诱导活性中间体和Autophagy-Related蛋白在感染的巨噬细胞红球菌属等

文摘

红球菌属等(r .等)是一种细胞内macrophage-tropic与可能导致致命pyogranulomatous肺炎病原体之间的小马驹1和6个月大的时候。在这项研究中,我们试图确定是否感染的巨噬细胞r .武器装备可能导致自噬的诱导。小鼠骨髓中巨噬细胞(BMDM)被感染r .武器装备为各种时间间隔和分析upregulation自噬蛋白质和积累的自噬小体相对于未受感染的控制。免疫印迹分析显示逐步增加LC3-II和Beclin1水平时间的方式。自噬体的功能积累检测与monodansylcadaverine进一步支持增强的诱导自噬BMDM感染r .武器装备。此外,感染BMDMr .武器装备诱导生成的活性氧(ROS)时间的方式。这些数据符合报告记录活性氧诱导的自噬的作用,表明巨噬细胞的感染r .武器装备抒发天生的宿主防御机制。

1。介绍

红球菌属等是一个有氧,革兰氏阳性,nonspore形成球杆菌感染小马驹在生命的最初几周,可以引起严重pyogranulomatous肺炎1到6个月大的时候(1- - - - - -3]。r .武器装备坚持和复制小鼠和马巨噬细胞的细胞4,5]。感染后,r .武器装备吞噬和驻留在早期吞噬体舱,未能接受后来成熟阶段从而导致一个吗r .武器装备含有液泡(RCV)。形成RCV导致细菌增殖和杀死宿主巨噬细胞坏死的净效应r .武器装备逃避巨噬细胞杀菌活动(6,7]。质粒编码virulence-associated蛋白抗原(VapA)已被证明是必要的毒性和复制的r .武器装备在巨噬细胞8- - - - - -12]。

巨噬细胞是免疫细胞参与诱发主要应对病原体,维护组织内稳态,以及协调适应性免疫反应,炎症,炎症状态,和组织修复13]。根据不同的功能和生理角色,巨噬细胞被激活,以应对不同的先天和适应性免疫的信号。各种巨噬细胞表面受体表达发挥重要作用在影响和指导免疫反应。激活的巨噬细胞通过FcγRI和toll样受体(TLR)信号需要吞噬病原体,也可以激活NADPH氧化酶(NOX2)触发的生成活性氧(ROS),如超氧化物阴离子()和过氧化氢(H₂O₂),有可能杀死微生物14,15]。已经通过各种研究表明,线粒体活性氧的主要来源为调节自噬(16,17)和NOX2生成活性氧是细菌的关键调节器自噬18]。

自噬是一种高度保守的,使下降的过程,包括吞没的一部分细胞细胞质和细胞器在双层膜囊泡称为自噬小体,本身就是针对溶酶体降解[19]。在哺乳动物中,自噬的监管需要多个基因称为“autophagy-related基因”(Atg基因),集体有不同的功能(20.,21]。除了胞质材料,xenophagy识别细胞内病原体有针对性的溶酶体降解[19,22]。Xenophagy是一个新兴的先天防御机制对致病性代理,包括细菌、病毒和寄生虫(22]。吞噬作用和自噬合作作为组件的宿主先天免疫防御微生物入侵(18,23]。自噬蛋白卢比孔河证明是必不可少的NADPH氧化酶的活化复杂,导致活性氧的生产在受体结扎TLR-2或在微生物感染(24]。卢比孔河也负调节自噬的成熟的步骤的一部分Beclin1-Vps 34-containing自噬复杂(24,25]。延长这些研究巨噬细胞感染细胞内细菌的环境中,我们研究了诱导自噬在纵向研究发现自噬蛋白Beclin1 LC3-II和间接通过监控生产活性氧在感染骨髓衍生主要小鼠巨噬细胞r .武器装备。

