秋葵豆荚提取物的抗氧化和肾保护作用(现esculentus乙酸铅对小鼠的毒性作用

摘要

在本研究中，我们确定秋葵荚(现esculentus乙酸铅对小鼠肾脏的毒性作用。n采用-正己烷、乙酸乙酯、甲醇等溶剂提取秋葵荚。采用DPPH法和FRAP法检测了提取物的抗氧化作用。甲醇提取物用于动物实验。将30只雄性BALB/c小鼠随机分为6组，分别为正常对照组、阴性对照组(铅诱导)和治疗组(铅诱导28 d，分别给予50、100、200、400 mg/kg BW甲醇提取物28 d)。分析各组抗氧化酶的活性，即超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT);氧化水平，即丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO);肾脏损伤指标，即血尿素氮(BUN)和肌酐(Cre)。肾脏组织病理学检查。结果表明，甲醇提取物的抗氧化活性(IC)最高₅₀是35.21µg/mL, FRAP为57.58µ米菲^{2 + /}g)。秋葵处理组CAT和SOD活性显著升高( ）.黄秋葵给药组MDA、NO、BUN和Cre水平显著降低( ）.秋葵组小鼠的上皮近端小管厚度、近端小管直径和近端小管坏死细胞百分率均降低，但肾小球鲍曼囊直径百分率与正常对照组一样得到最佳改善和修复( ）.本研究结果表明，甲醇提取物具有非常强烈的抗氧化效果，可以减少醋酸铅肾上腺肾癌诱导的毒性的影响。

1.介绍

铅是一种普遍存在的环境毒素，其在生物系统的几乎所有阶段都被检测到[1］．铅来源于汽车燃料的燃烧，进入土壤，并被植物吸收，所以食物可能是铅暴露的来源。铅也存在于旧水管、黄色水龙头和焊接管中，这些都会污染水源。一些研究人员认为水和管道系统中的铅会导致铅中毒[2，3.］．肾脏是铅毒性的靶点之一，是人体排泄的主要途径，并通过氧化应激和脂质过氧化(LP)促进肾脏损伤。急性铅中毒(血铅水平> 80-100μg/dL)破坏近端管状结构和功能[4］．

铅可能在氧化应激中起主要作用。有几项研究表明铅会引起氧化应激[5］．铅引起活性氧(ROS)的生成，降低了抗氧化酶的功能;例如，它降低了谷胱甘肽(GSH)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性[6，7］．50 mg/kg BW和100 mg/kg BW的醋酸铅暴露剂量可引起小鼠肝脏氧化应激并改变凋亡相关蛋白的表达[8］．醋酸铅可降低小鼠肾脏中SOD和CAT活性，增加LP [9］．丙二醛（MDA）的释放是LP的指标[10］．

到目前为止，一般都批准使用螯合剂治疗铅中毒[11］．使用天然抗氧化剂可能对治疗铅中毒有效。令人惊讶的是，它并没有得到密切的调查。一些已发表的研究发现，天然抗氧化剂在减轻动物体内铅引起的氧化应激方面具有重要作用[12］．在本研究中，我们主要研究秋葵豆荚提取物作为一种天然抗氧化剂。

秋葵，现esculentusL.是一种开花植物，因其果实可食而有价值，属于锦葵科，通常在不同国家作为营养增强剂食用[13］．据透露，秋葵果实和种子均含有黄酮类，多酚，儿茶素，槲皮素，原霉素和作为抗氧化剂的抗坏血酸[14- - - - - -16］．

本研究旨在探讨秋葵豆荚提取物对醋酸铅暴露小鼠的抗氧化和肾保护作用。采用2,2 -二苯基苦基肼(DPPH)法和铁还原抗氧化能力(FRAP)法测定秋葵提取物的体外抗氧化和肾保护作用。我们确定体内提取的效果通过测量NO和MDA水平,SOD和CAT酶活性,nephroprotective效应在肾损伤(面包和Cre),近端小管上皮的厚度,近端小管的直径,近端小管坏死细胞的比例,肾小球鲍曼囊直径比。

