文摘
刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生虫与世界范围内的分布。猫科动物的主机支持的完整生命周期弓形虫。然而,其他温血动物如啮齿动物和人类也可以被感染。这样的二次感染宿主导致长期感染表现为组织的存在囊肿在大脑和其他器官。而众所周知,弓形虫啮齿动物感染与行为变化有关,这些变化背后的机制尚不清楚。宿主肠道微生物区系的变化被认为是一位杰出的角色球员在塑造主持人的行为和认知。它已经表明,急性弓形虫感染的老鼠导致微生物群落变化由于胃肠道炎症在纯系小鼠模型。慢性的长期影响弓形虫然而,感染微生物群落是未知的。在这项研究中,我们使用我们的模型验证后测量微生物区系变化弓形体病急性发作期间,我们评估了微生物变化发生在一个长期的感染;然后我们进一步调查这些变化在慢性感染的后续研究。这些分析是由构造和DNA测序16 s rRNA扩增子库从小肠粪标本。我们发现,急性感染的GT1应变弓形虫引起了浓缩的拟杆菌门控制CD1小鼠。引人注目的是,这浓缩维持在长期的慢性感染。这个变更的潜在生物学后果在啮齿类动物和人类应该受到进一步的探索。
1。介绍
刚地弓形虫(弓形虫)是一种常见的食源性和水源性门Apicomplexa的寄生虫。这种生物被发现感染温血动物,包括人类[1,2]。急性感染后,这通常是无症状的宿主免疫能力,弓形虫进入一段长期感染的特点是改变了寄生虫代谢和组织囊肿的形成,很大程度上是在大脑和肌肉3]。慢性感染与啮齿动物行为变化有关,与受感染啮齿类动物显示多动症和捕食者意识下降4- - - - - -6]。在人类中,弓形虫血清阳性与行为变化(7,8],精神分裂症的发病率[9- - - - - -11,交通事故12,13),和自杀企图10,14,15]。提出了几种机制弓形虫介导的行为变化,包括改变神经递质水平(4,16- - - - - -18)和免疫激活(19]。然而,因果机制仍然需要解决。
微生物区系变化越来越被认为是一个潜在的塑造主持人的行为和认知的机制。最近的研究表明,老鼠的行为可以影响肠道微生物的变化(20.- - - - - -25]。据报道,与其他寄生虫,感染等鞭虫缪里斯会导致焦虑行为的变化,可以通过治疗规范化益生菌菌株,双歧杆菌longum(26]。这些研究表明,改变肠道微生物区系中应考虑弓形虫感染。而急性弓形虫感染已被用作一个工具来诱导小鼠炎症性肠病与预期的微生物变化(27),的长期后果弓形虫感染肠道微生物区系是未知的。因此,使用后的适应小鼠模型验证了测量微生物区系的变化弓形体病急性发作期间,发生在长期感染的微生物变化评估;那么慢性感染的效果弓形虫肠道微生物的研究在一个更大的独立的队列。
2。方法
2.1。老鼠感染
所有的实验协议,包括弓形虫感染和麻醉,经动物保健和使用委员会约翰霍普金斯大学。我们测试了两组小鼠评估上面的肠道微生物变化。第一批20远系繁殖CD1小鼠用于验证使用我们适应小鼠模型的测量中微生物区系的变化弓形虫感染。的小鼠急性集团组成5小鼠腹腔内感染与500年(IP)弓形虫个应变GT1,磷酸缓冲盐(PBS),年龄在6 - 8周后到达为期3天的适应时期。5控制同龄的小鼠注射PBS的IP路由。所有5感染小鼠被安置在一起,当所有的5未受感染的老鼠被安置在单独的笼子里。急性组牺牲在5天postinfection (dpi)。10的老鼠组成第一个慢性组,500被感染IP与GT1个在PBS年龄的6 - 8周后为期3天的适应时期。5控制同龄的小鼠注射PBS的IP路由。慢性感染和未感染组,每组3 5老鼠的单独被安置,而其余2从每组小鼠pair-housed。慢性组牺牲在5个月postinfection行为测试完成。小鼠慢性组(包括控制和感染组)服用磺胺嘧啶钠(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)在水从5天30 postinfection控制急性感染高度致命的GT1应变,确保生存。总共有62 CD1小鼠慢性队列(由后续第二2817],这群主要包括控制和45 GT1感染小鼠如上所述第一慢性队列。
