文摘

生物素是水溶性维生素所需的所有生物,但只合成了植物和某些细菌和真菌物种。作为辅助因子,生物素负责二氧化碳转移所有biotin-dependent羧化酶,包括乙酰辅酶a羧化酶、methylcrotonyl-CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶。添加生物素羧化酶所催化的酶holocarboxylase合成酶(高碳钢)。生物素也参与基因调控,有迹象表明,组蛋白可以在人类生物素化的。组蛋白蛋白质和大多数组蛋白修饰在真核生物中高度保守的。HCS1是唯一的功能生物素连接酶拟南芥并与人类高碳钢具有很高的同源性。因此,我们假设HCS1 biotinylates组蛋白蛋白质拟南芥。比较高碳钢的催化域蛋白在真核生物中,执行原核生物,古生菌,在选定的生物这个领域是高度保守的。生物素化的组蛋白不能被识别在活的有机体内用抗生物素蛋白沉淀或二维凝胶分析。然而,HCS1身体与之交互拟南芥组蛋白H3在体外的可能性,表明这种酶的作用在调节基因表达。

1。介绍

生物素是水溶性维生素b6,所需要的所有生物(1]。生物素的主要作用是为羧化酶(作为代数余子式2,3]。添加生物素羧化酶是催化由holocarboxylase合成酶(高碳钢)两步ATP-dependent反应(4]。基于BirA的晶体结构大肠杆菌高碳钢(3第一步),产生中间biotinyl-5′amp (B-AMP)。B-AMP然后转移到一个特定的赖氨酸残基的羧化酶的释放AMP (5]。五biotin-dependent蛋白在植物的特点3]。其中一个是生物素的蛋白质seed-specific SBP65存储(6,7]。其他四个都是羧化酶:homomeric乙酰辅酶a羧化酶,heteromeric乙酰辅酶a羧化酶,geranoyl-CoA羧化酶,methylcrotonyl-CoA羧化酶(8- - - - - -11]。这些酶是参与许多重要的代谢途径,如糖质新生,脂肪酸合成、和氨基酸分解代谢(3)(图1)。


图1
网络在植物生物素。原理图的地图与生物素代谢相关。代谢物的名字在黑色文本。红色箭头代表biotinylating行动biotin-dependent高碳钢的蛋白质。黑色的箭头代表其他代谢反应表现为植物。酶被直接生化证据在绿框阴影。Grey-dotted箭头表示人或反应的特点大肠杆菌但不是在工厂到目前为止。植物酶不确定但在人类或特征大肠杆菌在灰色框阴影。

生物素也参与基因调控12- - - - - -15),但在很大程度上是未知的机制。组蛋白生物素酰化的证据被报道在人类和这个修改是归因于高碳钢(16,17]。生物素化的组蛋白中建议增加有丝分裂DNA凝聚,异染色质形成、基因沉默、DNA修复(16,18,19]。这些数据表明,生物素可能参与人类改造组蛋白基因调控。组蛋白,组蛋白修饰大多是高度保守的20.];因此,植物可能使用一个类似的机制涉及生物素调节基因的表达。HCS1是唯一功能酶拟南芥对生物素结扎(21守恒的催化域与人类)和股票。因此,我们假设HCS1还biotinylates组蛋白在植物蛋白质。为了验证这个假设,我们使用两种方法:组蛋白生物素酰化改性的分析在活的有机体内谷胱甘肽S-transferase(销售税)下拉化验检测是否存在HCS1和之间的交互拟南芥组蛋白蛋白质在体外。生物素化的组蛋白不能被识别在活的有机体内抗生物素蛋白沉淀或二维(2 d)凝胶分析。然而,HCS1拉化验表明,HCS1专门与组蛋白H3结合蛋白质在体外。这些结果表明组蛋白的共价修饰生物素可能不是自然存在的拟南芥,尽管某些类型的物理HCS1与组蛋白可能发生相互作用。

