短的波长锥视蛋白不表达在视网膜上的树栖非洲穿山甲(酱油tricuspis)

文摘

本文报道的一项研究的锥感光细胞在视网膜酱油tricuspis。具体来说,镜(L)视蛋白表达longwave-sensitive锥和SWS1 (S -)视蛋白shortwave-sensitive锥是有针对性的。垂直部分显示反应锥标记,花生凝集素(机构),以及一个LWS抗体,但不是一个SWS1抗体。这表明酱油tricuspis视觉系统不能区分从更长的波长更短的波长,因为短的波长锥不表达他们的视网膜。

1。介绍

图像视觉系统能够形成战略在哺乳动物的生存技能,比如寻找食物,躲避捕食者,识别性伴侣1]。哺乳动物杆感光细胞用于低光视觉而锥感光细胞用于日光和色觉。颜色视觉在哺乳动物中是通过锥视蛋白色素的存在2]。胎盘类哺乳动物通常有两色的颜色视觉基于光谱锥色素的存在两种类型:长波长敏感的视蛋白(L -)和短的波长敏感的视蛋白(S -) (3]。一般来说,灵长类动物表达优秀色觉[三个光谱锥色素给他们3,4]。物种像猫头鹰猴子也有报告称,只有一个光谱锥视蛋白色素(4,5]。

S-opsin的损失和/或l视蛋白在不同物种及其意义都进行了广泛的审查(2,6)和感光视蛋白的损失或收益的重要性报道适合物种的生存所需的不同的灯(2]。栖息地,生活方式,和遗传事件本质上是假设占这些独特的损失(2]。比较在不同哺乳动物视觉系统本身是有价值的,也理解条件考虑异常在人类模仿这些事件在其他物种,从而帮助我们提供自然的方法来管理或解决这些事故。

非洲穿山甲是独一无二的树栖哺乳动物从同质指令石仙桃属仅包含八种单属(酱油)。这些动物通常夜间,高度保密,濒危或高度的威胁(7,8]。坊间的观察报告依赖他们的嗅觉而不是视觉系统来支持他们的食虫的生活方式9,10]。视网膜上的一项研究预测,他们的大脑显示他们有很小的视神经相比,他们的大脑大小和相对于其他常见的哺乳动物如老鼠、猴子、猫(9]。穿山甲有非常独特的角质鳞片覆盖他们的皮肤像一个表皮盔甲和是唯一的哺乳动物的适应(8]。面对威胁,穿山甲旋度紧密到球(10]。

扩展我们的知识特别是一样濒临灭绝的物种酱油tricuspis可能揭示普遍适应性专门化趋势下不同的生活方式(11]。在目前的工作中,我们使用受体抗体针对锥视蛋白色素决定树栖穿山甲的视觉能力酱油tricuspis。

2。方法

本研究进行的非洲穿山甲。八个男性成年树栖非洲穿山甲被俘的偏远地区使用Olokemeji尼日利亚西南部热带雨林的森林保护区和16视网膜被用于这项研究。尽管穿山甲都濒临灭绝,没有任何限制从野外捕捉他们,但有制度准则调节动物的使用和护理研究。动物是依照这些制度伦理在动物保健和使用。安乐死后,角膜后面的眼睛明亮了,晶状体和玻璃体切除。方向被标记为一个背削减在视网膜上,而视网膜是小心翼翼地从洗眼杯中删除。在所有的目光,视网膜是容易分开的感光色素上皮没有损坏外段。

十六个视网膜从八个成年男性穿山甲被固定在4%多聚甲醛(PFA) 20分钟,然后放置在0.1米磷酸盐缓冲剂(铅、pH值7.4)。Cryoprotection是由浸泡部分在30%蔗糖30分钟,其次是嵌入在组织冷冻剂(三角生物医学)。嵌入式视网膜组织连续切片进行了20岁徕卡低温恒温器μm和捡起放到幻灯片。

串行部分孵化先后在屏蔽解决方案(3%正常驴血清和0.3% triton - x - 100在磷酸缓冲盐(PBS)) 1小时在室温下,紧随其后的是孵化主要抗体稀释PBS中含3%正常驴血清和0.3% triton - x - 100 12 - 14个小时在4°C。组织部分在PBS洗两次。

