文摘

在NADH再生,假丝酵母methylica甲酸脱氢酶(厘米外籍)是一个非常重要的酶在制药行业。在这工作,网站饱和突变(SSM)这是两者的结合理性设计和定向进化方法应用于改变辅酶NAD的特异性⁺端依赖厘米从外籍家庭佣工的河畔⁺以辅酶ii⁺并提高其热稳定性。对于这个目标,两个独立的库构造筛查辅酶的变化特异性和耐热性的增加。改变辅酶特异性,辅酶绑定域名,在195年,196年和197年受到两轮舰导弹和筛选使两个双突变体的鉴定D195S / Q197T和D195S / Y196L。这些突变体增加总体NAD的催化效率⁺来倍和倍值,分别。增加的热稳定性厘米外籍,守恒的残留在位置1的催化域厘米受到外籍家庭佣工的导弹。热力学和动力学结果表明,8突变第一残渣可以容忍的。在所有突变体,M1L孵化后的剩余活动最好在60°C的17%。这些研究强调,导弹是一种有效的方法来创建“智能图书馆”提高的属性厘米外籍家庭。

1。介绍

尽管扩大数据库描述小说酶,称职的酶在工业不能满足日益增长的要求,酶的合成。第一这一差距的原因是不稳定的酶提取嗜中温生物不能应付困难的条件下在工业合成。第二个原因是extremophilic酶的低可用性可以承受工业恶劣的条件。对文献的研究显示,只有不到1%的生物多样性在生物圈可以使用工业(1]。因此蛋白质工程策略仍然是改善工业适用的属性的关键酶。除了传统的蛋白质工程策略,例如,定向进化和理性设计、semirational设计称为网站饱和诱变方法最近出现的蛋白质设计(2- - - - - -4]。为了克服定向进化的耗时的筛选和选择过程,该网站饱和结合这两种策略,一种新的途径获得所需的属性的生物催化剂,将是有用的。这允许创建一个包含所有可能的氨基酸的突变体库(20天然氨基酸)在一个或多个预定的目标位置变化的基因序列通过限制扩大图书馆的筛选成为可能。

从NADH再生的观点来看这个网站饱和诱变方法应用于提高NAD的属性⁺端依赖假丝酵母methylica甲酸脱氢酶(厘米外籍)这是一个关键酶在制药行业5]。尽管有许多脱氢酶,可以进行必要的化学、河畔⁺端依赖外籍家庭提供了许多优点超过其他任何脱氢酶。它还被广泛作为发展工业的候选人NADH再生研究。然而,本地外籍家庭有两个重要的缺点:缺乏耐热性和有限的辅酶特异性。因此,研究人员希望利用在不同反应系统通过重新设计其有限的辅酶特异性和增加热稳定性。以前这种酶从不同来源的研究得出一些有用的信息在交换的辅酶特异性和提高其热稳定性。这是通过使用rational设计方法(6- - - - - -14]。然而,最近,Andreadeli et al。15和吴et al。16)使用网站饱和突变的辅酶特异性改变cb外籍家庭。Asp195Gln / Tyr196His双突变体的整体催化效率增加cb与外籍家庭佣工的辅酶ii⁺。您et al。7)表明,半胱氨酸的替换第一的位置厘米外籍家庭增加了酶的热稳定性。考虑这个,Met1选为目标残留的热稳定性提高厘米申请外籍家庭佣工的网站饱和突变。