2.材料和方法

2．1．化学药品和试剂

n-正己烷和乙酸乙酯用于溶剂萃取，购自中国安徽Fulltime Chemical，甲醇购自Merck(德国达姆施塔特)。DPPH购自Sigma-Aldrich (MO, USA)。TPTZ(2,4,6 -三(2-吡啶)-s-三嗪)购自牛津实验室(印度马哈拉施特拉邦)。MDA检测试剂盒(Bioxytech®MDA-586)购自Oxis International, Inc. (Portland, OR, USA)。磺胺酸和N-(1-萘基)-乙二胺购自默克公司(德国达姆施塔特)，用于NO分析。SOD和CAT检测试剂盒购自BioAssay Systems (Hayward, USA)。包子FS的猫。No. 1 3101 99 10 021和FS猫肌酐。编号1 1711 99 100 021是从DiaSys购买的。肾脏组织学准备，我们使用中性缓冲福尔马林(10%)，石蜡，苏木精-伊红，乙醇(70%，80%，96%，绝对)，乙托酸，二甲苯和Entellan安装介质。

2.2。植物提取物

2018年1月，在印度尼西亚泗水的传统市场收集了秋葵豆荚，并由Airlangga大学科学与技术学院生物学系的植物学家Junairiah博士鉴定。秋葵荚被清洁，晒干，并使用机械研磨机粉碎。回流提取干粉约200克。在第一次提取中，我们使用n-己烷(3次，每次24 h)，收集各溶剂。用乙酸乙酯提取残渣(3次，每次24 h)，收集各溶剂。然后用甲醇提取3次(每次24 h)，收集各溶剂。这些溶剂用旋转蒸发器蒸发，然后冷冻干燥。因此，有三篇摘录(n-正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物及甲醇萃取物)[17］．

２.３.DPPH自由基清除试验

稳定的DPPH自由基清除活性n-正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、甲醇萃取物采用普列托法测定。各提取物分别以不同浓度(200、150、100、75、50、35、25、15、12.5、10、6.25、3.125)制备µg / mL)。100µ各浓度L与100混合µL 50µg / mL DPPH的解决方案。孵育30分钟后，在λ517 nm的UV/V是微板分光光度计(Thermo Scientific™Multiskan™GO)。DPPH, 50µg/mL，以DPPH为吸光度，甲醇为空白。每个浓度的提取液进行双重分析。自由基清除率按下列公式测定。

根据其标定曲线，抑菌浓度为50% (IC₅₀)的DPPH清除活性。

２.４.铁还原抗氧化能力(FRAP)测定

这种方法的原理是基于在抗氧化剂存在下将铁- tptz络合物还原为其黑色的有色形式。简单地说，FRAP试剂在醋酸缓冲液300 mM (pH 3.6)中制备，10 mM TPTZ溶液1体积，40 mM盐酸和20 mM氯化铁(FeCl) 1体积_3..6H₂O) (18］．100年整除µl将样品上清液与900混合 µL H蒸馏₂O和2ml FRAP试剂。在黑暗孵育30分钟后，用分光光度法测定反应混合物在593 nm处的吸光度。0.001 M硫酸亚铁(FeSO₄h·7₂O)作为标准溶液。最终结果表示为具有铁还原能力的抗氧化剂的浓度相当于0.001 M FeSO₄h·7₂O(用100-2000硫酸亚铁回归标准曲线µM)。每个浓度的提取物进行双重分析，结果表达在µ米菲^{2 + /}g (19］．

2．5．动物与实验设计

雄性BALB/c小鼠(8-10周龄，30-40 g)由印尼Airlangga大学药学院动物实验室提供。动物饲养在塑料制成的笼中，笼盖由编织铁丝制成，温度为20°C，光照12°h /黑暗12°h循环，自由喂食和饮水。所有涉及动物护理的程序都由印度尼西亚Airlangga大学兽医学院动物护理和使用委员会(ACUC)批准。714 -柯。在所有实验之前，小鼠首先适应实验住房条件和动物饲养员7天，以最大限度地减少测试期间的处理压力。小鼠随机分为六组(KN:正常控制，无需任何治疗;K−:阴性对照:醋酸铅75 mg/kg BW不加甲醇提取物;P1，P2，P3,P4:甲醇提取物剂量分别为50、100、200、400 mg/kg BW)。此外，小鼠口服醋酸铅28天(K -，P1，P2，P3,P4)第29天，小鼠口服甲醇提取物28天(P1，P2，P3,P4)。KN对照组小鼠只给予溶剂，即水溶。最后一次处理后24 h采血。血液在室温下凝固，以3000转/分离心10分钟获得血清，用于分析。