2。方法

2.1。试剂

脑心浸液(BHI)和Luria-Bertani(磅)琼脂正欲购买的,迪金森和公司(马里兰州火花)。2-Mercaptoethanol、丙酮酸钠、葡萄糖、MDC (monodansylcadaverine),和鼠标反β肌动蛋白单克隆抗体来源于Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。兔多克隆抗体LC3B和兔多克隆抗体Beclin1买来Abcam Inc . (Cambridge, MA)和圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。800年IRDye共轭anti-rabbit抗体购自罗克兰免疫(Gilbertsville, PA)。CM-H₂DCFDA,延长黄金不变色与DAPI试剂,Alexa萤石680共轭anti-mouse, Alexa萤石488 anti-rabbit抗体由分子探针(尤金,或者)。玫瑰谷酰胺,青霉素,链霉素从英杰公司购买(CA)卡尔斯巴德。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)是由Mediatech, Inc .(弗吉尼亚州之上)。胎牛血清是购自谷生物医学,Inc .(弗吉尼亚州温彻斯特)。

2.2。细菌

T194r .武器装备临床分离菌株从肺仔(罗纳德•格里菲思博士提供的爱荷华州立大学),从−解冻80°C和有一个磅琼脂板和生长了30小时37°C。单个菌落接种到20毫升的脑心浸液在37°C (BHI)媒体和孵化瓶设定在200 rpm来实现光学密度0.25(外径)。细菌进一步洗在无菌PBS和resuspended BHI媒体。

2.3。BMDM隔离和细胞培养

股骨的骨髓细胞收获C3HeB / FeJ小鼠根据IACUC批准协议。短暂,骨髓细胞取出使用25固定到10毫升注射器针头包含完整的细胞培养基(CTCM)与杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,谷氨酰胺2毫米,0.05μM 2-mercaptoethanol 4.5 g / L葡萄糖25毫米玫瑰,100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。骨髓细胞在250 g离心机在4°C和15分钟resuspended骨髓中含有30% l细胞条件培养基,20%的边后卫,DMEM 50%,丙酮酸钠1毫米,2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素和链霉素100 ug /毫升。大约25×10⁶细胞被播种在15毫米培养皿和孵化37°C 5%的二氧化碳。2天的文化,媒体包含不依从细胞取代新鲜的骨髓中。6天,附着骨髓中巨噬细胞收获,洗前1 x PBS CTCM再悬浮。

2.4。共焦显微镜

评价细胞内的复制r .武器装备5×10⁵BMDM获准坚持在盖玻片24-well盘子。细胞被感染r .武器装备在感染复数(moi) 3和12 h,孵化24小时和48小时37°C。感染后,细胞被固定为4%在PBS PFA了15分钟,permeabilized 0.1% Triton-X 100 10分钟在室温下(RT),和阻止缓冲区(10%的山羊血清,0.4%的牛血清白蛋白在1 x PBS) 30分钟。将细胞内的细菌,与兔多克隆细胞被孵化r .武器装备(1:3000)作为主要抗体一小时(26]。盖玻片是洗了三次为5分钟1 x PBS和孵化山羊anti-rabbit Alexa 488(1: 3000)二级抗体1 h。盖玻片是进一步洗了三次1 x PBS和安装在玻璃幻灯片用延长DAPI(分子探针,英杰公司)。共焦显微镜进行了使用一个奥林巴斯显微镜ix - 61配备了红、绿、蓝滤光片组与冷却CCD相机或倒置的奥林巴斯Fluoview™1000(明尼阿波利斯,MN)激光扫描显微镜。

2.5。ROS化验

大约50000个细胞在完整细胞培养基(CTCM)被播种/在96孔板。感染后,细胞孵育10μM CM-H₂DCFDA染料(英杰公司)在黑暗中37°C 30分钟。细胞被洗了汉克的平衡盐溶液(哈佛商学院)和钙和镁。荧光测量使用Fluostarω(BMG生物技术)与设置激发荧光计485 nm和排放在540海里。

2.6。争取民主变革运动分析

争取民主变革运动(monodansylcadaverine)测定标签自噬小体被描述之前(27]。感染后,巨噬细胞无血清培养系统与0.05毫米MDC孵化RPMI介质在37°C 30分钟。后来,巨噬细胞在10毫米Tris-HCl收获和细胞溶解,pH值7.4包含1% Triton-X 100。积累的MDC自噬空泡测量使用Fluostarω板读者(美国NC BMG LABTECH Inc .)激发和发射波长355 nm和540 nm。此外,细胞的数量在每一个被添加0.2归一化μM溴化乙锭和DNA荧光测量励磁在485 nm和发射在670 nm)。公司表示为争取民主变革运动的活动。

