番茄红素抑制衣原体感染的繁殖

摘要

衣原体科(衣原体科)是一门具有相似发育周期和细胞生物学特性的细胞内致病菌，在不同的宿主中引起多种疾病，包括生殖器和眼部炎症、关节炎、呼吸系统和心血管系统的炎症疾病。本文报道番茄红素是一种主要的类胡萝卜素，存在于番茄和其他一些水果中，对番茄红素有很强的抑制作用c . trachomatis和c .肺炎肺泡巨噬细胞感染。免疫荧光分析和电子显微镜都证实了这一发现。注意到，番茄红素处理抑制衣原体发育周期的细胞内阶段，并导致感染后代的显著损失。在临床环境中也证实了番茄红素的抗衣原体作用。IgG抗体明显减少c .肺炎在志愿者的血清中口服7mg番茄红素一个月番茄红素的抗衣原体活性及其可能的作用有待进一步研究c .肺炎番茄红素抗衣原体活性与动脉粥样硬化机制的关系。

1.介绍

衣原体科是细胞内专性致病菌的一个家族，具有相似的发育周期和细胞生物学，在不同的宿主中引起广泛的疾病，包括生殖器和眼部炎症疾病、关节炎、呼吸系统和心血管系统炎症疾病[1，2]．这种细胞内细菌也可能与神经退行性和行为障碍的发展有关。例如，有证据表明Chlamydophila肺炎可能促进前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，并可能与代谢综合征、脂肪肝或非酒精性脂肪性肝炎的发生有关[3.]．

尽管衣原体与某些革兰氏阴性细菌有许多相似之处，但它是一种独特的系统发育和遗传实体，与其他细菌截然不同[4]．家庭中所有成员的发育周期衣原体科细胞内感染是由具有传染性但代谢惰性的基本体（EB）引起的，该基本体在膜相关液泡（称为包涵体）内的细胞内分化为具有代谢活性但非感染性的网状体（RB）[5]．感染周期在48-72小时内终止，真核细胞裂解，并将受攻击的子代释放到邻近细胞，随后在邻近上皮细胞中重复细胞感染[4，5]整个衣原体感染周期高度依赖于宿主细胞的能量稳态和代谢，因为衣原体物种缺乏ATP生物合成的关键酶，并且在脂质和许多其他有机物质的生物合成方面存在缺陷[6]．

宿主细胞代谢对衣原体发育周期的高度依赖为通过调节宿主细胞代谢途径来控制衣原体提供了机会。由于越来越多的报道称传统抗生素和抗菌药物治疗衣原体感染的疗效较低，这种替代抗菌疗法变得非常受欢迎。

在这篇论文中，我们报道了番茄红素诱导肺泡巨噬细胞细胞系的脂滴形成，抑制衣原体的生长，并降低志愿者的抗衣原体抗体水平。

2.材料和方法

２.１.试剂

番茄红素购自LycoRed (London, UK)，保存在−80°C的无氧容器中，直到用于实验。番茄红素原油溶液(15%)用橄榄油配制，并保持在−20℃。在培养细胞的研究中，将15%的番茄红素油溶液溶解在0.75、1.5和3.0 mg/ml的DMSO中。

水分散性微胶囊番茄红素来自巴斯夫公司，其10%的悬浮液与DMEM混合，最终浓度为5 毫克/毫升。

2.2.衣原体菌株和细胞系

应变L2 / Bu434c . trachomatis和菌株Kajaani 6, K6c .肺炎由芬兰奥卢大学P. Saikku博士和HL(人肺)细胞提供。B10。MLM是肺泡巨噬细胞的细胞系，由a . S. Apt教授(俄罗斯莫斯科结核病研究所)提供。McCoy细胞取自欧洲细胞培养物(英国索尔兹伯里)。细胞在5% CO中生长₂在DMEM中添加2 mM谷氨酰胺和10% FCS

2.3.在体外研究

c . trachomatis最初是在McCoy细胞中繁殖的c .肺炎如前所述，通过Renografin梯度离心纯化的HL细胞和基本体(EB) [7]．用10倍稀释的解冻原混悬液感染McCoy或HL细胞，测定衣原体滴度。将纯化的已知效价的基本体(EB)悬浮于蔗糖-磷酸盐-谷氨酸缓冲液(SPG)中，作为B10的接种剂。传销的细胞。细胞在24孔板中培养，直到融合率达到80%。B10。传销板被感染c . trachomatis或c .肺炎在无环己亚胺的5%胎牛血清的DMEM中，在1500离心0.5小时，多重感染(MOI)为30．37℃孵育1小时后，用DMEM洗涤单层细胞并添加番茄红素。用DMSO稀释番茄红素油溶液，番茄红素最终浓度分别为0.75、1.5和3.0µ在媒介g / mL。用葡聚糖微囊化的番茄红素加入培养基中，番茄红素最终浓度分别为0.125、0.25、0.5 mg/ml的DMEM。对照细胞接受添加溶剂或微胶囊物质(DMSO，橄榄油或环糊精)作为单一成分。