2.6。草皮和猫活动测定

用酶染色法测定血清SOD活性^TM超氧化物歧化酶检测试剂盒(sod -100)来自BioAssay System (Hayward, USA)。吸光度在λ血清CAT活性测定采用酶标仪(enzyme chrom)^TM过氧化氢酶检测试剂盒(ECAT-100)来自BioAssay System (Hayward, USA)。吸光度在λ采用570 nm微孔板紫外/可见分光光度计。

2.7。测定MDA和NO水平

根据制造商的协议使用BioxyTech MDA-586分光光度法测定试剂盒分析MDA血清样品的水平。简而言之，在涡旋管中混合血清样品，丙醇和稀释的R1。将混合物加入R 2中，并在45℃下孵育40分钟。离心管（10,000g，10分钟），并测量上清液λ采用586 nm微孔板紫外/可见分光光度计。测定NO浓度时，稳定的NO转化产物亚硝酸盐(NO₂)，用Griess试剂测定[17］．对于NO分析，我们使用Griess系统协议。简单地说,50µ在1.5 mL微管中制备血清。100年µL Griess试剂I(2.5%磷酸中的磺胺酸)和100µ血清中加入L Griess试剂II (N-(1-萘基)-乙二胺(2.5%磷酸)。室温孵育10-15分钟后，在540 nm处读取光密度值。将光密度值放入标准亚硝酸盐回归方程后，即可得到一氧化氮浓度(M)。

2.8。测定尿素氮和Cre水平

采用DiaSys的尿素FS试剂盒和肌酐FS试剂盒，按照制造商的方案分析血清中尿素氮(BUN)水平。用紫外/可见分光光度计在340 nm处测定BUN水平和492 nm处测定Cre水平的吸光度。

2.9。组织病理学研究

离体肾用生理盐水洗涤，10%生理盐水固定，酒精分级脱水，石蜡包埋。切片厚度为4µm.苏木精伊红(H&E)染色。在光学显微镜下观察切片视野。测量上皮细胞近端小管厚度、近端小管直径、近端小管坏死细胞百分比、肾小球-鲍曼囊直径比。

2.10。统计分析

统计资料分析采用单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Duncan事后检验。所有分析均使用IBM SPSS Statistics 24软件进行。结果以5次重复的平均值±标准差(M±SD)表示。被认为具有统计学意义。

3.结果与讨论

3．1.抗氧化活性

各样品对自由基的清除活性见表1．DPPH自由基溶解于甲醇中，在λ517海里。当自由基被抗氧化剂清除后，DPPH的颜色由紫色变为黄色。甲醇提取物的抗氧化活性最高₅₀值约35.21µg/mL，乙酸乙酯和n-己烷提取物的抗氧化活性最低₅₀值为181.09和104.06µ克/毫升。FRAP分析可以对还原能力和抗氧化能力进行排序。还原铁的能力最高^{3 +}对菲²在甲醇提取物中发现+ (57.58µ米菲^{2 + /}G）。这意味着甲醇提取物具有较强的减少功率n己烷提取物(57.13µ米菲^{2 + /}G)和乙酸乙酯提取物(49.64µ米菲^{2 + /}G）。

