文摘

在这项研究中,bioactivity-guided分馏是在空中进行的部分牛蒡l .然后提取进行了测试在体外在乳腺癌(MCF-7),结肠直肠癌(hct - 116),和正常细胞(EA.hy926)。正己烷分数(EHX)的乙醇提取物显示了强劲的活动对MCF-7及其EA.hy926细胞系(IC₅₀值:14.08±3.64,27.25±3.45μ分别为g / mL)。使用MCF-7 EHX proapoptotic活动的评估。形态变化可视化使用赫斯特染色和透射电子显微镜。癌症细胞信号转导途径进行调查,EHX显著调节p53, TGF -β和NF -κb .此外,EHX发现扰乱转移性的乳腺癌细胞的抑制细胞增殖,迁移,入侵和殖民。的抗血管新生活动EHX分数显示微血管的有力抑制大鼠主动脉IC₅₀值:4.34±1.64μ克/毫升。VEGF-A表达的差别这一结果得到了对这些高达54%。超过20个化合物中确定EHX采用气相,豆甾醇,ß谷甾醇,3-O-acetyllupeol主要活性化合物。EHX植物化学的分析显示较高的酚类和类黄酮含量与抗氧化活性。总之,这项工作证明答:披巾有价值的抗癌活性和抗血管新生的属性在乳腺癌治疗中很有用。

1。介绍

牛蒡l . (答:披巾)是一种可食用的植物,产于北亚洲和欧洲。它是受欢迎的蔬菜在亚洲国家,它被用于许多传统欧洲菜。在中国,它被用作药用植物1,2]。的抗癌特性答:披巾已经验证了提取和分离原则通过各种研究。最近的研究发现答:披巾拥有一个强有力的对各种癌症细胞的抗增殖作用,如人类多发性骨髓瘤(MM) [3),人类骨髓(k562) [4)、乳房(MCF-7)、肝(Huh-7),口咽(HTB-43)和膀胱(ecv - 304) [5]。的主要活性成分答:披巾木酚素、甾醇类、萜类化合物和多酚。几项研究显示,ß谷甾醇(固醇)抑制肿瘤的生长和凋亡刺激前列腺癌;此外,它降低了乳腺癌细胞的生长和转移(6]。萜类化合物,如羽扇豆醇,作为一种强有力的抗血管新生药物。羽扇豆醇能抑制neovessel形成nontumor模型,如凸轮和大鼠角膜模型,在异种移植肿瘤模型。它还会使血管生成基因如MMP-2和9日VEGF-A flt-1, HIF-1α这与肿瘤发生的相关条件(7,8]。

乳腺癌是女性最常见的癌症。在2019年,估计有268600名妇女被诊断为乳腺癌在美国。大约有12.8%的美国妇女会在他们的一生中被诊断出患有乳腺癌[9,10]。乳腺癌是分为三个主要的亚型基于分子标记的表达雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR),和人类表皮生长因子受体2 (HER2)。激素受体阳性乳腺癌是最常见的诊断(70%的患者)。三阴性乳腺癌比其他类型更积极和更有可能复发10,11]。细胞凋亡和血管生成事件坚决控制复杂的分子信号系统(12]。bcl - 2基因被发现在乳腺癌细胞的70%,而且它。差别与p53基因对这些p53一直被称为“监护人”基因组的细胞周期阻滞和细胞凋亡诱导效应(13- - - - - -15]。TGF -β信号通路被认为是一把双刃剑,它可以作为肿瘤抑制和致癌途径。TGF -的过度β在乳腺癌细胞可以显著抑制肿瘤的发展(16]。NF -κB是一个重要的贡献者抑制血管生成和细胞死亡。然而,一些研究报道,NF -κB激活阻碍肿瘤发生在活的有机体内肿瘤模型(17]。VEGF-A血管生成级联是一个关键因素。它调节几个病理损伤的新血管形成和乳腺癌等疾病18]。