２.４.免疫荧光染色

感染的B10.MLM单分子膜在24孔板的盖玻片上生长24和42小时，用甲醇固定。

使用fitc标记的针对主要外膜蛋白的物种特异性单克隆抗体对渗透细胞进行直接免疫荧光(IF)染色c . trachomatis（Bio-Rad），或抗衣原体脂多糖的FITC结合单克隆抗体（Nearmedic Plus，RF）。使用Nikon Eclipse 50i荧光显微镜在×200和×1000放大倍数下观察包含包涵体的细胞。

2．5．传染性后代的评估

对于传染性后代的评估，B10。MLM细胞培养42 h后再次感染，如前所述[8]．连续稀释的裂解液接种到McCoy或HL细胞上。感染细胞在24孔板盖上培养42 h，用甲醇固定，用荧光显微镜观察c . trachomatis种特异性或属特异性单克隆抗体。半定量分析是基于×200放大镜下20个随机视野中感染细胞的计数和计算每毫升标本中包含形成单位(IFU)的平均数量。每个实验重复三次。

2.6。番茄红素毒性验证

MTT试验(BioVision, USA)在添加番茄红素24小时后，96孔培养皿中番茄红素的毒性得到控制。

2.7。中性脂质染色

用DMSO稀释番茄红素油溶液，番茄红素最终浓度为3.0µ在媒介g / mL。用葡聚糖微囊化的番茄红素加入培养基中，最终番茄红素浓度为0.5 mg/ml的DMEM。对照细胞接受添加溶剂或微胶囊物质(DMSO，橄榄油或环糊精)作为单一成分。中性脂质染色用B10。在盖玻片上培养的传销细胞用番茄红素孵育24和42小时。然后用PBS洗涤2次，用3%甲醛/0.025%戊二醛室温固定20分钟，根据制造商说明用BODIPY 493/503 (Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)染色。使用×1000放大倍数的尼康Eclipse 50i荧光显微镜观察细胞。

2.7.1。脂质颗粒定量分析的自动图像处理方法

为了提高图像评估的客观性和再现性，我们开发了内部自动免疫荧光图像处理软件，允许接收细胞内脂质颗粒的定量数据。该软件从细胞培养的数字图像中测量每个细胞中的脂质颗粒面积鉴定我们收集了每个样本20个随机场的照片。所有图像都上传到程序中，并自动评估细胞中脂质颗粒区域的大小。

2.8。透射电子显微镜

B10。传代细胞培养后感染c . trachomatis在6孔培养皿中添加或不添加番茄红素，感染后42小时，然后用胰蛋白酶-versene溶液从培养皿中收获。1500转/分离心10分钟获得细胞颗粒。(Rotanta 460 r;Hettich)用Ito-Karnovsky固定液固定，之后用OsO固定₄用醋酸铀酰水溶液进行对比。随后，在酒精浓度(50、70、96和100%乙醇)不断上升的情况下脱水标本，在1:1 (v/v) LR White树脂和100%乙醇混合物中浸润1小时，在4°C纯树脂中浸润12小时。树脂聚合在56°C下进行24 h。制备超薄切片，用铅溶液处理以提供对比(Reynolds, 1963)，并使用JEOL 100B透射电子显微镜分析，加速电压为80 kV (JEOL，日本)。

2.9。统计分析

所有的图表和统计分析都使用ANOVA进行，相对于细胞对照进行多次比较进行统计分析。

3.结果

３．１．番茄红素诱导B10脂滴的形成。传销的细胞

加入油剂型或微胶囊型番茄红素B10培养液24、42小时后。用中性脂质特异性荧光染料BODIPY染色，评价番茄红素亲脂分子在细胞内的储存情况。结果表明，接种两种形式的番茄红素均可导致B10中脂滴的形成。传销甚至在24小时内将番茄红素添加到培养基中(图1(一)).在观察期内，脂滴形成阳性细胞的数量以及细胞内脂质颗粒的大小逐渐增加。

为了可靠地估计添加番茄红素对脂滴大小的影响，我们使用了内部形态测量软件，根据细胞和脂滴的不同颜色进行分割。在B10中加入番茄红素后24和42小时，分别进行了成像。传销的细胞。脂滴面积与细胞面积之比的增加与培养时间有关(图)1 (b))．在橄榄油和环糊精的对照组中，没有脂滴形成。