植物提取物对DPPH自由基的清除活性已被广泛用于测定植物提取物的抗氧化活性[20.］．样品与集成电路₅₀低于50µg/mL可归类为非常强的抗氧化剂，50-100µg/mL as strong, 101-150µg/mL，并大于150µg/mL为弱[21］．DPPH测定结果表明，甲醇提取物具有最低的IC₅₀值(35.21µg/mL)，甲醇能溶解槲皮素、儿茶素和维生素等主要活性物质，具有较强的自由基清除活性和抗氧化活性n-正己烷提取物抗氧化活性中等，乙酸乙酯提取物抗氧化活性较弱。本研究中秋葵豆荚的DPPH值优于加纳一项研究报道的秋葵种子。样品注入的IC50值范围为127.800 ~ 405.667μ克/毫升。未脱脂样本的范围在239.750到637.000之间μg/ml，脱脂样品的IC50值为28.714 ~ 338.333μ克/毫升(22］．

在做FRAP测试时也会发生同样的事情。秋葵籽醇提物和乙酸乙酯提物中黄酮类化合物含量分别为2.3328±0.008和3.9082±0.01 mg槲皮素当量/g植物物质。这两种提取物也存在于芦丁中[23］．乙醇提取物中含有多酚、黄酮类化合物、总多糖和异槲皮素，而在乙醇提取物中未发现这四种物质n己烷提取(24］．我的另一项研究表明，秋葵豆荚甲醇提取物中总酚含量为12.92 mg没食子酸当量(GAE)/g植物物质，黄酮含量为5.68 mg槲皮素当量/g植物物质[25］．甲醇提取物具有较高的还原铁的能力^{3 +}对菲^2＋．根据DPPH和FRAP检测结果，用不同浓度(50、100、200和400 mg/kg BW)的甲醇提取物处理实验动物。

该研究还表明，甲醇秋葵豆荚提取含铅乙酸铅诱导的小鼠抗氧化活性。在体内抗氧化活性测定中的甲醇秋葵提取物中，我们使用实验动物确定由醋酸铅引起的肾毒性。根据Xu等人选择暴露于醋酸铅75mg / kg bw的剂量。［8］．毒性指标可从抗氧化酶(SOD和CAT)活性、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)水平、肾脏生化指标(BUN和Cre水平)以及肾脏组织病理学指标等方面进行测定。

3.2。秋葵豆荚对SOD和猫活动的影响

SOD和CAT活性如图所示1．除组外，秋葵豆荚甲醇提取物可恢复正常SOD活性P2，其给予甲醇萃取秋葵豆腐豆荚为100mg / kg bw。SOD活动P2显著高于正常和阴性对照( ），而阴性对照组的CAT活性明显低于正常对照组( ）.在组中kead豆荚的甲醇提取物给药P1，P3,P4 .一直无法恢复正常的CAT活性( ），而以100 mg/kg BW剂量添加秋葵提取物能正常提高和改善CAT活性。

铅可能是SOD酶的抑制剂，导致两种SOD活性的降低[26]及CAT [27］．与预期相反，本研究显示，铅处理组的SOD活性没有显著升高。这一结果与Vaziri的结果相同[20.］．一种可能的解释是铅的剂量很低。超氧化物可能是增强SOD活性的因素。根据Ercal等人[17，铅导致超氧化物和其他活性氧化合物的增加。而甲醇秋葵提取物可显著改善SOD活性，高于正常水平。这种提取物中的抗氧化化合物可能减少了超氧化物。另一结果是，铅处理组CAT活性降低。这一结果可能与铅作为CAT和H的抑制剂有关₂O₂．甲醇秋葵提取物处理不能使CAT活性恢复到正常水平，但与铅处理组相比，100 mg/kg BW甲醇秋葵提取物处理可提高CAT活性。如文献所述，槲皮素等黄酮类化合物灭活活性氧的生成，终止自由基链反应[18］．

３．３．秋葵豆荚甲醇提取物对NO水平的影响

NO水平实验数据的结果如图所示2．用亚硝酸盐(NO₂)水平，在酸性条件下直接与磺胺反应，与N-(1-萘基)乙二胺重氮反应后显现。从图2，可见阴性对照组(K−组)NO水平较正常对照组明显升高( ）.甲醇秋葵豆荚提取物可使NO水平恢复正常。甲醇秋葵豆荚提取物处理组间无显著差异( ）.