在这部作品中,空中的部分答:披巾受到bioactivity-guided分馏和正己烷提取测试吗在体外和体外proapoptotic活动和抗血管新生的属性。

2。材料和方法

2.1。化学品和材料

使用的溶剂丙酮、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、正己烷和由Riedel-de Haёn,德国。所使用的化学物质在细胞培养的研究中,也就是说,杜尔贝科的修改鹰介质,heat-inactivated胎牛血清,青霉素和链霉素溶液,罗斯威尔公园纪念研究所中,磷酸盐,胰蛋白酶,四唑盐(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5二苯溴化四唑)、二甲亚砜,由Sigma-Aldrich,德国。人类乳腺癌细胞(MCF-7)结直肠癌细胞(hct - 116),内皮细胞(EA.hy926)从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。的试剂体外文化研究(两性霉素B、抑肽酶、纤维蛋白原、厄尔的盐(M199)、谷酰胺,庆大霉素,凝血酶,基底膜基质,和苏拉明)和赫斯特分析(赫斯特33342染色和para-formaldehyde)从Sigma-Aldrich购买,美国。

2.2。工厂收集和验证

的地上部分答:披巾收集从大马士革大学药用植物的花园,大马士革,叙利亚,2015年3月。凭证标本被植物学家验证Shunmugam先生(代码:11328)和沉积在标本单位学院的生物学、马来西亚理科大学。

2.3。提取和分离

获得的粗提物答:披巾由浸渍方法在45°C 48 h。顺序,三开始使用不同极性溶剂与非极性溶剂石油醚(PT),紧随其后的是乙醇(ETH)和水(WT) [19]。三种提取然后进行MTT试验测试,ETH提取显示最高的活动。获得的分离是由液-液分离和四个溶剂使用,也就是说,正己烷(EHX)、乙酸乙酯(EEA)、正丁醇(EB)和水(EW),分别20.]。

2.4。细胞培养和细胞线

116年人类细胞系,HCT(结直肠癌)MCF-7(荷尔蒙乳腺癌),和EA.hy926(人类内皮细胞),写明ATCC获得,美国。细胞培养在湿润的气氛(37°C)有限公司₂(5%)在生长培养基补充10%的边后卫和青霉素和链霉素(1%)。MCF-7 EA.hy926细胞在DMEM培养(英国Gibco /生命技术),而hct - 116细胞培养在rpmi - 1640(美国Sigma-Aldrich)。

2.5。细胞生存能力

MTT试验进行评估的抗增殖作用答:披巾提取和分数hct - 116, MCF-7, EA.hy926细胞。试验板是读者阅读使用微量滴定板在570 nm (Thermolab系统、芬兰)。绝对乙醇作为消极的控制。他莫昔芬和桦木酸用作MCF-7 EA.hy926,积极控制分别(21,22]。

2.6。赫斯特染色试验

核染色质凝结是一个关键的特性描述细胞凋亡。MCF-7 1×10的浓度⁵细胞/毫升每添加24-well板,并孵化24 h。取代原有的媒介和EHX添加浓度为7.5,15日和30日μ克/毫升乙醇或绝对的控制样本。板是reincubated 24小时。中被丢弃,细胞被PBS冲洗,para-formaldehyde 4% (w / v)添加细胞固定。20分钟后,赫斯特33258染色(10μg / mL;σ)添加到每个(300μ信用证),板进一步孵化了20分钟。缩微图像是20 x放大使用荧光显微镜下拍摄(美国佛罗里达州evo) [23]。

2.7。形态变化MCF-7用透射电子显微镜(TEM)

与EHX MCF-7细胞治疗24小时或绝对乙醇。细胞被固定为0.1 M McDowell-Trump和四氧化锇染色(1%)。细胞被固化在琼脂(2%),切成小的幻灯片,脱水乙醇丙酮紧随其后。幻灯片是嵌入在树脂和渗透五天Suprr混合物60°C,每天多次改变。随后,他们将在树脂成型模具,并切成0.1μ米厚度。超薄部分与甲苯胺蓝染色(美国Sigma-Aldrich)和收集在铜网格。因此,这是双重染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅(美国Sigma-Aldrich) [24]。最后,这些细胞被拍到使用TEM(卡尔蔡司EFTEM天秤座120年,德国)在1250 x放大。