电镜观察肺泡巨噬细胞脂滴形成。完整的В10。МLM细胞呈圆形，膜表面不规则。经过油剂型番茄红素处理的细胞与完整细胞具有相同的结构，除了脂质颗粒的外观，脂质颗粒整合在膜结构中(图)2(一个))．脂质颗粒电子密度中等。孵化后的В10。МLM细胞微囊化番茄红素，可见多个中等电子密度的脂滴(图)2 (b))，细胞器无任何结构变化。

因此，获得的结果表明，将细胞与番茄红素以油配方或微囊形式孵育可诱导细胞质中的脂滴形成，而对肺泡B10.MLM培养的巨噬细胞的结构无显著影响。

３.２．番茄红素抑制衣原体感染呈剂量依赖性

使用免疫荧光显微镜监测B10M孵育后衣原体包涵体的大小和包涵体的数量。用两种番茄红素配方感染细胞。如图所示3.在美国，用油配方番茄红素治疗会引起剂量依赖性的堵塞c . trachomatis包含扩张。0.75-3.0处理的夹杂物µG /ml的番茄红素含量低于对照组。此外，在所有试验剂量下，处理过的番茄红素培养物的包涵体数量都少于对照，在3.0时包涵体几乎完全消失µ克/毫升。

c . trachomatis用0.125-0.5 mg/ml浓度的微囊化番茄红素处理感染细胞，发现感染细胞的数量逐渐减少，包涵体的大小显著减小(图)4)．

需要注意的是，添加番茄红素是在最终的粘附和内化后进行的c . trachomatis培养细胞。排除了我们研究中观察到的抑制衣原体感染是由于番茄红素直接作用于病原菌并抑制其感染能力而发展起来的可能性。番茄红素对番茄红素的增殖胞内期有一定的影响衣原体发展周期。

通过在处理后发育周期结束时传代培养物来确定感染后代。有明显的传染性后代损失c . trachomatis用两种番茄红素配方处理过如图所示3 (c)和4（c），番茄红素处理导致非常显著的损失(高达日志)的后代(IFU)。

在B10细胞中，对衣原体生长的抑制不是由番茄红素毒性引起的。传销单层膜。评价B10。MTT法检测结果表明，50%的细胞毒浓度(CC₅₀)值为10.65±0.3µg/mL，微囊化番茄红素为8.17±0.25 mg/ mL，表明两种制剂均无细胞毒性。

透射电子显微镜显示c . trachomatis感染В10。МLM细胞的形状没有变化。在生命周期的不同阶段，有多个液泡含有衣原体包涵体(图)5（a）和5（b）)，具典型的初生体和网状体。

感染后潜伏期В10。МLM细胞3µg/ml油配制番茄红素42小时后，在细胞质中甚至在一些衣原体包涵体中发现多个脂质颗粒，很少检测到。c . trachomatis网状体形态异常，周质间隙扩大或结构破坏(图)5 (c)和5 (d))．

感染后潜伏期В10。МLM细胞微囊化番茄红素(0.5 mg/ml)，包涵体扩大、破坏，单一衣原体非典型网状体，未见初生体。脂滴位于细胞质中，与细胞密切接触c . trachomatis包含在受感染的В10中。МLM细胞(数字5 (e)和5 (f))．

另一组实验表明，番茄红素也能抑制番茄红素的生长和繁殖Chlamydophila肺炎细胞培养感染(图6).治疗c .肺炎感染B10。含油配方番茄红素的传销细胞(0.3µg/ml）或微胶囊化番茄红素（0.5 mg/ml）可导致培养物中内含物的丢失，并显著减少感染后代（图6 (b))．

３．３．番茄红素降低心血管病人抗衣原体抗体滴度

为了证实番茄红素在临床环境中对衣原体感染的影响，进行了一项初步临床研究。36个患者心血管疾病和血液中存在的积极的免疫球蛋白g anti-chlamydial肺炎抗体(通过Medac ELISA试验来验证,汉堡,德国)登记和处理一个每日口服剂量的专有GA包含7毫克番茄红素的活性物质4周(Lycotec有限公司,剑桥,英国)。首先，我们发现这样的番茄红素摄入方案导致血清中番茄红素水平相对于预处理值稳定升高(图)7(一))．其次，心血管患者血清中抗衣原体IgG水平较基线水平逐步降低三倍(图)7 (b))．

4.讨论

根据美国疾病控制与预防中心(CDC)的最新统计数据，衣原体病是美国最常见的报告疾病。两种衣原体病原体对人类健康的影响最为显著:c . trachomatis和c .肺炎．c . trachomatis感染了全世界1亿多人。c .肺炎是呼吸系统中最常见的细胞内细菌病原体；其全球流行率未知，在患有心血管疾病或有发展风险的人群中的流行率超过50%[9- - - - - -14]．有关于衣原体病原体通过横向和横向突变基因转移对常用抗生素产生耐药性的令人担忧的报道[15]．在-内酰胺类抗生素、干扰素- γ的选择性压力下，或铁和氨基酸(如色氨酸)等营养物质的剥夺下，大多数衣原体可进入一种持久的、代谢不活跃的状态，这对目前的抗生素治疗策略来说是难治性的，这具有临床重要性。这就是为什么寻找治疗衣原体感染的新方法仍然很重要。目前有少量新药正在进行临床前开发和早期临床试验，可能在治疗衣原体感染方面发挥作用。