这里我们有网站应用饱和诱变技术的辅酶特异性改变厘米从外籍家庭佣工的河畔⁺以辅酶ii⁺并提高其热稳定性。两个独立的图书馆是构建筛查辅酶的变化特异性和耐热性的增加。

2。材料和方法

2.1。饱和诱变突变体库的建设网站

简并引物包含突变远期(5′- CATATGCATGCGGGAGCTCAA密码子亚硝胺AAGATCGTTTTAG-3′)和反向(5′- CTAAAACGATCTT的内容TTGAGCTCCCGCATGCATATG-3′)方向设计产生的突变体库Met1残渣耐热性突变体。引物引入突变在位置Asp195 Tyr196, Gln197被用于构建第一代库。正向引物是Asp195_F:5′-CAAAAGAATTATTATACTAC亚硝胺TATCAAGCTTTACC-3′,Tyr196_F:5′GAATTATTATACTACGAT亚硝胺CAAGCTTTACC-3′,Gln197_F:5′-CTACGATTAT亚硝胺GCTTTACCAAAAGAAGC-3′和反向引物Asp195_R:5′-GGTAAAGCTTGATA的内容GTAGTATAATAATTCTTTTG-3′,Tyr196_R:5′-GGTAAAGCTTG的内容ATCGTAGTATAATAATTC-3′,Gln197_R:5′-GCTTCTTTTGGTAAAGC的内容ATAATCGTAG-3′是使用一个应用生物系统公司308 DNA合成仪合成。引入突变的引物的位置Tyr196和Gln197用于建设第二代Asp195Ser突变体库。正向引物Asp195Ser / Tyr196_F:5′-GAATTATTATACTACAGT亚硝胺CAAGCTTTACC-3′和Asp195Ser / Gln197_F:5′-CTACAGTTAT亚硝胺GCTTTACCAAAAGAAGC-3′和反向引物Asp195Ser / Tyr196_R:5′-GGTAAAGCTTG的内容ACTGTAGTATAATAATTC-3′和Asp195Ser / Gln197_R:5′-GCTTCTTTTGGTAAAGC的内容ATAACTGTAG-3′合成辅酶(NAD (P)的变更⁺)特异性。基本变化是用粗体显示。N A、T、G、C;K是G、T;M是一个包含本地或c双链DNA质粒厘米基因分离和外籍家庭佣工用作PCR模板DNA的研究。孤立的双链包含Asp195Ser突变质粒DNA厘米基因作为外籍家庭佣工的模板DNA的第二代图书馆辅酶特异性研究。PCR (94°C 2分钟初始变性,95°C 2分钟,2分钟50°C, 72°C 8分钟,30个周期,10分钟在72°C,最终扩展)是获得线性的质粒厘米基因与期望的变化,外籍家庭佣工的50 ng模板DNA,每个核苷酸的0.3毫米,每个引物0.3 pmol, Pfu®0.02个单位Taq聚合酶。PCR产品消化与10个单位Dpn我(罗氏)酶限制性内切酶通过孵化37°C 4小时来消除原始厘米外籍家庭基因。突变体PCR产品(Met1突变体和第一代(Asp195、Tyr196 Gln197)和第二代(Asp195S / Tyr196和Asp195S / Gln197)突变体)变成了大肠杆菌BL21 electrocompetent细胞生物学实验室(新英格兰)。建立突变体库,改变了殖民地在96年培养板包含100μl英杰公司MagicMedia大肠杆菌表达式中、100µg / ml氨苄青霉素的孵化37°C 18个小时。生长期后,细胞培养含有甘油20%股票板块被储存在−80°C。

比色测定应用于监控NAD (P) H生产间接选择积极的突变体。比色测定是基于减少氮蓝四唑(电视台)可溶性甲瓒的吩嗪methosulfate (PMS)与NAD (P) H反应产生的脱氢酶(17]。为此,细胞生长在96 -深层文化板块包含1500μl英杰公司MagicMedia大肠杆菌表达式中、100µg / ml氨苄青霉素为22小时孵化在37°C。文化在4000离心机g为20分钟。球被使用resuspended 50μl“BugBuster”(Novagen)裂解缓冲和盘子被摇晃在室温下孵化20分钟消化细胞并获得酶。后潜伏期细胞离心,享年4000岁g再去除细胞碎片。清除溶解产物被新96 -孔板用于比色筛查试验。