2.8。细胞信号通路

confluency MCF-7细胞收获50%的-80%。细胞被播种(75μ信用证)在96孔板组件(美国Promega)和孵化12 h。旧的媒介是吸气,取而代之的是DMEM (75μl)包含EHX (10μ克/毫升)或车辆。板是孵化24 h。然后,每个好评Dual-Glo®试剂(75μL),孕育了板在室温下1 h。萤火虫荧光素酶记者是衡量使用发光标(HIDEX、芬兰)。Dual-Glo®停下来,如果®试剂添加到每个(75μL),孕育了板在室温下1 h。Renilla荧光素酶记者是衡量使用发光标(HIDEX、芬兰)。褶皱的变化在每个途径活性测定按照下列公式:

褶皱的变化途径活性=善待比率(萤火虫/ Renilla) /未经治疗的比率(萤火虫/ Renilla)。

2.9。MCF-7细胞系集落形成试验

本试验的目的是为了测试提取抑制癌细胞的能力殖民(25,26]。MCF-7被播种(2毫升/)6-well板500细胞/毫升的浓度和孵化12 h。取代原有的DMEM和EHX添加不同浓度(0.87 7μg / mL);三苯氧胺被用作积极控制(10μg / mL),绝对乙醇被用于消极的控制。48小时后,治疗补充了新鲜DMEM每3 - 4天,直到大殖民地(50细胞)的形成。殖民地是固定的,与结晶紫染色(0.2%)(美国Sigma-Aldrich)。电镀效率的百分比(PE %)和幸存的分数的百分比计算。

2.10。MCF-7细胞的细胞入侵检测

入侵检测进行评估的能力,抑制癌细胞转移阶段的轮回。人工基底膜是用移液器吸取(1:1 DMEM)在96孔板和孵化了45分钟。然后,MCF-7 (150μ信用证)被播种在5000细胞/浓度。板是治疗EHX(7.5和15μg / mL)或绝对乙醇。24小时后,图像被抓获的每个使用荧光显微镜4 x放大。

2.11。细胞迁移试验MCF-7细胞

进行了分析评估能力阻止细胞迁移(27]。一个支流6-well板单层MCF-7被挠。板当时被EHX在不同浓度(15和30μg / mL)或绝对乙醇。随后,照片被捕获在三个时间点(0、6和12 h)。最后,这些照片进行了分析使用ImageJ®软件测量各点之间的距离把双方的细胞。

2.12。实验动物

Sprague-Dawley雄性老鼠是动物研究和提供的服务中心(ARASC)在马来西亚理科大学。动物是8到12周的老(200 - 230克)和在运输过程中保持在一个安静和干净的房间,合适的温度、照明系统、通风前几天被牺牲了。研究动物伦理委员会批准的协议,振子结构(批准参考号:2016 / (102)(782))。

2.13。体外大鼠主动脉环试验

三维(3 d)分析进行估计的反血管增生疗效微血管化合物的结果发芽从模型大鼠主动脉环(28,29日]。胸主动脉离体的很仔细,分为环M199 1毫米厚度的介质(英国Gibco /生命技术)。新鲜的环直接移植48-well板和下一层添加(300μ信用证)。每一个好评10μL(凝血酶(50 U /毫升生理盐水)(美国Sigma-Aldrich)。板是孵化60分钟,然后,上层添加了治疗(300μ信用证)。四天的板是孵化。后来,上层用移液器吸取了仔细,取而代之的是一个刚做好上层与类似的治疗和板是孵化24小时。最后,戒指拍摄4 x放大使用显微镜evo fl(数字倒置显微镜,美国)。层是由M199越低,纤维蛋白原3毫克/毫升,抑肽酶5μg / mL,谷酰胺1% (v / v)。上层由M199,的边后卫20% (v / v),谷酰胺1% (v / v),两性霉素B 1% (v / v),ε氨基己酸0.1% (w / v)和庆大霉素0.6% (v / v)。各浓度处理准备(3 - 100μg / mL)答:披巾集成电路的计算₅₀。苏拉明(100μL /毫升)和绝对乙醇作为积极的控制和消极的控制,分别。