本研究结果显示，各处理组NO水平均显著低于阴性对照组。这一结果与Barbosa等人的结果相似，Barbosa等人表示，几种植物作为抗氧化剂对细胞内NO的产生具有很强的抑制活性[28］．在研究中，铅处理小鼠血浆中亚硝酸盐浓度高于正常水平。它反映了NO合酶的活性[29，30.］．铅暴露可显著改善内皮NO生成[8］．硝酸可以直接或与超氧化物作用后对蛋白质、脂质和脱氧核糖核酸(DNA)造成损害[31］．用秋葵豆荚甲醇提取物处理后，NO水平降低，恢复正常。

3.4。秋葵豆荚对MDA水平的影响

数字3.给出了MDA水平分析的结果。丙二醛作为细胞应激氧化标志物表现为LP。从图中可以看出3.铅处理组MDA水平最高(129.36±19.2)μM)，较正常显著增加72% ( ）.各治疗组MDA水平均显著低于阴性对照组( ）.这两个P3和P4组与正常组具有相同的MDA水平（ ），但这并不适用于两者P1,P2组。的P1组用秋葵甲醇提取物50 mg/kg BW处理后，NO水平无法恢复正常。然而,在集团P2、MDA水平较正常对照组明显降低。

众所周知，铅可以通过增强LP而对细胞产生氧化损伤。铅通过刺激活性氧的产生而引起氧化应激。活性氧攻击含碳碳双键的脂类，特别是多不饱和脂肪酸[32］．丙二醛是LP产生的一种主要的活性醛，已成为广泛接受的生物标志物[9］．本研究提示，铅给药可使血清丙二醛水平较正常水平显著升高72%。同时，给药秋葵甲醇提取物可显著降低MDA水平。Liu等人的一项研究也表明槲皮素可以降低铅处理大鼠肝脏中的LP [33］．槲皮素是黄芪豆荚提取物中的一种抗氧化化合物一个．esculentus［34，35］．其他研究表明，秋葵水果和种子的提取物含有槲皮素[36］．槲皮素的抗氧化和金属螯合性能取决于其化学结构中的多个羟基[37］．这些羟基和羧基通过提供电子来稳定自由基[38］．

3．5．秋葵醇提物对尿素氮和肌酐水平的影响

本研究生化参数实验数据的结果是测定BUN和肌酐水平。秋葵豆荚甲醇提取物可显著降低小鼠血清尿素氮水平P1，P2,P3组与肌酸酐水平P4组( ）.BUN和Cre水平如图所示4．

肾脏结构的细胞损伤可导致肾功能下降。血尿素氮和Cre水平是肾功能的生化指标。在醋酸铅治疗组中发现高水平的尿素氮和肌酐。这种结果是由肾脏损伤引起的。这与Sudjarwo等人的结果相似[39报告乙酸铅治疗可显著诱导血清尿素氮和肌酐水平升高。结果表明，甲醇提取物对醋酸铅具有肾保护作用，50、100、200和400 mg/kg BW处理可降低BUN和Cre水平。

3.6。秋葵醇提物对肾毒性肾的影响

给予蒸馏水(正常对照组)小鼠肾组织组织病理学检查显示正常肾病组织。与对照组小鼠相比(KN)，醋酸铅诱导小鼠(K-)肾脏切片显示肿胀和坏死细胞。用秋葵豆荚的甲醇提取物处理(P1，P2，P3,P4)显示肾脏已愈合，细胞损伤程度较轻(图5）.在生化观察的同时，组织病理学研究表明肾脏结构有所改善。这些结果与实验小鼠肾脏组织的组织病理学结果一致。此外，在近端小管和肾小球-鲍曼胶囊中进一步观察肾脏组织，以衡量肾脏的肾毒性程度。

图中还显示了上皮的厚度、近端小管的直径和坏死细胞以及肾小球- bowman包膜的直径比6．肾小球滤过的改变对鲍曼囊的动力学和功能有很大的影响。鲍曼囊容积已被广泛研究以维持正常肾功能[40］．我们使用形态计量学方法分析鲍曼胶囊的直径，并调查正常肾功能的相关因素。在细胞中，近端小管更容易受到铅诱导的细胞损伤，其次是细胞凋亡[4］．近端管肥大可以是对肾脏数量的稳态反应，因为最大管状尺寸受到产生低足够抗性的尺寸（腔直径和管状长度）的限制，以允许管状流体足以获得足够的重吸收的管状流动[41］．