比色测定重复了3次在200年所有的突变体μ包含20 l反应介质μl溶解产物,20μl(10毫米)辅酶ii⁺或河畔⁺,20μl甲酸(200毫米),和140年μl反应的解决方案(50毫米Tris-HCl包含% 0.13明胶,pH = 8.0, 300μM电视台,30岁μ经前综合症)。添加溶菌产物作为最后一个组件开始反应和增加蓝紫色花颜色之后在580纳米测量活动,间接。确定突变殖民地的热稳定性分析进行了热处理前后10分钟55°C。突变体的比较控制后,最有前途的突变殖民地被选作进一步鉴定研究。

2.2。净化的突变厘米外籍家庭

pQE-2表达载体包含His-tagged基因转化为外籍家庭佣工JM105个细胞NAD的过度⁺端依赖外籍蛋白质。相同的协议(18)被用来净化野生型和突变体厘米蛋白质从外籍家庭佣工大肠杆菌overexpressing克隆。sds - page和考马斯亮蓝染色显示> 95%纯净化后的蛋白质。

2.3。稳态动力学

稳态动力学实验在室温下进行反应混合物中含有20毫米三羟甲基氨基甲烷在液pH值8日NAD 1毫米⁺、甲酸0-40毫米和0.4μ酶或200毫米甲酸,0-40 mM NAD (P)⁺,40μM酶。NAD (P) H的生产监控通过吸收的增加在340海里。数据分析使用GraFit 5。

2.4。热变性

野生型的热稳定性和催化地活跃的突变蛋白是由测量NADH生产的初始速率在340 nm,孵化后的蛋白质样品在一系列不同温度为20分钟(30岁,35岁,40岁,45岁,50岁,55岁,60岁,65,和70°C)。试验条件0.4μM酶,20毫米三羟甲基氨基甲烷pH值8液含有0.2甲酸,NAD和1毫米⁺。

3所示。结果与讨论

通过这个网站饱和突变,可以创建一个包含所有可能的突变体库的20种不同的氨基酸组合在一个或多个预定位置的基因序列。结合高通量筛选方法,以前网站饱和突变已成功被用来提高几位外籍家庭和其他酶酶学性质的2- - - - - -4,15,16]。

由于没有晶体结构厘米、同源性模型厘米是由外籍家庭佣工的晶体结构的基础上使用标准的方法假丝酵母boidinii(外籍家庭佣工cb外籍)[19,20.]。这种蛋白质的主要序列图所示197%是相同的吗厘米外籍家庭。残留在辅酶结合域和催化域负责辅酶特异性和热稳定性是由使用洞察II (Accelrys)计划。

3.1。辅酶特异性

在之前的实验中,我们也实现了厘米使用辅酶ii外籍家庭佣工⁺通过单一突变Asp195Ser [11]。然而,这种突变结合辅酶ii⁺弱。据报道在Andreadeli et al。15]Asp 195年和随后的突变的突变在196生成几个突变酶与辅酶ii外籍家庭佣工⁺特异性。最近,吴等人透露,网站饱和突变应用残留Asp195, Tyr196, Gln197cb产生更多的外籍家庭佣工的突变体与重要的辅酶ii⁺特异性,表明这些残留的关键角色在决定酶的辅因子特异性16]。在这项工作中,我们进一步探索突变辅酶绑定域来改善的厘米为外籍家庭佣工的辅酶ii⁺。单一突变在Asp195 Tyr196, Gln197辅酶绑定域介绍了通过使用网站饱和突变。图书馆的辅酶对NAD特异性突变体筛选的活动⁺和辅酶ii⁺的几个浓度的甲酸钠。重组的野生型厘米作为外籍家庭佣工的控制在每个筛选板。27个殖民地与辅酶ii表现活跃⁺来自近400个筛选殖民地第一筛选利用比色测定。进行详细的动态测量5培养殖民地的27个殖民地上面提到的。重组野生型和突变体的活动厘米酶是外籍家庭佣工的化验以同样的方式中提到的部分2。3。