2.7。西方墨点法

感染后,细胞收获和溶菌产物里帕也准备了裂解缓冲(25毫米Tris-HCl (pH值7.6),150毫米氯化钠,NP-40 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,和0.1% SDS)包含1 x蛋白酶抑制剂鸡尾酒(皮尔斯)。蛋白质执行量化使用布拉德福德化验设备。50μ克蛋白质在10%或15% sds - page分离。除了屏蔽的网站(1 h)通过使用LICOR阻断缓冲区,一夜之间,膜被孵化与兔多克隆Beclin1(1: 500),兔子多克隆LC3B(1: 4000),和鼠标单克隆β肌动蛋白抗体(1:5000)作为主要后跟一个小时孵化与anti-rabbit红外染料- 800(1:5000)和anti-mouse Alexa面粉680(1:15000)二级抗体。免疫印迹图像捕获使用《奥德赛》分析了红外成像系统(LICOR)和数据与奥德赛软件2.0。

2.8。数据分析

数据分析使用Prism 4.0软件(GraphPad棱镜,圣地亚哥,CA)。代表的意思是±SEM的结果。统计分析了单向方差分析其次是图基的事后考验(GraphPad棱镜软件)为了治疗组之间的比较。结果被认为是明显不同的 。

3所示。结果

3.1。r .武器装备骨髓中巨噬细胞的增长

首先,调查的细胞内增长r .武器装备、收获和培养BMDM是生长在盖玻片和被感染r .武器装备(moi3)。2小时后,细胞外的细菌被杀使用硫酸庆大霉素(10 ug /毫升)。细胞内细菌感染被允许12 h, 24小时和48小时。与反BMDM被应用r .武器装备抗体和荧光显微镜分析。相比BMDM无毒性(图1(一)),我们观察到细胞内r .武器装备作为绿色荧光puncta尸体在12 h(图1 (b))。此外,显著增加r .武器装备在24小时和48小时(数据吗1 (c)和1 (d))。此外,更高的细胞内放大r .武器装备在24小时显示染色r .武器装备在形式的集群和聚合,在细胞核周围的局部区域(图1 (e))。这一发现Hondalus和莫瑟(验证前面的研究5)表明,细胞内r .武器装备在集群复制。

3.2。ROS增加骨髓中巨噬细胞感染r .武器装备

增加巨噬细胞的活性氧水平以应对细菌入侵是一个重要的杀菌机制。因此,观察是否很重要r .武器装备刺激BMDM ROS水平的增加。

感染后r .武器装备(moi3) 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, BMDM孵化而言不啻ROS指标₂DCFDA所描述的方法。未感染的细胞相比,没有观察到细胞内ROS水平显著增加1小时,3小时,6小时。后来时间点显示显著的ROS增加时间的方式在18 h ( ,1.37倍)、24小时( ,1.38倍),48 h ( 1.5倍)。我们观察到细胞内ROS水平下降了1.5倍72 h比48 h(图2)。刺激的BMDM 10 ug /毫升有限合伙人以及25 ng / ml IFN g 24 h被视为积极的控制(28,29日),有显著提高( ;应用。ROS水平的1.3倍)。这些实验的结果表明r .武器装备感染后引起活性氧的增加生产时间点会导致细胞死亡的坏死导致未能维持活性氧在72 h。