小鼠麻醉和人道地牺牲了。腹腔内被割开,肠子被展开,使用标识的远端空肠和回肠具有里程碑意义的回盲瓣。粪便内容(内容jejunal-ileal粪便,JIFC)从上述地区轻轻挤出,然后肠PBS得脸都红了。材料包含JIFC收集到一个微型离心机管和保存在冰。之前冻结在−80°C,颗粒和上层清液离心分离的10000 rpm为5分钟。
此外,血和脾从每个鼠标得到评估感染的状态在第一组。在急性感染证实组的测量弓形虫5 s rRNA脾脏通过定量PCR反应基于3独立化验,使用100 ng /μl脾脏DNA从每个样本为每个反应(TaqMan®基因表达分析,生活技术,卡尔斯巴德,CA)。所有可用的脾脏组织均质避免抽样误差,和匀浆处理DNA隔离使用该款超净组织和细胞DNA隔离设备(该款,12334 - 250,卡尔斯巴德,CA)。慢性组、感染免疫球蛋白抗体的被测量记录弓形虫完整的细胞生物制造的协议(Vir-ELISA Anti-Toxo装备,VIRO-Immun Labor-Diagnostika GmbH,德国,如127)(表S2)。在第二个慢性队列,评估感染的状态弓形虫完整的细胞生物、免疫球蛋白和MAG1免疫球蛋白检测运行如前所述[28)(表S8)。
2.2。图书馆准备
基因组DNA提取从JIFC商用DNA隔离设备(QIAmp DNA凳子迷你包,猫# 51504,试剂盒,Venlo, Netherlands-acute组;ZR粪便DNA迷你预科,猫# D6010 Zymo,欧文CA-chronic集团)。核酸的质量和数量是由TapeStation(安捷伦科技,圣克拉拉,CA)生物分析仪。整个细菌16 s rDNA (1.5 Kb)放大使用20 ng输入DNA在每个PCR反应,利用修改的协议,这是基于先前描述的方法(29日]。1.5 kb扩增子被离心从琼脂糖凝胶中提取DNA是剪到200 - 300个基点的片段使用Bioruptor (Covaris沃本,MA)通过应用先前确定的最小周期数(10 - 12周期)。二十个人索引库准备后,制造商的指示(TruSeq芯片工具包,猫# ip - 202 - 1012, Illumina公司,圣地亚哥,CA)。每个库是量化使用SYBR green-based KAPA Illumina公司图书馆量化工具(KAPA生物系统,马威尔明顿),和浓度归一化到4海里。
评估细菌组成的老鼠在第二慢性队列,JIFC是同样来自小肠16 s rRNA基因测序。控制环境污染物,空白和图书馆准备控制样本还包括在图书馆准备和测序的过程。基因组DNA被隔离受感染和未感染的动物,使用Zymo ZR粪便迷你工具包。单独索引库准备针对v3-v4地区16 s rRNA基因使用标准的Illumina公司16 s宏基因组准备指南。每个库浓度决定利用量子位规范化4海里。
一个5μl整除每个库的汇集和变性使用0.2 N氢氧化钠,随后稀释10点使用HT1(杂交缓冲)提供的Illumina公司(CA)圣地亚哥。在装载之前,图书馆20 pM PhiX控制飙升了10%。测序进行MiSeq Illumina公司测序平台使用2×300 PE测序试剂盒(猫# - 102 - 3003 Illumina公司女士,圣地亚哥,CA)。
2.2.1。序列分析与QIIME 1