2.14。VEGF

对待MCF-7细胞和细胞溶解使用向导®SV裂解缓冲(美国麦迪逊Promega)。使用酶联免疫试剂盒的测定是由人类的vegf - 165根据制造商的协议(美国Raybio)。

2.15。气相色谱分析-质谱法(gc - ms)

ETH和EHX气相色谱仪惠普6890 n (G1530N)(惠普、中国)附加与惠普5973 (G2579A)四极质谱计,70 eV。固定相是打包在一个非极性毛细管柱HP-5MS 19091 s - 433。的初始温度为70°C,开始2分钟。然后,它是提高到285°C的速度20°C /分钟。氦流量为1.2毫升/分钟。扫描时间和质量范围是1 s和35 - 650°(米/z),分别。然后,样本注入(1μL)在230°C的源温度四极柱的温度为150°C。然后,质谱和质量/电荷比(米/z)的分子离子的引用数据相比NIST02图书馆(30.]。

2.16。总酚含量的测定

ETH的总酚含量和EHX是评估使用Folin-Ciocalteu试剂作为执行之前31日,32]。样本的准备(1毫克/毫升)的100年μ与750年L和混合μL稀释Folin-Ciocalteu试剂的蒸馏水(1:10),然后在黑暗中孵化在室温下5分钟。碳酸氢钠溶液(750μL)的浓度增加了60 g / L。然后,它被关在黑暗环境中30分钟30°C,和吸光度测量725海里使用紫外分光光度计(帕金λ45)。没食子酸作为标准。

2.17。总类黄酮含量的测定

总类黄酮含量是评估使用铝氯法和槲皮素被用作标准(33]。样品(500μL在管)准备在1毫克/毫升的浓度;然后,我们添加了0.1毫升的10%氯化铝溶液,1.5毫升的甲醇,乙酸钾溶液,0.1毫升的1米,2.8毫升蒸馏水。孵化后30分钟在室温下,吸光度读数是在415 nm使用分光光度计(帕金λ45)。

2.18。DPPH自由基清除实验

样本的准备(6 - 200μg / mL)并将其添加到100μL DPPH (1,1 diphenyl-2-picrylhydrazyl)最终浓度为100μM DPPH。无水甲醇作为消极的控制。所有样本孵化37°C,然后,吸光度测量的标在512 nm (Thermolab系统、芬兰)。抗坏血酸(维生素C)被用作标准(34]。

3所示。结果

3.1。可行性分析

MTT试验进行两个癌症细胞系和一个正常细胞,即。,human colorectal carcinoma cell line (HCT-116), human hormone-sensitive breast cancer cell line (MCF-7), and human hybrid endothelial cell line (EA.hy926). The screening test of答:披巾提取(PT、ETH和WT)表明,乙相比更加活跃在MCF-7 PT和WT提取。细胞生存能力的百分比为22.95±1.01 (< 0.05)在100的浓度μ克/毫升。此外,ETH抑制EA.hy926细胞的增殖比其他提取35.53±0.64%细胞生存能力。分离后,筛选试验进行MCF-7和EA.hy926细胞系ETH分数(EEA EHX, EB和电子战)在100集中μ克/毫升。结果表明,EHX明显最细胞毒性相对于其他提取物和分数。细胞生存能力的百分比MCF-7和EA.hy926为16.1±1.81,22.97±1.37 (分别为< 0.05)(表1)。的集成电路₅₀值是14.08±3.64,27.25±3.45μ分别g / mL MCF-7和EA.hy926。积极的控制MCF-7它莫西芬(IC₅₀11.04±1.31μEA.hy926 g / mL),这是桦木酸(IC₅₀4.27±0.38μg / mL)(表2)。