营养因素在抗病毒和抗菌药物耐药性的机制中发挥着非凡的作用。最近的大量证据表明，某些类胡萝卜素对各种微生物表现出高范围的抗菌活性[16]．最近还发现衣原体可能受到植物化学物质的影响。特别是木犀草素可以预防急性c .肺炎并减少肺部组织的炎症[17]．

本文报道番茄红素是一种主要的类胡萝卜素，存在于番茄和其他一些水果中，对番茄红素有很强的抑制作用c . trachomatis和c .肺炎肺泡巨噬细胞感染。我们的研究通过免疫荧光分析和电子显微镜记录了这一发现。必须注意的是，根据免疫荧光分析，番茄红素对两种衣原体生长的抑制程度是压倒性的，达到90%以上。番茄红素的抗氯氨酸作用也在临床环境中得到证实。有一个显着减少的IgG抗体的抗体c .肺炎在接受一个月口服治疗的志愿者的血清中 GA番茄红素mg（Lycotec有限公司，英国剑桥）。

需要再次指出的是，研究方案排除了番茄红素对番茄生存力和/或侵染力的任何直接影响C trachomatis和C肺炎由于添加番茄红素是在衣原体感染后将感染颗粒从培养皿中冲洗掉的时候进行的，所以在细胞接触病原体的过程中。因此，根据我们的研究结果，番茄红素对衣原体生长的抑制作用完全是由于番茄红素对随衣原体繁殖而产生的细胞内事件的影响C trachomatis和C肺炎在宿主细胞中。

番茄红素对培养细胞内衣原体感染的抑制作用可能有多种机制。首先，如上所述，用番茄红素孵育培养细胞会导致培养细胞中脂滴的积累。衣原体的生命周期高度依赖于宿主细胞的代谢。特别是,衣原体不能合成脂质，必须从宿主细胞中获得脂质。可能是寄主细胞脂质超载和培养细胞脂质缺乏不利于衣原体病原体胞内生长。这一假设与我们先前揭示HMG-CoA还原酶抑制剂的作用的结果是一致的c . trachomatis胆固醇生物合成抑制剂抗衣原体作用的其他报告[8，18]．此外，番茄红素是众所周知的HMG-CoA还原酶的抑制剂，HMG-CoA还原酶是胆固醇生物合成的限速酶。因此，抑制胆固醇生物合成的培养细胞感染C trachomatis这可能是衣原体在宿主细胞中复制衰减的关键机制。最近发表的他汀类药物对衣原体感染抑制作用的研究结果很好地支持了这一假设[19，20.]．

然而，最重要的结论来自这样一个事实，即番茄红素也有能力阻止病毒引起的感染肺炎。根据我们的结果，番茄红素对衣原体感染的抑制作用在感染任一衣原体病原体的细胞中几乎相同:沙眼球菌或肺炎球菌此外，根据我们的研究结果，番茄红素治疗也会降低c .肺炎,志愿者体内的特异性抗体。在我们的工作中观察到的衣原体特异性IgG的快速下降需要在进一步的研究中解决。如果番茄红素具有抗衣原体在活的有机体内在条件下，衣原体特异性IgG可结合衣原体颗粒及其从破裂细胞中释放出来的残余物，并通过受体介导的网状内皮系统细胞从血液中快速清除。这种假设成为可能，由于我们以前的结果描述的识别c .肺炎在心血管疾病患者的血清标本中[21]．

正如人们普遍认为的那样[22]，c .肺炎是一种与动脉粥样硬化的发生、发病和解决密切相关的细菌病原体。因此，在我们看来，番茄红素的抗衣原体作用可以解释多项流行病学证据[23表明地中海饮食对心血管健康有有利影响，并直接与摄入番茄红素和降低心血管疾病风险有关[24，25]．坚持地中海饮食的人摄取番茄红素很可能在一定程度上保护他们免受心血管疾病的侵害[26]．

最后，番茄红素对衣原体感染的抑制作用可能与番茄红素的抗氧化性能直接相关。最近的研究表明，衣原体感染的初始阶段伴随着活性氧产生的一个显著的峰值[27]．随后，抗氧化干预能够阻止衣原体在宿主细胞中的复制[28]．番茄红素抗衣原体活性及其对衣原体介导的动脉粥样硬化机制的可能影响尚需进一步研究。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

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