可以看出，与正常对照相比，阴管中近端小管的上皮细胞的上皮厚度和直径和百分比显着增加（ ）.此外，肾小球蝴蝶结胶囊的阴性对照胶囊的直径比显着降低（ ）.秋葵豆荚的甲醇提取物的给药显着降低了P4基团上皮近端小管的厚度。秋葵还显着降低了近端小管的直径和两者中坏细胞的百分比P3和P4组。肾小球直径-鲍曼囊直径比显著增加P1，P2，P3,P4组。

应激氧化可通过质膜中的LP、通过铅与氨基酸巯基介质结合的蛋白质修饰和DNA突变引起细胞损伤[42- - - - - -44］．高级铅暴露的潜在影响之一是肾损伤和肾病。较低血浆水平的延长铅暴露会导致肾毒性。诱导肾损伤中受影响最大的肾细胞是近端小管[45］．由此可知，醋酸铅治疗后，上皮厚度、近端小管坏死细胞的直径和百分比均显著增加，但肾小球鲍曼囊直径比例显著降低。Rana等报道Pb阻碍了细胞连接(紧密连接)的完整性，改变了细胞结构。上皮细胞极性和载体转运的改变可能是由于肾近端小管腔减少和微绒毛缺失导致的非典型细胞-细胞连接结构[4］．

上皮厚度与近端小管直径成正比。上皮厚度和近端小管直径的增强是由于细胞肿胀引起的，这是细胞环境的改变或细胞适应修复损伤的一种方式。显微镜下，细胞损伤导致细胞肿胀，有时接着是细胞器受压或移位[46］．坏死细胞百分比显示细胞已受损。醋酸铅中毒后，细胞坏死率明显增加。此外，提取秋葵豆荚的甲醇可以通过其抗氧化活性修复这些细胞的损伤。结果表明，甲醇提取物可减少细胞损伤，在50 mg/kg BW剂量下，近端小管上皮厚度、坏死细胞直径和坏死细胞百分比均有显著降低，在200 mg/kg BW和400 mg/kg BW剂量下效果最佳。Kotyk等人报道，与对照组相比，添加果糖的大鼠肾小球直径增加[47］．此外，秋葵豆荚甲醇提取物具有增强免疫系统的作用，100 mg/kg BW剂量可提高NK细胞活性和IFN-γ水平[48］．因此，许多免疫细胞，如巨噬细胞和中性粒细胞增加，以修复和清除细胞碎片。200和400毫克/公斤体重是修复到正常水平的剂量。

4.结论

我们得出结论，秋葵豆荚的甲醇提取物可以通过增加草皮和猫水平和MDA，NO，BUN和CRE水平降低的含铅毒性。Okra Pods成功地刺激了肾上腺近端小管的厚度的组织学，近端小管的直径，坏死细胞的百分比，以及肾小球弓曼胶囊的比例朝向正常。秋葵对小鼠醋酸铅铅的毒性有肾红外药物潜力。这表明秋葵豆荚的甲醇提取物具有抗氧化活性，并对铅诱导的毒性作出保护作用。

缩写

DPPH:	2, 2-Diphenyl-picrylhydrazyl
收紧:	铁还原抗氧化能力
SOD:	超氧化物歧化酶
猫:	过氧化氢酶
MDA:	丙二醛
没有:	一氧化氮
小圆面包：	血尿素氮
Cre:	肌酐。

数据可用性

本研究产生的所有数据都包含在文章中。

伦理批准

印度尼西亚Airlangga大学兽医学院动物护理和使用委员会(ACUC)获得了伦理批准。714 -柯。

的利益冲突

提交人声明有关本文的出版物没有利益冲突。

致谢

这项研究由一项基金资助(no。122/SP2H/PTNBH/DRPM/2018)来自印度尼西亚研究和高等教育部。

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