3.3。诱导自噬在骨髓中巨噬细胞感染r .武器装备

最近,自噬被牵连的作用作为一个重要的宿主对微生物感染的免疫反应(22]。在这项研究中,我们旨在评价自噬的调节r .武器装备。BMDM感染了r .武器装备(moi3) 3 h、6 h, 12 h, 18 h, 24小时、48小时、72 h。接下来,我们孤立的总蛋白溶解产物,受到溶解产物蛋白免疫印迹检测自噬的标记,LC3-II自噬小体的结构组成部分(30.]。感染控制相比,显著增加LC3-II水平观察24小时( )和48小时( )。没有显著增加LC3-II表达式在早期感染时间点观察,包括3小时、6小时、12 h, 18 h。此外,72 h感染,有一个大约4.2倍下降LC3-II水平相比,24小时和48 h感染,表明72 h感染可能导致坏死(图3(一个))。我们进一步扩展这项研究观察自噬空泡的形成。BMDM感染了r .武器装备(moi3) 24小时和48 h。之后,BMDM孵化了一个荧光化合物叫做monodansylcadaverine自噬空泡(MDC)标签。荧光测量显示,MDC染色显著增加积累自噬空泡24小时( )和48小时( (图)感染的时间点3 (b))表明自噬的诱导。刺激的BMDM 10 ug /毫升有限合伙人以及25 ng / ml IFN g 24 h被视为积极的控制显示显著增加( ;在自噬空泡应用。6.5倍)。

接下来,我们想澄清如果启动自噬的发生。整个细胞溶解产物r .武器装备感染BMDM在不同时间点(3 h、6 h, 12 h, 18 h, 24 h, 48 h,和72 h)再次受到免疫印迹的Beclin1的关键调节器自噬,自噬体形成的起始通过第三类PI3K通路(31日]。如图4,我们观察到感染时间晚Beclin1的表达水平点,24小时( )和48小时( 早些时候),相比一个未受感染的控制和感染时间点(3 h、6 h、12 h和18 h)。Beclin1的表达水平明显下降(应用。4.35倍)在72 h。综上所述,这些研究结果表明r .武器装备感染导致自噬,自噬过程是一个正常的宿主反应,进一步涉及第三类PI3K通路的重要性细菌自噬。

4所示。讨论

r .武器装备仍然是一个巨大的挑战,年轻的小马驹和免疫功能不全的成年马的健康。它也是一个人类病原体的免疫功能不全的30.- - - - - -32]。r .武器装备尤其在小马驹被认为是肺炎的主要原因(33]。的发病率r .武器装备肺炎似乎越来越多,可能是因为马育种加强管理的农场和气候变化。这种疾病仍然是临床医生面临的主要挑战和马产业的流行病学模式和治疗宿主-病原体相互作用控制由于其复杂的(8,33]。本研究的目的是将LC3-associated吞噬作用的诱导活性氧的生产以洞察在感染巨噬细胞反应r .武器装备。

r .武器装备是一种细胞内macrophage-tropic革兰氏阳性球杆菌具有生存和繁殖的能力在小鼠和马巨噬细胞(5,34]。吞噬作用后,r .武器装备干扰phagosomal成熟和抑制酸化的吞噬体防止吞噬溶酶体的形成6,35]。除了干涉phagosomal成熟,我们的数据表明,感染r .武器装备诱发自噬,主机响应特征广泛保护。小鼠BMDM被感染r .武器装备莫伊的3和自噬的调节进行了分析在特定时间点后感染。检测autophagy-related蛋白质,LC3-II Beclin1,通过免疫印迹发生早在3 h更高数量的发现这些蛋白质在24小时和48小时表明自噬机制可以在天生的宿主防御中发挥作用。这项研究是由自噬小体的渐进积累检测使用MDC检测试验。

自噬是一种cytoprotective机制,其胞质内容被吞噬到自噬小体和溶酶体降解。自噬机制研究在各种疾病如癌症,神经退行性疾病、衰老和免疫力,和炎症(22]。为了生存和宿主细胞内复制,一些微生物进化出了一种机制来逃避自我吞噬机械降解[36]。最近有趣的概念中的自噬的特点是自噬小体的形成没有Atg蛋白质招募的必要性在双膜泡含有细菌(19,37]。LC3-associated吞噬作用涉及单个膜自噬小体的形成装饰着LC3在专业的吞噬细胞。这个过程是独立于ULK1复杂(38),但需要NADPH氧化酶活性与生产超氧化物和其他活性中间体在液泡内发挥杀菌作用(39]。它已经表明,分枝杆菌物种,包括结核分枝杆菌(结核分枝杆菌)和分枝杆菌marinum (m . marinum),生存在巨噬细胞通过阻止吞噬溶酶体的形成40)和招聘LC3的吞噬体(41]。自r .武器装备和分枝杆菌种虫害属于mycolata分类单元r .武器装备已表现出抑制phagolysosomal融合(6),它是合理的推测,感染r .武器装备可以引起相同的先天感染宿主反应m . marinum。我们的数据是一致的认为诱导自噬可能导致宿主细胞的能力来控制细胞内感染r .武器装备。宿主-病原体关系更好的理解这是可取的,因为有强烈兴趣的洞察潜在的治疗方法包括调节自噬。