SWS1视蛋白与山羊抗血清检测sc - 14363曾提出对20 aa n端抗原决定基的人类年代(蓝色)锥的稀释1:500年视蛋白(圣克鲁斯生物技术有限公司、圣克鲁斯、钙、美国)。发现LWS视蛋白与兔抗血清JH对c端492人类锥视蛋白的抗原决定基(请提供的j·内森,约翰霍普金斯大学医学院,巴尔的摩,Sanes——实验室,哈佛大学,美国)的稀释1:1000和锥标记花生凝集素、机构(生物素化的机构在稀释1:500年,σ,美国)。所有抗体都是整除以前存储在−在使用前20°C。

部分随后被转移到fluorophore-labeled二级抗体(Alexa 488, Alexa 564, Alexa 594,分子探针,尤金,或者美国)在室温下1 - 2小时。部分盖玻片。光学和荧光收集视网膜图像使用奥林巴斯氟1000激光扫描共焦显微镜40 x目标没有油浸(美国纽约奥林巴斯美国注册)。部分图像,通过收集光Z-stack薄(1分开)感兴趣的区域。获得的图像对比度和亮度设置适合灌装的8位编码图像识别的范围软件斐济。获得图像的缩放比例为1:1和花期图像获得在1024×1024(像素)保存为斐济OIF文件为了使图像识别图像J(美国国家卫生研究院)。

3所示。结果

连续切片和视网膜组织的组织化学染色酱油tricuspis表现出强烈的免疫反应性机构,视锥视蛋白标记的外核层和终端的锥内部核层(图1(一))。抗体长波长锥视蛋白表现出强烈的免疫反应性与锥外核层而不是终端(图1 (b)),而抗体短的波长锥视蛋白没有immunolabel锥外核层和终端作为一个恒定的一部分或作为一个梯度在视网膜虽然使用的标记是一个健壮的抗体(图1 (c))。

在三重标记实验中,标记为锥的机构是相同的人口贴上L-cone标志因此占所有锥的~ 100%没有任何锥表达S-cone所有视网膜的视蛋白部分(图1 (d))。

4所示。讨论

适当的颜色视觉能力的重要性,强调在哺乳动物物种的历史悠久的持久性特别是因为它起着有益的作用在支持给他们敏锐的歧视性的生存能力12]。没有短的波长锥酱油tricuspis可能是足够的视觉信息处理。视锥细胞的感光细胞是给颜色视觉的能力,特别是颜色歧视需要两个或两个以上的存在类型的光感受器与幽灵似地离散视觉色素(13]。锥分为光谱类型包含不同的视觉色素和他们通过中间神经元光谱信息发送给相应的神经节细胞(14]。

一般来说,脊椎动物有四个类型的锥视色素位于四谱锥类型:SWS1(短的波长敏感1在近紫外到紫)的范围,SWS2(短2波长敏感,这是紫蓝色的范围),RH2(中间波长敏感,在绿色)的范围,和镜(长波长敏感,黄色红色)的范围(12,13]。视色素由蛋白质,围绕一个发色团的视蛋白,和一个给定的光谱灵敏度颜料是由视蛋白的氨基酸序列(2]。

许多日北梭鱼,爬行动物和鸟类拥有四个锥类型,因此潜在的tetrachromatic色觉。一些哺乳动物失去了视蛋白类RH2 SWS2;相反,他们只保留了类镜和SWS1;单孔目动物等其它SWS1和留存SWS2 [2,14]。因此,最常见的哺乳动物的条件是两色的颜色视觉的基础上L-cones S-cones,因此允许歧视的更短的波长更长波长但长波长之间没有歧视5]。的含义酱油tricuspis色觉是全损,棒暗明视觉和L-cones服务服务。整体视力并不一定影响S-cones等视网膜的灵长类动物的形式,只有一小部分的总锥恭维(15]。这可能是为什么S-cones,不是L-cones,一般都失去了。大量的真兽类哺乳动物转移峰值敏感性SWS1从近紫外到紫色或蓝色,也就是说,失去了SWS2色素的位置,LWS色素灵敏度范围从绿色到红色取决于物种(10有效的),这表明光谱调优,通过氨基酸视蛋白的变化,是在强大的选择性压力下。在多数的有袋动物,他们保留了UV-sensitive SWS1色素和旧世界灵长类包括人类,三色颜色视觉reevolved LWS视蛋白基因的复制产生两个幽灵似地离散镜视蛋白,绿色和红色锥视蛋白(10]。