生paired-end读取第一次去复用使用5′索引信息,适配器序列的修剪,筛查PhiX174污染序列。结合paired-end读取闪存命令行工具(http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)是利用(30.]。使用定量见解微生物生态学(QIIME)包(v.1.8.0) [31日,32),读取被削减后序列位于过滤质量连续5劣质基地调用(phr得分< 20)和要求最终削减序列的长度至少150个基点。
最大化每个样本测序深度,针对V3-V5序列分析是由第一个筛查读取与v3 (357 f)在一个核苷酸引物序列不匹配。读取匹配的引物在60英国石油(bp) 5′末端修剪底漆匹配的结束。由此产生的高品质阅读设置然后用UCHIME嵌合筛查序列(新创模式)(33),以及叶绿体和线粒体DNA使用核糖体数据库项目分类器(34]。最后BLASTN搜索进行针对绿色煤电16 s数据库(v13_5)来识别污染物。没有数据库序列匹配的至少70%的身份至少50%的长度从下游加工。
剩余序列被聚集到操作分类单元(辣子鸡)使用UCLUST [35标识阈值为95%。代表序列的每个集群(反映最丰富的序列)是分配给一个由核糖体数据库项目分类谱系分类器(34),对准一个定制版本的全面席尔瓦16 s数据库(36使用最小信任阈值为0.50)。
代表序列输入PyNAST [37)来生成一个多重序列比对,随后被用来构造一个neighbor-joining系统树与FastTree [38]。下游统计分析之前,样本稀薄(39)获得甚至覆盖。α和β多样性指标在QIIME计算。额外的统计分析R(v.3.0.0)。测试不同的丰富的类群,由于小样本大小,采用负二项测试中实现DESeq包(40),而微分α测试利用韦尔奇的多样性t以及。的值被认为是表示组间显著差异和价值来表示一个暗示的区别。问值是价值观,纠正多个性能的比较采用错误发现率(罗斯福)调整。
2.2.2。序列分析与QIIME 2
生paired-end读取第一次去复用使用5′索引信息,和适配器序列访问之前被剪掉了。R1和R2分别读取分析使用QIIME 2 (2017.12 v)平台(41保存序列信息,会被丢弃,由于贫穷R1和R2读取之间的重叠。除了过滤掉任何剩余PhiX污染物和嵌合序列,DADA-q2插件(42)是用来消除低质量的读取。在这个过程中,R1和R2读取被截断(QS 28) 158个基点和133个基点(QS 32)高质量的阅读长度,分别。因为过滤质量R1读取略长,R1分析都集中在这个报告中。独特的序列都收集到一个功能表,这对任何潜在的污染物被过滤,放大在空白的DNA提取样本( )使用feature-table q2和low-abundance功能插件(43]。接下来,多重序列比对是由雇佣MAFFT对齐插件(44]其次是计算系统发育树使用FastTree程序(45]。系统发育多样性分析利用这个系统发育树为了计算几个α和β多样性指标。
探讨细菌样品的组成,分类被分配到序列使用pretrained朴素贝叶斯分类器和q2-feature-classifier插件(https://github.com/qiime2/q2-feature-classifier)。这个分类器训练绿色煤电v13_8 99%辣子鸡,序列一直在削减仅包括16 s rRNA v3-v4区域的基因受Illumina公司引物配对。微分丰富评估利用安共体插件(46],W-statistic为每个分类单元计算一个值,它描述了一个分类单元的分类单元测试是对明显不同。W-statistic的结果是得出在假设检验中,零假设的对比组之间没有显著差异在每一个分类单元。统计分析,QIIME 2内置包。可视化生成使用ms excel和QIIME 2视图。
3所示。结果
3.1。急性弓形虫(GT1株)感染改变CD1小鼠肠道微生物组
