酚的酚性使它们相对亲水性和高度溶解于水和极性有机溶剂，如甲醇、乙醇和乙腈，或它们的水混合物中[18］.TOF的酚类和类黄酮含量最高，但单宁含量较低，因为它是通过去除单宁并添加类黄酮的纯化方法获得的。本研究中酚类总含量(410.85±10.15 mg GAE/g DM)和类黄酮类总含量(286.88±20.73 mg QE/g DM)均高于[17]它们是289.76 ± 1.55 mg GAE/g DM和82.6 ± 2.67 QE/g DM，分别在通过使用增加极性溶剂（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇和甲醇）的冷浸渍法连续提取获得的提取物中。这种差异可以通过提取方法和收获时间来解释。事实上，我们使用索氏仪器通过连续提取制备提取物，这比冷浸渍的效率更高。索氏法使用新鲜溶剂，该溶剂始终提供给样品，从而产生最大分析物溶解度[19］.收获时间对酚类和类黄酮的含量有影响。石榴叶中酚类物质和类黄酮的总含量在叶生长初期很低，然后逐渐增加，直到9月底[16］.在单宁含量测定方面，我们发现极性提取物(水提物、乙醇提物)的单宁含量最高。单宁通常通过甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯水溶液从天然组织中提取。非极性有机溶剂(己烷、氯仿和二氯甲烷)对单宁的萃取强度较低[20.］.

两种黄酮类化合物和两种酚酸通过高效液相色谱分析的TOF提取物(图1)．黄酮类化合物为芦丁(3.56±0.11 mg/g)和木犀草素(0.81±0.031 mg/g)。酚酸分别为没食子酸(9.65±0.092 mg/g)和鞣花酸(8.56±1.54 mg/g)。色谱图还包含其他未确认的峰。

据报道p . granatum叶片中含有酚酸(没食子酸、鞣花酸)、黄酮类化合物(芹菜素、木犀草素、芦丁等)和可水解单宁(紫褐藻素、corilagin、granatin等)[13-15那21］.

３．２．抗菌活性

抗菌活性p . granatum采用琼脂圆盘扩散法和微量稀释法对提取物进行体外抗革兰氏阳性和革兰氏阴性人类致病菌检测。桌子3.综述了不同提取物对微生物生长的抑制作用。金黄色葡萄球菌标准株和耐药株的体外抗菌研究金黄色葡萄球菌和大肠杆菌显示,p . granatum叶提取物对所有受试菌株均有不同程度的抗菌作用。圆盘扩散和微量稀释两种技术都给出了一致的结果。抑制区直径从8到19不等 mm和MIC值在0.625到5之间变化 mg/mL。TOF提取物对所有受试菌株最具活性。事实上，该提取物对革兰氏阳性和革兰氏阴性标准菌株（MIC）表现出显著的活性 = 0.625 mg/mL）和青霉素耐药菌株（MIC = 2.5 毫克/毫升）。它还表现出一种有趣的抗甲氧西林耐药的活性金黄色葡萄球菌（MIC = 1.25mg / ml），它是全世界主要的医院病原体，只有一些抗生素如万古霉素和丁塞蛋白是活跃的[22］.乙醇提取物对所有细菌均有活性金黄色葡萄球菌菌株和标准大肠杆菌(MIC = 2.5 mg/mL)。水提物对大肠杆菌标准菌株(MIC = 1.25 mg/mL)金黄色葡萄球菌标准菌株(MIC = 2.5 mg/mL)。

这种抗菌活性可以归因于丹宁酸和黄酮类化合物p . granatum叶提取物。已知这些植物化学基团含有抗菌化合物[23那24］.因此，它们在植物提取物中的存在可以证明所观察到的活性，特别是在多酚含量最高的TOF提取物、水提取物和乙醇提取物中。本文采用圆盘扩散法研究了石榴叶的抑菌作用。事实上，这些研究表明，甲醇提取物对所有测试菌株的抑制效果最好(金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、，和伤寒沙门氏菌) [25］.甲醇叶提取物p . granatum还显示出对多药物抗伤的主要细菌分离物的抗菌活性铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌，和大肠杆菌[26］.采用微量稀释法研究了石榴叶乙酸乙酯提取物的抑菌活性，其MIC为3.75 mg/mLP铜绿假单胞菌，麦克风为7.5 毫克/毫升大肠杆菌，最低MIC为15 mg/mL金黄色葡萄球菌[27］.

3.3。抗生素调制

通过p . granatum通过计算表中所示的FIC指数进行提取4.. TOF提取物与阿莫西林的协同作用对青霉素耐药效果最好大肠杆菌和抗金黄色葡萄球菌(FIC = 0.125)。TOF提取物与头孢噻肟对甲氧西林耐药也有协同作用金黄色葡萄球菌(FIC = 0.5)。水提物和乙醇提物在降低青霉素抗性方面有相似的作用金黄色葡萄球菌与阿莫西林（FIC）合用 = 0.25). 氯仿提取物和乙酸乙酯提取物与阿莫西林和头孢噻肟对所有耐药菌株均无协同作用。

在相互作用研究中，发现如TOF，乙醇和含水提取物等极性提取物特别有效地对抗青霉素抗性菌株。这些提取物含有最多量的酚类化合物，例如黄酮类化合物。事实上，许多研究表明，在用抗生素的协同作用中，酚类化合物如黄酮类，单宁和酚醛酸，对抗毒性细菌的治疗策略构成了有希望的替代方案。所提出的协同机制是细菌膜的共渗透和青霉素酶活性的抑制[28那29］.工作(30.结果表明，石榴乙醇提取物抑制重组新德里金属-β-内酰胺酶1（NDM-1）活性与IC₅₀值为0.76 ng/μL相同的提取物导致NDM-1的增加大肠杆菌细胞的渗透性。此外,甲醇p . granatum叶提取物能产生明显的抑制生物膜的形成l . monocytogenes和金黄色葡萄球菌[31］.值得注意的是，生物膜的形成是细菌耐药的一个重要机制。最后，没食子酸是一种酚酸，存在于TOF提取物中，通过抑制多药耐药的外排泵与四环素表现出协同作用大肠杆菌[32］.据我们所知，没有文献研究测量了石榴叶提取物的抗生素调节潜力β内酰胺抗生素。

4.结论

植物化学初步筛选p . granatum叶提取物中含有可水解的单宁和类黄酮。用分光光度法对总酚、黄酮和单宁进行的定量分析证实了这些结果，尤其是TOF、水和乙醇提取物。抗菌研究表明，TOF提取物是对所有受试菌株最有效的提取物。最重要的结果是前一种提取物对耐甲氧西林药物的活性金黄色葡萄球菌．TOF提取物与阿莫西林对青霉素耐药的协同作用也最好大肠杆菌和抗金黄色葡萄球菌. 高效液相色谱法测定TOF提取物中的黄酮和酚酸，结果表明存在芦丁、木犀草素、没食子酸、鞣花酸和其他未确定的物质。

综上所述，石榴叶提取物或从提取物中分离出的活性化合物可用于改善人类健康，特别是预防和治疗传染病，以及对抗耐药菌株的出现和传播。然而，这些提取物的作用机制和毒性仍有待进一步研究。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章中。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

这项研究得到了突尼斯共和国高等教育和科学研究部的支持。

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