其中,在辅酶ii的存在⁺单突变体Asp195Ser Gln197Val表现出最高的催化效率(),8米⁻¹年代⁻¹和18米⁻¹年代⁻¹,分别。Asp195Ser,辅酶ii描述为一个有前途的突变⁺特异性之前设计合理(11),从第一轮工程网站获得饱和突变在195位置。另一方面,Asp195Ser也表示为辅酶ii⁺特异性突变由Andreadeli et al。15]。这些结果证实,丝氨酸为辅酶ii是这个职位的合适的残渣⁺绑定。同时Asp195Ser突变厘米野生型酶和外籍家庭佣工厘米外籍酶显示与NAD相似的催化效率⁺(0.22和0.3210³米⁻¹年代⁻¹、职责)。Asp195Ser至少8000倍更有效地将辅酶ii⁺比野生型。其他重要突变Gln197Val从第一轮网站获得饱和诱变突变体在文献中描述的不同切换辅酶特异性NAD的外籍家庭⁺以辅酶ii⁺(15,16]。Gln197Val变异表明,更多的疏水残基的位置对辅酶ii 197更有亲和力⁺。Gln197Val突变厘米外籍酶显示> 18000倍对辅酶ii较高的催化效率⁺比野生型酶。然而,对NAD催化效率⁺(0.0610³米⁻¹年代⁻¹)5倍小于野生型。催化效率的比率/针对单一突变蛋白质Asp195Ser和Gln197Val是0.036和0.3,分别。

突变在195年残渣,具有证明作用酶的底物特异性、选择从第一代突变体库作为模板来构建第二代突变体库。在其他网站饱和突变研究辅酶特异性的改变、Andreadeli et al。15]196工程的氨基酸残基的位置使用Asp195Gln作为父母的序列。吴et al。16]Asp195Ser和Asp195Gln作为父母的序列和氨基酸残基位置196进行第二轮诱变。在我们的研究中,第二代突变引入残留在196年和197年职位与以前的网站饱和度研究改变底物特异性。图书馆是筛查活动对NAD (P)⁺和6双突变体选择有前途的辅酶ii⁺具体为特征的突变体和培养外籍家庭佣工和NAD的值⁺,辅酶ii⁺和甲酸(表1)。

在第二代,米氏常数()突变Asp195Ser / Tyr196Leu NAD的价值⁺是0.7毫米,非常接近野生型的厘米与外籍家庭佣工的河畔⁺(0.62毫米)。这些酶的辅酶ii的存在价值⁺是2毫米6双突变体之间的最佳关联。催化常数(辅酶ii)的突变⁺是2.5倍高于野生型酶而NAD的催化常数⁺与野生型相同。这个突变体0.1±0.02 s⁻¹kcat价值而催化常数野生型酶辅酶ii⁺不确定。双突变体的另一个优点是与NAD的催化效率⁺(0.2610³米⁻¹年代⁻¹),这是接近NAD的野生型催化效率⁺(表1)。这种酶的催化效率的辅酶ii⁺是510⁴倍高于野生型酶。

Asp195Ser / Gln197Thr双突变体显示最高的催化常数辅酶ii⁺(0.26年代⁻¹),NAD的价值⁺是0.22毫米。Asp195Ser / Tyr196Ala双突变体产生最高的亲和力NAD(0.13毫米)⁺大约3倍高于野生型厘米、不改变NAD的催化常数⁺。相对于野生型厘米酶外籍家庭佣工Asp195Ser / Gln197Thr双突变增加了整体的催化效率(/辅酶ii)⁺到5.610⁴倍高于野生型厘米外籍酶。甲酸的亲和力Asp195Ser / Tyr196Leu和Asp195Ser / Gln197Thr 21-fold酶。这是5倍高于野生型酶的辅酶ii 200毫米⁺。

结果表明,在疏水性和极性,关于辅酶结合口袋的大小,氨基酸构象为辅酶ii是一个重要的参数⁺绑定。描述单引号和双突变体的获得我们的研究提供大量的数据对于理解辅酶结合特异性的酶和外籍家庭佣工NAD的绑定⁺或辅酶ii⁺。然而,辅酶特异性对工业工程的要求是一个具有挑战性的领域由于其复杂性和分子机制尚未完全阐明。