定义的多样性和严重感染小鼠肠道微生物区系的组成、16 s rDNA库,来源于小肠JIFC 5感染的标本和5未感染控制老鼠,被测序。序列分析利用定量了解微生物生态学(QIIME)管道关注v3-v4地区。后的质量和内容(嵌合序列、线粒体和叶绿体)筛查(表S1),共计193593读取从10急性组的小鼠,获得5的感染弓形虫和5的控制。正常化后和稀疏,平均每个序列的集合有6116读/鼠标。
分类学上,确定了以下六个细菌类群:厚壁菌门,拟杆菌,变形菌门,Verrucomicrobia,放线菌,Deferribacteres。厚壁菌门是最丰富的门。拟杆菌门是唯一一门显示急性相关的重大变化弓形虫感染,这个门的患病率显著增加受感染动物(表1、表S3)。在物种水平高的个体差异之间的物种丰富度被发现老鼠。没有一个单一的物种,不断丰富的控制或受感染的组织。相反,每个鼠标有自己的古怪的物种组成。由于急性感染,这些改变物种充分体现在感染和未感染组。急性感染组,芽胞杆菌科物种出现特别是高度可变,在急性感染组,乳酸杆菌、变形杆菌、拟杆菌属不详似乎是易变的(图1、表S5)。
(一)
(b)
3.2。慢性弓形虫感染改变肠道微生物的多样性
3.2.1之上。第一个慢性组
定义的多样性和慢性感染小鼠肠道微生物区系的组成、16 s rDNA库,来源于小肠JIFC 5感染的标本和5未受感染的老鼠测序。序列分析利用QIIME管道关注v3-v4地区。遵循质量和内容筛选(表S1),总共有345050个有效读取获得的小鼠慢性感染弓形虫和相应的控制。正常化后和稀疏,平均每个样本由25887读/动物。
最丰富的门是厚壁菌门。额外的4门发现了包括变形菌门、拟杆菌、放线菌和Verrucomicrobia。的相对丰度Verrucomicrobia门显著增加( , )在动物慢性弓形虫感染。也有增加的趋势水平的拟杆菌( , )。没有门,显著降低慢性感染动物与控制(表1;表S4)。有趣的是,物种水平分析显示随机物种只有似乎是慢性感染组的微生物区系的一部分,而慢性感染组发现缺乏这些随机的物种。大多数的这些古怪的物种在慢性感染组属于梭菌的顺序,而最变量,乳酸菌jhonsonii,属于Lactobacillales的顺序(图2;表S6)。
(一)
(b)
估计样本组内物种丰富度,α多样性利用香农指数和计算操作的数量分类单元(OTU)。香农指数是一种常用的多样性指数同时考虑物种相对多度在社区和人口平衡。OTU被定义为一群读有95%相似,用于分类与期望,这些微生物辣子鸡相当于物种。
在图3α多样性计算通过绘制OTU的香农指数和平均数量,这表明α多样性是慢性感染组(大 ,韦尔奇的T以及)与相应的控制。然而,α多样性的强烈感染控制的老鼠没有什么区别。估计在社区里,不同加权UniFrac距离计算(图4)。主要协调情节描绘在图4、控制集群相互接近而感染样本被广泛传播。成对Permanova测试显示控制之间的显著差异和感染小鼠的慢性组( , )。
(一)
(b)
3.2.2。第二个慢性组
介绍了第二批确认上面的肠道微生物区系的变化较小的远系繁殖群慢性感染的老鼠。62 CD1小鼠45被感染了刚地弓形虫GT1应变,而17注射PBS的IP路由。使用升级QIIME 2管道序列处理。去噪和内容过滤后,总共有458793个有效读取获得的小鼠慢性感染弓形虫和控制老鼠的平均频率7399读/鼠标。稀薄的后续分析样本集,每个样本含有2016读取(表S7)。
社区丰富,以四种不同的α多样性指标(观察到的物种,香农的,信仰的系统发育多样性,和Pileou的均匀度指数),相当之间的控制和受感染的老鼠 , , ,和 ,分别;克鲁斯卡尔-沃利斯成对测试)。然而,社区组成明显不同控制和受感染的老鼠 , ; , ; , ; ,和 ;成对Permanova测试)来衡量所有的四个β多样性指标(Jaccard距离,Bray-Curtis距离,未加权的UniFrac距离,和加权UniFrac距离,分别)(图5)。β多样性结果验证了安共体分析表明两个明显不同的类群之间的控制和被感染的老鼠(W-test,拒绝零假设)Lactobacillales和细菌性的。