3.2。MCF-7 Proapoptotic EHX活动

3.2.1之上。赫斯特染色试验MCF-7形态学变化

这个试验是由使用赫斯特33258染料渗透进入细胞的细胞核DNA染色(35]。缩微图像说明明显细胞收缩,肾形,凋亡的细胞(图处理1(一))。不同浓度计算凋亡指数(7.5,15日和30日μg / mL),结果表明存在剂量依赖的相关性与凋亡的关系值。凋亡指数值显著(< 0.05)不同浓度为25.13±5.87,47.97±4.23%的15至30岁μg / mL,分别,而低浓度(7.5μg / mL)显示无显著差异(21.58±4%)。

3.2.2。TEM MCF-7的超微结构变化

TEM MCF-7的超微结构进行了观察。细胞治疗EHX (10μg / mL) 24 h,缩微图像显示几个细胞凋亡诱导的迹象与控制样本(数据2(一个)和2 (b))。正常细胞形态的控制样本显示致密细胞内容,扩散染色质,和更少的液泡。另一方面,开发的治疗细胞凋亡变化如凝聚染色质、浮动核内容在细胞质中,凋亡的身体,液泡大小不同,没有核仁。这个结果表明MCF-7细胞的凋亡细胞死亡在EHX治疗(36]。

3.2.3。细胞信号通路

dual-luciferase记者系统是用来评估10信号途径参与细胞凋亡和血管生成过程(图2 (c))。数据表明,EHX调节3通路显著(< 0.05)。p53(3.05倍)是一种重要的proapoptotic标记,TGF -β(2.36倍)肿瘤抑制属性和NFkB(2.08倍)是一个重要的贡献者在扩散、转移和血管生成。然而,没有观察到显著变化等其他途径Wnt(1.4倍),切口(1.14倍),细胞周期(1.19倍),Myc / Max(1.04倍),低氧诱导因子(0.93倍)、MAPK / ERK(1.51倍),和MAPK /物(1.17倍)。

3.2.4。集落形成

集落形成试验进行的6-well板使用MCF-7细胞浓度的500细胞/毫升(图3(一个))。效果提出了细胞存活百分比和结果EHX浓度成反比(0.875,1.75,3.5和7μg / mL)。7点EHX显示,百分之零殖民μ克/毫升。细胞的生存比例为71.52±2.8,25.49±1.75和3.5的浓度为4.21%μg / mL,分别为(< 0.05)。然而,细胞存活率没有显著差异(93.37±5.61%)0.875的浓度μg / mL,而消极的控制(图3 (b))。它莫西芬(10μg / mL)被用作积极控制,它抑制细胞殖民了100%。电镀效率为15.1±0.56%。

3.2.5。细胞入侵

使用人工基底膜基底MCF-7细胞入侵评估。数据提出了作为细胞生存在EHX百分比浓度(7.5和15μg / mL)。缩微图像表现出显著减少细胞入侵剂量依赖性的方式(图4(一))。细胞存活百分比为45.35±2.04,67.18±3.75%,分别为(< 0.05),而对照组样本(图4 (b))。

3.2.6。细胞迁移

MCF-7的迁移能力测试在两个时间点(6小时和12小时)EHX治疗后在15和30μ克/毫升。伤口是同样在零小时的浓度(图4 (c))。治疗后6 h,显著抑制细胞迁移(< 0.05)值为32.36±3.7,45.02±2.1%,分别为(图4 (d)),而伤口大小变得窄比未经处理的细胞。12 h的治疗后,与15表示没有显著的影响μ克/毫升浓度,而更高的浓度(30μg / mL)表现出显著的抑制效应值为37.14±0.96% (< 0.05)。三苯氧胺被用作积极控制浓度的10μ克/毫升。未经处理的细胞呈现出更多的快速伤口关闭时间点,和伤口完全关闭12 h后相比,细胞治疗。结果表明,EHX能够抑制在体外MCF-7细胞的细胞迁移。