根据与第三类磷酸肌醇3-kinase, Beclin1扮演着一个重要的角色在本地化自噬蛋白质preautophagosomal结构。在这项研究中,我们观察到显著水平的Beclin1 24小时和48小时。在这一点上,似乎Beclin1扮演重要的角色在巨噬细胞对感染的反应r .武器装备,但是还需要进一步的研究来探索Beclin1调节的作用r .武器装备诱导自噬。它已被证明结核分枝杆菌能逃脱吞噬体进入细胞溶质导致主机通过ESX-1坏死细胞死亡机制的依赖。研究报道,微观的观察小鼠BMDM坏死细胞死亡24小时后感染的莫伊3r .武器装备(结果未显示)和记录观察是一致的r .武器装备包含一个esx基因簇编码ESAT-6和CFP-10重要毒力和发病机理,包括坏死细胞死亡和细菌释放(42,43]。目前尚不清楚具体的自噬机制在识别中的作用r .武器装备胞质和疫苗是否能提供保护作用,可能推迟宿主细胞坏死。

另一个保护机制,似乎是共享的结核分枝杆菌和r .武器装备由histone-like介导的蛋白质,lsr2基因,r .武器装备同系物,显然赋予抵抗巨噬细胞活性中间体生产氧气,如过氧化物(44]。然而,尽管机制病原体耐药性的ROS,代ROS也扮演着一个重要的机械作用诱导的自噬通过上调NADPH氧化酶复杂(25]。在这项研究中,当小鼠BMDM被感染r .武器装备莫伊的3中,我们观察到一个时间生产的ROS 18 h直到48 h后感染。目前还不清楚确切的机制是,感染r .武器装备导致增强活性氧的生产和诱导的巨噬细胞自噬。虽然这两个事件可以是独立的,最近的研究表明,运行域Beclin1与cysteine-rich交互卢比孔河自噬蛋白,反过来,为了应对微生物感染作为一种积极的监管机构NADPH氧化酶(25]。TLR2微生物感染或结扎后,卢比孔河与NADPH氧化酶的p22phox亚基相互作用复杂,加速其phagosomal贩卖诱导的活性氧和炎性细胞因子。卢比孔河在自噬的行动和吞噬功能和基因分离,这两个函数的结果取决于环境刺激(24,25,38]。然而,它似乎是合理的,自噬和吞噬巨噬细胞抗感染中扮演很重要的角色r .武器装备Bonilla et al。(2013)表明,自噬调节吞噬清道夫受体的调节和体内需要根除分枝杆菌(45]。

在目前的研究中获得的数据提供新的见解对感染巨噬细胞反应r .武器装备,特别是对诱导自噬和活性中间体的生产。类似的动力学upregulation LC3-II自噬蛋白质含量和Beclin1表示对感染的小鼠BMDM诱导自噬r .武器装备。自噬体和自噬增加蛋白质的积累进一步支持增强诱导自噬在感染。ROS生成由鼠BMDM符合必要的信号作用的超氧化物upregulation LC3-associated吞噬作用,但也可能是由于其他对感染的反应r .武器装备。还需要进一步的研究来描述所涉及的信号通路调节自噬r .武器装备感染巨噬细胞以及调制的自噬是否可以用来减轻r .武器装备感染巨噬细胞。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者承认来自美国国立卫生研究院的支持;国家心脏,肺和血液研究所(1 r15hl103488-01)。作者要感谢博士维瓦斯、医院品牌de Valdecilla-IFIMAV大学坎塔布里亚,西班牙桑坦德银行提供多克隆抗体r .武器装备。他们也感谢罗纳德·格里菲思博士,教授,爱荷华州立大学提供r .武器装备,从肺临床分离菌株T194仔。他们承认Anumantha博士g . Kanthasamy特聘教授,爱荷华州立大学,帮助他们使用《奥德赛》红外成像系统(LICOR)和奥德赛软件2.0。

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