寄生虫囊肿丰富大脑中由免疫球蛋白水平,针对反映弓形虫表面抗原,MAG1 [28,47]。分解后感染组MAG1-HIGH ( )和MAG1-LOW ( )子组(表S8),β多样性分析显示离散集群中的两个子组之间两个定性社区不同指标,Jaccard距离,未加权的UniFrac距离(图5、表2)。然而,安共体分析没有突出任何特定类群,将负责这一趋势。个体变异在门级描述图6(表S9)。
4所示。讨论
在这项研究中,我们检查了如果有细菌群落的差异采用小鼠模型中的宿主小肠急性和慢性弓形虫感染和进一步研究肠道微生物的变化在一个更大的研究与长期感染的老鼠。急性队列的结果复制他人的的增加Bacteriodetes牺牲的丰度减少壁厚菌门的丰度。在慢性感染模型中,微生物模式发现,都是不同的,类似于急性感染。最值得注意的是,慢性感染也是强烈的特征是一个浓缩的拟杆菌门下降为代价的丰富的厚壁菌门(乳酸杆菌)。此外,社区不同的评估显示,上层肠道细菌社区集群与寄生虫囊肿丰度有关。总的来说,我们的调查代表了初始调查肠道微生物组的复杂性,介绍了许多新颖的工具来进一步研究弓形虫感染影响肠道微生物动力学。
而急性弓形虫侵染诱导微生物变化特征在纯系小鼠,到目前为止,这是第一份研究肠道微生物区系的变化远系小鼠长期弓形虫感染。在这里,我们建立了一个模型,该模型可以作为一个工具来阐明潜在的眼弓形体病潜在机制和脑炎在免疫功能低下的患者由1型弓形虫感染引起的常见在美国和巴西。与许多其他老鼠的研究,介绍了减少人工模型,远系繁殖基因更多样的鼠标应变(CD1)感染更具毒性1型的弓形虫(GT1)尚未适应实验室环境,探索潜在的微生物区系的变化和行为(28]。此外,在我们的实验设计中,IP路由被用于感染为了避免口头管理寄生虫的不利影响肠道上皮细胞,利用同样的路线交付最常用的行为实验。小肠被选为分析小肠就是因为大多数host-microbiome交互发生的48]。细菌v3-v5地区16 s rDNA也专注于因为这部分提供了最准确的描述范围广泛的宿主细菌的49]。这适应模型验证了研究的影响严重弓形虫感染肠道微生物区系发现之前。
我们的研究结果与以前公布的这个模型是一致的急性感染的结果弓形虫。几项研究已经检查口腔感染(填喂法)的影响弓形虫在纯系小鼠的肠道微生物组。所有这些研究采用口服Me49应变的C57BL / 6小鼠和特征微生物组在急性感染(50- - - - - -54]。之前的研究表明,在严重弓形虫感染,三个主要微生物类群的影响:厚壁菌门,变形菌门和拟杆菌门。严重的影响弓形虫远系繁殖感染微生物的观察到在这项研究中使用老鼠类似报道的影响与其他模型中增加数量的拟杆菌(50- - - - - -54)和减少壁厚菌门(51,52,54被确定。这些相似之处表明,这些门急性感染后可能发生的变化,尽管不同的感染弓形虫应变、感染的路线或主机鼠标应变。然而,增加肠杆菌科(变形菌门)没有发现在这项研究中,但在其他已报告的急性模型弓形虫感染(51- - - - - -54]。这些差异可能是由于不同的感染途径,不同品系小鼠(55),或不同类型的弓形虫菌株在不同实验模型。
急性感染的决议后,弓形虫可以建立慢性感染的特点是组织在大脑和其他器官囊肿,以及改变行为和降低认知功能水平(28]。先前发表的研究中,我们所知,没有研究慢性的影响弓形虫在微生物感染。因此,慢性感染小鼠的小肠微生物群落是评估在同年龄组在两个独立的实验。引人注目的是,显著差异被发现在慢性感染小鼠的微生物区系,甚至postinfection 5个月后,相比于控制老鼠。类似于严重感染组,最突出的差异被发现在拟杆菌门,大大丰富了在慢性感染的动物在第二组表现出增加的趋势在第一组。