3.3。抗血管新生的活动

3.3.1。大鼠主动脉环试验

这个试验是评价抗血管新生的活动执行答:披巾提取和分数(数据5(一个)和5 (b))。数据提出了抑制微脉管的比例从大鼠主动脉环产物。提取(PT, ETH和WT)最初测试在一个100的浓度μ克/毫升,以确定最活跃的一个(表3)。乙醇提取物(ETH)最有力的影响(58.75±2.84%)相比与其他提取(< 0.05)。分离后,所有ETH分数(EHX经济区,EB和电子战)筛选在同一浓度(100μg / mL)。有趣的是,微血管EHX完全抑制发芽活动(100%),并显著(< 0.05)相比最活跃的其他分数。的集成电路₅₀EHX价值为4.34±1.64μg / mL,几乎类似于积极控制IC(苏拉明)₅₀值为4.62±1.17μ克/毫升。

3.3.2。MCF-7 VEGF表达的

微血管EHX影响鼠主动脉是由分子的发现支持特定于血管生成过程。vegf - 165蛋白表达在MCF-7评估细胞使用两个浓度的15和30μ克/毫升。结果显示显著(< 0.05)抑制VEGF表达后24 h(图5 (c))。VEGF蛋白的抑制百分比为43.35±2.65,54.61±3.59%,分别。

3.4。植物化学的研究

3.4.1。气相

ETH的gc - ms数据和分析了EHX使用MSD-ChemStation软件(美国安捷伦科技)。所有化合物都被比较的参考NIST02库(数据6(一)和6 (b))。表4- - - - - -6阐明(gc - ms)产生的色谱和质谱的可能的成分包括22日确认的主要山峰EHX ETH和20个化合物的化合物;他们包括保留时间(RT)、面积百分比,确定化合物,各自的分子量和分子结构。豆甾醇,ß谷甾醇,3-O-acetyllupeol ETH和EHX可用活性化合物在不同的百分比。EHX分数被发现有更高比例的豆甾醇,ß谷甾醇,3-O-acetyllupeol为4.41、6.34和5.56%,分别在面积的百分比ETH提取分别为2.49,3.82和2.83%,分别。

3.4.2。总酚类化合物

乙醇提取物中的总酚含量(ETH)及其分数(EHX)测量μg的没食子酸相当于毫克的提取(GAE eq /毫克)。乙的总酚含量和EHX为59.45±1.46,64.59±0.89μ分别为g GAE eq / mg提取(表7)。

3.4.3。总类黄酮

总类黄酮含量的测定μg的槲皮素相当于毫克的提取(QAE eq / mg提取)。结果乙和EHX为13.13±0.05,32.10±1.15μ分别为g QAE eq / mg提取(表7)。

3.4.4。DPPH清除活动

DPPH清除活动视为half-maximal抑制浓度(IC₅₀ETH的提取及其分数EHX。的集成电路₅₀ETH和EHX价值是62±2.84μg / mL和35.04±0.21μ分别g / mL。抗坏血酸(维生素C)与集成电路作为参考₅₀3.83±0.03μ克/毫升。

4所示。讨论

此前,报告显示抗癌活性答:披巾等各种细胞系小鼠肝癌细胞(HepA)和癌肉瘤细胞(S180),人类乳腺癌细胞(MCF-7),胃细胞腺癌(bgc - 823),小鼠脾淋巴细胞,和大肠癌细胞腺癌(Caco-2), (37,38]。在这项研究中,空中的一部分答:披巾测试两个癌症细胞系(MCF-7和hct - 116),并发现对MCF-7更加活跃。