2。结果

2.1。高碳钢的功能域蛋白是高度保守的

HCS1有两个可变剪接产生的蛋白亚型:HCS1-T(包含一个目标信号为叶绿体和线粒体定位)和HCS1-CY(不包含任何目标信号和细胞溶质的积累)(21]。HCS1-T和HCS1-CY分享两个蛋白质域:lipoate-protein连接酶A / B (BPL_lipA / B)和生物素蛋白连接酶C末端(BPL_C)。BPL_lipA / B是生物素的催化域结扎和最初确定的晶体结构BirA [22]。这个催化域(4,23]身份高(约30%)果蝇人类,大肠杆菌,海床abyssiGE5高碳钢蛋白质(图2)。具体来说,八个残留在BPL_lipA / B或域在选定的高碳钢高度保守的蛋白质(图2)。这八个残留直接接触生物素(22]。BPL_C域被认为与ATP和基板(24];在高碳钢蛋白质(图也是守恒的2)。在这个领域,两个图案Leu-Tyr-Tyr——(Arg /赖氨酸)和Pro-Asp-Gly-Asn-Ser-Phe-Asp真核生物中有很高的同源性,但不存在于原核生物和古生菌(图2)。这两个图案的功能仍然是未知的。Leu-Tyr-Tyr错义突变——(Arg /赖氨酸)最近被报道在人类高碳钢缺乏症患者(25];因此,高碳钢函数这个主题可能是重要的。


图2
多重序列比对高碳钢的蛋白质。高碳钢蛋白质的高度保守的序列在不同的生物体是一致使用CLUSTALX [27]。8个氨基酸由红框标记生物素结扎根据所需BirA晶体结构(22]。BPL_lipA / B和BPL_C域强调绿色和橙色,分别。ΔY663突变的位置在一个病人高碳钢缺乏症。
2.2。生物素化的组蛋白H3无法识别拟南芥用抗生物素蛋白沉淀分析

调查是否生物素化的组蛋白H3中存在拟南芥、总蛋白质被隔绝拟南芥并用于抗生物素蛋白沉淀。抗生物素蛋白沉淀后,蛋白质分离与我15% sds - page和探索125年链霉亲和素和组蛋白H3抗体,分别。西方印迹显示合成生物素化的总蛋白提取的蛋白质信号拟南芥(图3左面板,“输入”和“一口”车道)和高度的抗生物素蛋白沉淀积累的信号的位置生物素化的蛋白质(21)(图3左面板“美联社”lane)。消极的控制(卵白素珠子)(图没有显示出积极信号3左面板,“B”lane)。这一结果表明,生物素化的蛋白质沉淀成功。然而,当相同的沉淀与组蛋白H3抗体探测,未发现组蛋白H3蛋白质。结果意味着没有生物素化的组蛋白H3蛋白质被抗生物素蛋白沉淀珠子(图3、右面板“美联社”lane)。类似的实验重复下各种各样的免疫沉淀反应和免疫印迹的条件,但没有发现任何生物素化的组蛋白(26]。综上所述,这些数据表明,生物素化的组蛋白H3不能确定在一个扩展的降水分析,或生物素化的组蛋白H3太低的数量可以被探测到(16]。


图3
抗生物素蛋白沉淀化验。蛋白质样本15% sds - page分析。我125年链霉亲和素(左面板)和组蛋白H3抗体(右面板)被用于西方的屁股。输入:总蛋白提取拟南芥。B:空白控制,抗生物素蛋白用珠子只有释放缓冲区。一口:亲和素后上层清液珠被孵化拟南芥一夜之间溶菌产物。W1/2/3:上层的第一、第二和第三个孵化后单独洗。美联社:降水占总蛋白的亲和素珠子。ACC1: homomeric乙酰辅酶a羧化酶。MCC: methylcrotonyl-CoA羧化酶。BCCP1:生物素羧基载体protein1, heteromeric乙酰辅酶a羧化酶的一部分。BCCP2:生物素羧基载体实验研究,heteromeric乙酰辅酶a羧化酶的一部分。实验进行了一式三份。
2.3。生物素化的Core-Histones无法识别拟南芥使用二维凝胶分析