显著增加物种多样性观察慢性感染组相比,第一组的控制;然而,这些差异没有发现第二组。这可能是长度较短的阅读的结果,因为只有读取从一端考虑在内,从而影响物种水平鉴定的准确性(34,56]。相反,在急性感染模型中,与以前的结果(50,51),这种差异并没有检测到的物种丰富度。这可能是由于不同的感染途径,鼠标菌株(55),或类型的弓形虫菌株在不同的实验模型。
β多样性分析显示显著差异在社区之间组成两组小鼠慢性感染和控制。此外,安共体分析表明,两个明显不同的类群之间的控制与被感染的老鼠Lactobacillales和细菌性的第二组。MAG1集中在受感染动物的血液与囊肿(丰度28]。观察囊肿是否丰富显示任何关联与某些细菌类群,感染组分解MAG1-HIGH和MAG1-LOW子组和β多样性分析在同一慢性感染人群。两个定性社区不同指标,丰富不考虑,显示显著不同的集群之间的两个子组。然而,这些不同的集群没有与任何特定类群安共体分析的基础上,可以统计力量的造成的损失由于感染组分解成子组。
行为和认知功能是直接以老鼠为微生物组成进行分析研究(28]。之前的研究在小鼠模型表明,改变肠道微生物与行为和认知功能的变化。很多研究都集中在乳酸杆菌和其他厚壁菌门(22、23、25)。一些相同的分类单元的影响弓形虫上消化道感染的慢性感染小鼠在这项研究。这一发现表明,在慢性阶段弓形虫感染,厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度的变化可能会发挥重要的作用在塑造主持人的行为在最初的急性感染被解决。刚地弓形虫感染人类与数字有关的神经障碍和认知变化,包括精神分裂症(57,58]。这些行为变化的确切机制仍不清楚,但值得注意的是改变肠道微生物区系的报道最近发生精神病在人类59]。潜在的生物上微生物区系变化所引起的各种后果人类在慢性弓形虫感染应进一步探索。
这项研究有一些局限性。没有试图进一步操作的微生物弓形虫来华的老鼠。后续研究微生物的变化,包括额外的行为和操作实验与慢性感染有关,与不同弓形虫和老鼠菌株,将追求。此外,肠道微生物在只有两个时间点测量。因为许多行为异常神经发育特性与关键窗口,这将是重要的微生物变化进行评估额外的时间点在发展。
尽管有这些限制,这是第一个研究文档弓形虫感染会导致长期的肠道微生物的变化。特别是,这些肠道微生物的变化涉及的出现的拟杆菌感染动物数量增加。此外,该类型的细菌表现出显著改变水平类似相关的行为和认知的变化。进一步的研究需要进行更多的分析之间的相互作用弓形虫感染、肠道微生物组、和行为在小鼠和其它物种,包括人类。这些研究可能导致增加的机制的理解弓形虫感染改变大脑功能,随后,改进方法的改善这些影响在受影响的个人。
数据可用性
测序分析数据用于支持本研究的发现是包含在文件的补充信息。未加工的排序文件(fastq文件)用于支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
詹姆斯·r·怀特博士是Resphera生物科学LLC的创始人兼董事总经理罗伯特·h·约肯一道,MD,斯坦利医学研究所董事会成员和科学顾问委员会。这种安排的条款是由约翰霍普金斯大学管理符合其利益冲突的政策。没有其他作者报告任何潜在的利益冲突。
确认
作者感谢朱迪·富兰克林,监视点,JHMI合成和测序设备,用于执行MiSeq测序和弗兰克•Boellmann博士,区域营销专家,信息学(Illumina公司),为帮助讨论MiSeq测序结果的分析。作者还要感谢弗农·b·瑟斯博士,教授,密歇根大学医学院和克里斯托弗·d·O ' donnell博士,有用的建议。这项工作是支持的斯坦利医学研究所和NIMH P50西尔维奥·o·孔戴中心约翰霍普金斯(格兰特没有mh - 94268)。
补充材料
ms excel文件包含元数据信息(表S1-S9)两组动物随着细节的分析两组测序16 s rRNA。(补充材料)