根据Machado et al。37),乙醇提取物答:披巾及其乙酸乙酯部分抑制扩散Caco-2比其他提取物,和3小分支的22表现出强大的活动。我们的研究结果与以前的工作相对应的抗癌活性答:披巾。乙醇提取(ETH)答:披巾显著抑制扩散MCF-7相比其他提取。的集成电路₅₀ETH的价值为50.18±3.66μ克/毫升。因此,抗增殖活动逐步提高正己烷分数(EHX),这是来自最活跃的提取乙。EHX的疗效显著优于其它提取物和分数MCF-7 EA.hy926。的集成电路₅₀值分别为14.08±3.64,27.25±3.45μ分别g / mL。的确,答:披巾包含许多治疗成分包括木酚素、萜类化合物和植物固醇,多才多艺的生物活性针对癌症和病理性血管生成(7,39,40]。植物甾醇(豆甾醇和ß谷甾醇)成分已被证明在许多研究抗癌药物通过各种机制的行动,如抑制癌症细胞生长和诱导癌细胞凋亡40- - - - - -42]。因此,可以推测,这些化合物的抗增殖活动的原因答:披巾,和不同区域的百分比由气相色谱图可以解释降低集成电路₅₀相比EHX ETH提取。

赫斯特染色试验表现出明显的形态学改变,荧光显微镜下对细胞等细胞收缩,肾形,凋亡的身体比未经处理的细胞。这个结果是由一个超微结构的透射电子显微镜分析。插图的缩微图像处理细胞凋亡变化与控制样本:染色质凝集,漂浮的核心内容在细胞质中,凋亡的身体,液泡大小不同,没有核仁。这强烈表明,细胞死亡发生由于凋亡诱导乳腺癌细胞(36,43]。

此外,EHX的效果测试10日癌症细胞凋亡相关的信号通路和血管生成的过程。数据表明EHX显著调节3通路(p53, TGFβ和NFkB)。p53是一种肿瘤抑制基因,是非常参与细胞周期调控和细胞凋亡。(44]。p53的过度引起细胞周期阻滞或诱导凋亡细胞死亡。p53通过两个凋亡通路控制细胞死亡:死亡受体DR-5 Fas基因的激活,外在途径有关,贝克和激活,伯灵顿,和蛋白质,线粒体相关通路(14]。这表明proapoptotic活动对MCF-7 EHX可能归因于p53通路的激活。

TGFβ是一个主要的肿瘤抑制,这种蛋白质的缺乏增加了患癌症的风险。皮尔斯et al。45)发现,老鼠更耐TGF时乳腺肿瘤形成βhyperactivated,除了肿瘤回归效应。进一步研究表明,过度的TGF -β在乳腺癌细胞可以显著抑制肿瘤的发展(46,47]。我们的调节TGF EHX分数β在MCF-7显著。这可能是一个原因对MCF-7 EHX细胞的抗癌功效。

NF -κB作为监护人对细胞凋亡恶性细胞。许多研究都强调了NF -的重要作用κB通路在细胞生长、血管生成和抑制细胞死亡,它被认为是一个潜在的抗癌药物目标抑制恶性肿瘤(48]。然而,最近的研究挑战了这一观点,因为采用肿瘤模型的研究表明NF -κB激活也可能对肿瘤发生。有趣的是,NF -κB是直接连接到Fas表达,这是一个死亡受体家族的成员。规范化NF -κB通路被发现Fas转录激活剂,它会导致诱导凋亡细胞信号如半胱天冬酶8 [49]。在另一项研究中,非甾体类抗炎药物(阿司匹林)据报道,通过核易位NF -移植这一途径κB复合物诱导凋亡细胞死亡(50]。这个结果对应于阿司匹林诱导细胞凋亡的机制。答:披巾据报道,有消炎作用,阿司匹林暴露在癌细胞中也很明显。这强烈表明,凋亡细胞死亡在MCF-7可能是由激活的NF -κB通路(43,51]。