3.2。热稳定性

从以往的研究可以看出,有许多试图改变蛋氨酸Gln,亮氨酸,Ile,板式换热器,阿拉巴马州的Val或者noncoded氨基酸替换在几个位置不同的蛋白质(利用定点突变技术21- - - - - -23]。您et al。7]表明,更换蛋氨酸,半胱氨酸,如替换残留1的情况下,增加蛋白质的催化效率和导致的改善的二级结构的热稳定性厘米外籍家庭。这就是为什么我们有应用网站饱和突变第一残渣,蛋氨酸,的厘米提高其热稳定性和观察外籍家庭佣工的氨基酸替换宽容第一残渣。

图书馆的耐热性筛选突变体是通过跟踪蓝紫色花颜色的增加在580纳米测量活动,间接。确定突变体的热稳定性的殖民地,这分析执行热处理前后10分钟55°C。空MagicMedia大肠杆菌表达式中,细胞没有厘米基因外籍家庭佣工,本机厘米蛋白质都是作为外籍家庭佣工的控制。比较突变体和控制后,最有前途的8从200突变体筛选殖民地(表被选中作进一步鉴定研究2)。

的第一个残留厘米对应于15日外籍家庭佣工的残渣的重组6 xHis-tagged厘米(外籍家庭佣工MKH₆HMHAGAQ米KIVL)。因此,在最初的起始密码子突变外籍家庭基因并不能抑制酶的表达。如图所示由8突变的结果在这个位置,这些改变是容忍。如果值分别进行比较,除了Met1Arg Met1Leu,所有突变体甲酸相比,本机有更好的亲和力厘米外籍家庭。另一方面,尽管Met1Leu更高比本地值(6.3毫米)厘米为外籍家庭佣工的甲酸(4.75毫米),更好值(1.2秒⁻¹)比原生的厘米(1.1外籍家庭佣工的年代⁻¹),值的变异本地几乎是一样的厘米外籍(表2)。当所有突变体相互比较的催化效率,Met1Cys (0.4 s⁻¹毫米⁻¹)被发现是最好的。

考虑剩余活动基于热失活的百分比实验,观察到本机厘米、Met1Cys、Met1Gln Met1Leu突变体孵化后几乎相同的活动在50 - 55°C。在所有突变体,Met1Leu孵化后的剩余活动最好在60°C(图的17%2)。

谷氨酰胺的替代效应可能来自侧链的相对极性大于蛋氨酸的疏水侧链。这些侧链改变减少疏水性和范德瓦耳斯相互作用[24- - - - - -26]。白氨酸和蛋氨酸疏水氨基酸侧链和范德华体积被亮氨酸接近蛋氨酸。介绍亮氨酸可能导致重要的空间干扰和大量运动在几个附近的残留(22]。Methionine-to-leucine替换可能会稳定或不稳定的影响取决于残留的环境改变(23]。在这项研究的稳定影响Met1Leu突变来自增加熵在室温下。相对于本地厘米热容、高焓和熵和低Met1Leu的显著特性。

天冬酰胺和丝氨酸有破坏作用;精氨酸、缬氨酸和丝氨酸对稳定性影响甚微。对应的研究文献表明,蛋氨酸noncoded氨基酸替换,缬氨酸,精氨酸,丝氨酸通常有小对蛋白质结构的影响。这种效应可能会稍微稳定或不稳定取决于残留的位置(21]。

4所示。结论

我们应用网站饱和突变改变的性质厘米外籍家庭。的辅因子特异性厘米从NAD是外籍家庭佣工的改变⁺以辅酶ii⁺通过变异在Asp195残留物,Tyr196, Gln197。的热稳定性厘米也成功地增加了外籍家庭佣工的变异Met1的残渣。这些研究表明,网站饱和突变是一种有效的方法来创建“智能图书馆”提高的属性厘米外籍家庭。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Gulşah p . Ozgun Emel b .您也同样特约作者。内文古尔Karaguler是通信作者。

确认

这项工作是支持的部分TUBİTAK,项目没有。107 t684,伊斯坦布尔技术大学科技学院(项目号33309)。作者还感谢a·r·克拉克教授援助热变性实验。