二维凝胶分析用于调查是否core-histones (H2A、H2B H3和H4)生物素化的拟南芥。Histone-enriched蛋白质被隔绝拟南芥由硫酸沉淀。相比,相同数量的总蛋白提取使用中性裂解缓冲(图4(一),“W”lane), histone-enriched蛋白质高度累积利用酸缓冲(图4(一),“H”lane)。商业小牛胸腺组蛋白被用作控制(图4(一)Ct“车道)。histone-enriched蛋白质受到pH值等电点聚焦使用梯度的9 - 12,在二维20% sds - page分离。生物素信号被检测到streptavidin-HRP(图4 (b));他们主要分布在右边(pH值~ 9),已知的地方拟南芥生物素化的蛋白质(biotin-dependent羧化酶)位于(所有这些酶是中性的蛋白质)。相比之下,当探测组蛋白蛋白质的位置用抗血清core-histones,大多数信号都集中在中心区域pH值(~ 10到11岁),组蛋白,所有基本的蛋白质,位于(图4 (b))。没有重叠位置之间可检测的信号这两个抗体。这表明没有core-histone蛋白质是生物素化的拟南芥。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
二维凝胶分析。(一)组蛋白蛋白质丰富拟南芥年轻的幼苗溶解产物和沾Coomassie蓝色。相同数量的总量和histone-enriched蛋白质分离15% sds - page及免疫印迹结果表明组蛋白蛋白质丰富拟南芥年轻的幼苗溶解产物。W:总分离出蛋白质。H: histone-enriched蛋白质。Ct:商业小牛胸腺组蛋白(σ)。(b) histone-enriched蛋白质20% sds - page分析与pH梯度从9到12。生物素信号集中在酸碱9与core-histones信号之间分配10到11。实验进行了一式三份。

2.4。HCS1与拟南芥组蛋白H3直接在体外

确定是否HCS1身体与组蛋白相互作用蛋白,一个销售税拉试验。总RNA制备拟南芥整个幼苗,全身组蛋白H3和HCS1RNA序列被放大的获得组蛋白H3(AT1G09200)和HCS1(AT2G25710) transcript-specific引物。的长篇HCS1cDNA克隆成pGEX4T向量的全长cDNA (GST-tagged)和拟南芥组蛋白H3克隆到pDEST17向量(His-tagged)。改造后每个向量大肠杆菌,GST-HCS1 His-histone H3蛋白质被异丙基诱导表达β- - - - - -d-thiogalactoside (IPTG)或L-arabinose(图5(一个))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
HCS1与拟南芥组蛋白H3直接在体外。大肠杆菌行包含GST-HCS1、His-H3或销售税构造这些基因被诱导表达。感应后,总蛋白从细胞中提取行。重组His-histone H3蛋白质纯化大肠杆菌通过使用金属亲和色谱法。纯化重组GST-HCS1独自或销售税大肠杆菌通过使用glutathione-sepharose珠子。蛋白质受到销售税拉化验独自GST-HCS1或销售税,探索通过免疫印迹检测是否存在HCS1和组蛋白H3之间的交互。(a)蛋白质sds - page分析了15%,沾Coomassie蓝色。我:总蛋白提取大肠杆菌包含GST-HCS1或His-H3构造。C:总蛋白提取的控制大肠杆菌(不包含任何向量)。P:重组GST-HCS1或重组His-H3蛋白质。(b)销售税下拉后的蛋白质免疫印迹检测是否存在HCS1和组蛋白H3之间的交互。GST-HSC1融合蛋白和销售税和销售税抗体检测;组蛋白H3与相应的抗体检测。GST-HCS1:蛋白质释放的珠子被孵化后加上GST-HCS1 His-histone H3蛋白质;组蛋白H3发现GST-HCS1所拖累。销售税:蛋白质释放珠子加上销售税控制孵化后His-histone H3蛋白质;没有发现组蛋白H3。输入His-H3:输入His-histone H3重组蛋白质总数的10%; Histone H3 was strongly detected as expected. Experiments were conducted in triplicate.