先前的研究酱油tetradactyla视网膜上报告说,他们已经向二级monochromacy [11]。的酱油tricuspis和酱油tetradactyla都属于订单石仙桃属,这很可能是一个独特的物种的特征。缺乏表达S-cone视蛋白酱油tricuspis限制了其颜色视觉能力;具体来说,能够可靠地分辨不同级别的光谱能量达到更高的眼睛中心的分析和解释视觉环境需要短的波长和长波长锥的存在(12,13]。这意味着s - cone引起的色觉误差在缺席的情况下酱油tricuspis妨碍了这个基本要求颜色歧视和给他们一种单色哺乳动物的状态。只有L-cones的存在已经被记载在一些其他物种(2]。S-cones存在代表性物种以外所有其他脊椎动物类软骨鱼类(15];据报道他们的损失最常见的水生哺乳动物和一些夜间地球物种16]。峰光谱灵敏度的s - cone引起的色觉误差取决于色素的光谱特征存在;例如,在紫外线(UV)敏感,这山峰周围360海里,在光谱的紫色区域,它大于380纳米和物种之间的转变可能是脊椎动物进化的结果。在所有情况下,这种转变是由一个或几个替代tuning-relevant残留物(16]。在脊椎动物虽然光色素是高度保守的,引人注目的变化出现,消失,再次出现变种在进化的过程中(12]。这些事件或变化,可能会或可能不会出现与其他改变视觉系统往往会导致深刻的变化的性质和脊椎动物之间的颜色视觉处理机制(12]。

多年来,利用抗体针对锥视蛋白已成为非常受欢迎的和有效的;这些都是针对守恒的抗原表位,他们认识到各自的视蛋白类型在不同的物种。采用锥视蛋白的标签有两个主要优势。首先,它允许一个确定的人口锥的性质,例如,L -和S-cones,包括他们的地形分布在视网膜(数字1(一),1 (b),1 (c),1 (d))。这些属性具有重要功能的后果,他们无法通过其他方法获得。其次,抗体固定的组织工作;因此,锥的存在和分布类型可以评估物种不易用于生理或行为实验。使用视蛋白抗体的研究大大增加我们知识锥安排在哺乳动物的多样性。他们已经鉴定出许多物种特别有趣的锥属性,后来被受到分子和生理的方法。第一个证据,可能会有一些非人类物种类似于人类tritanopes(人类缺乏功能性S-cones)来自一个视蛋白抗体标记的研究两种夜间灵长类动物:阔枭猴(汇合trivirgatus)和strepsirrhine bushbaby (狉garnettii)[16]。后续的研究汇合猴子,包括行为和视网膜电流图(ERG)测量,同样未能发现任何功能S-cones的存在的证据。因此,它被假定色素安排在这个猴子可能类似于人类tritanopes SWS1以来视蛋白基因在这个物种有缺陷,扰乱生产功能性S-cone颜料(5]。这个建议是当序列的分析SWS1视蛋白基因在两种猫头鹰猴子和bushbabies透露,这些基因(a)高度同源的人类S-cone视蛋白基因但(b)存在突变变化,功能齐全的光色素的生产是不可能的(13]。突变的性质变化是不同的两个物种,但两个核苷酸的插入和删除,介绍过早停止密码子(13]。在过去的20年里,一些哺乳动物物种已报告了S-cones使用技术,如基因序列,基于研究功能的措施,如ERG录音和视蛋白抗体标记的光感受器或观察得到视觉的直接行为测试(10]。到目前为止,证据表明哺乳动物从五个订单,失去了S-cone函数结果视蛋白基因突变的报道(11,15]。例如,据报道,SWS1基因被灭活突变单孔目动物鸭嘴兽的变化鸭嘴兽anatinus和针鼹鼠Tachyglossus aculeatus(4,15]。其他的例子包括啮齿动物,鲸鱼,食肉动物,灵长类动物(15,17]。

本研究的一个限制是不能补我们的结果与分子生物学方法建立缺乏SWS1视蛋白转录或存在SWS1假基因在基因组和功能措施ERG录音由于资金不足。这项研究的未来方向是使从直接观察行为的色觉测试酱油tricuspis。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢以西结a Caxton-Martins(台大学)在他巨大的贡献研究中,约书亚·r·Sanes——(哈佛大学)提供指导、实验室空间,抗体,和杰里米·凯Sanes——实验室的成员(哈佛大学)抗体染色的建议和帮助。Adejoke j . Adekanmbi支持旅行授予访问实验室MCB Josh Sanes——哈佛大学美国国际神经化学学会。

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