MCF-7细胞上进行了进一步的调查了解抗癌活性EHX包括集落形成、细胞迁移和入侵检测。转移性癌症细胞从细胞增殖迁移紧随其后。癌细胞必须能够容忍血流动力学压力和避免自然宿主免疫反应,以达到遥远的器官,肿瘤细胞必须适应新的微环境并开始殖民随着网络新血管(血管生成)来为他们提供至关重要的氧气和营养。因此,失败的这些步骤可以停止转移性肿瘤的生长过程。集落形成试验的进行,以确定EHX是细胞毒性的影响或抑制细胞生长的52]。细胞生存的百分比MCF-7细胞在高浓度(7是零μg / mL), EHX扰乱单个细胞生存和建立殖民地,从而证实了细胞毒性效应。然而,EHX在低浓度(1.75和0.875μg / mL)表现为抑制细胞生长的代理,在单独使用细胞开始恢复的删除EHX曝光。细胞迁移测试在体外在两个浓度(15和30μg / mL)。EHX的低浓度显著抑制MCF-7迁移到另一边的伤口在6 h,但其抑制作用明显下降后12 h。更高的浓度有一个更强大的和重要的抑制作用的时间点,和它的伤口仍然开放与控制样本相比,表明EHX可能影响乳腺癌细胞的迁移机制。癌症细胞的侵入邻近组织和肿瘤转移的脉管系统中扮演着重要的角色。细胞倾向于降低血管皮下基底膜进入血液和分散到其他身体部位53,54]。在基底膜基质基底细胞入侵检测进行了浓度的7.5和15μ克/毫升。EHX抑制入侵MCF-7明显在浓度。结果表明,EHX可能减弱MCF-7转移能力通过细胞迁移和入侵过程的抑制作用。根据Awad et al。6),植物甾醇等ß谷甾醇减少乳腺癌和胰腺癌细胞的生长和转移在SCID小鼠,这表明MCF-7迁移和入侵的抑制作用可能归因于甾醇类成分(豆甾醇和ß谷甾醇EHX)。

肿瘤可以静止,多年临床体内检测不到,但在某些情况下,癌细胞可以转向活跃阶段,开始增殖,转移,诱导血管生成。这个开关可能发生当人体的免疫系统被削弱或/和VEGF等刺激器(调节内皮细胞增殖)和整合蛋白(控制细胞迁移)大于抑制剂(55]。大鼠主动脉环试验被用来评估EHX的抗血管新生活动和结果显示与集成电路有效的抑制₅₀价值4.34±1.64μ克/毫升。血管生成的过程依赖于自由基的存在,有助于激活VEGF的表达。VEGF产量增加获得肿瘤缺氧地区缺乏足够的氧气,导致血管生成的激活过程。这个过程是由HIF-1规定α和HIF-1β二聚,把核导致激活的VEGF表达(56]。本研究的结果显示了在MCF-7细胞VEGF蛋白表达水平下降。的体外研究使用大鼠主动脉环还表明,EHX引起抑制新血管形成。所以,EHX的抗血管新生活动的差别可能获得的结果对这些VEGF表达。值得注意的是羽扇豆醇显示有效的抗血管新生属性在体外和在活的有机体内研究和抑制VEGF-A[的表达8),它可以在反血管增生EHX的活动。此外,氧化应激的有效作用在病理性血管生成与肿瘤被发现通过各种连接和研究,阐明氧化机制起着中介的作用释放信号的贡献在不同angiogenic-related反应(57]。答:披巾是一个植物富含酚类和黄酮类化合物,作为代理减少中和自由基(58]。在这项研究中,总酚类、类黄酮抗氧化活性测定,结果证明了强大的抗氧化性能。因此,抗血管新生活动可能是由于多酚的淬火能力出现在这种植物。

5。结论

这项研究表明,答:披巾分数(EHX)有一个在体外细胞毒性和proapoptotic效应对MCF-7乳腺癌细胞,可以抑制细胞殖民,迁移和入侵。EHX调节3通路(p53, TGF -β,NF-kβ)与抗肿瘤性质有关。此外,抗血管新生的活动答:披巾显示一个强有力的影响microblood船和它表达下调VEGF-A表达产物。总之,目前的研究揭示了有前途的抗癌和抗血管新生的活动答:披巾。因此,还需要进一步的研究来确定抗癌效果在动物模型。

数据可用性

在这项研究中使用的数据来支持我们的研究结果可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究支持的研究型大学团队(常规)授予1001号/ PFARMASI / 851001,埃曼Biodiscoveries, Natureceuticals Sdn Bhd .