一个销售税拉试验,重组蛋白的纯化大肠杆菌使用谷胱甘肽珠子或金属亲和色谱法。在这个分析,蛋白质纯化GST-HCS1孵化与glutathione-sepharose珠子1小时之后添加His-Histone H3蛋白质。在4°C隔夜孵化后,珠被广泛分析缓冲区(10毫米玫瑰,100毫米氯化钠和10毫米β巯基乙醇,pH值7.0)和2 x resuspended SDS加载缓冲区。沸腾和离心后,上清液由15% sds - page分离。每个样本中的蛋白质分离15% sds - page和转移到膜。膜切成两个,上面部分包含蛋白质~ 20 kD ~ 110 kD和底部包含蛋白质~ 6 kD ~ 20 kD。上面部分是探索销售税抗体来检测任何销售税或GST-fusion蛋白质GST-HCS1;底部是探测与组蛋白H3抗体。结果西方墨迹显示His-histone GST-HCS1融合蛋白H3蛋白质是推倒,但不是通过销售税蛋白质控制(图5 (b)),这表明HCS1专门与拟南芥组蛋白H3在体外。

3所示。讨论

史蒂文·斯坦利等人首次发现,人类可能组蛋白修饰的生物素(16]。生物素化的网站被确定H2A(赖氨酸9、13、125、127、129),H3(赖氨酸4 9和18)和H4(赖氨酸8 - 12)28- - - - - -31日]。与其他组蛋白修饰,生物素酰化的组蛋白的水平改变多种细胞过程中16,18,19]。组蛋白已报告被人类的高碳钢,生物素化的人类biotinidase,大肠杆菌BirA在体外(17,29日,32,33),但只有人类高碳钢在活的有机体内(17]。Biotinidase所需的是一种酶回收从生物胞素生物素(lysine-biotin复杂),这对动物是至关重要的,但没有被确认在植物(34]。在拟南芥,HCS1是唯一已知的候选功能可能biotinylate组蛋白生物素连接酶。

蛋白质比对表明BPL_lipA / B,高碳钢蛋白质的催化域,是高度保守的拟南芥,果蝇人类,大肠杆菌,海床abyssiGE5。在反应规范化,BPL_lipA / B催化生物素酰化在一个特定的赖氨酸残基上每个biotin-dependent羧化酶(1,29日]。这赖氨酸残基定位在一个高度保守的Ala-Met-Lys-Met主题(29日),每个biotin-dependent羧化酶具有只有一个特定的生物素酰化赖氨酸残留物。相反,在组蛋白,生物素化的赖氨酸残基中没有一个一致的区域,和组蛋白蛋白质通常有多个生物素化的网站(28- - - - - -31日]。这表明,一个新颖的机制可能是用于高碳钢biotinylates组蛋白。在体外实验表明,人类高碳钢或大肠杆菌BirA催化生物素到AMP B-AMP。令人惊讶的是,B-AMP可以被附加到重组人类H2A自动不需要酶(31日]。高碳钢由于同源性较高的催化域之间拟南芥、人类和大肠杆菌,我们假设HCS1也biotinylate拟南芥组蛋白H3在体外自动。我们的研究表明,HCS1确实与拟南芥组蛋白H3在体外(图4),在一定程度上验证我们的假设。

免疫荧光的研究表明,大多数人类高碳钢细胞核而不是细胞溶质的;因此,如果作用于组蛋白在人类,它可能会采取行动原位在细胞核17]。拟南芥HCS1有两个蛋白亚型:HCS1-T和HCS1-CY21]。HCS1-T过程双重目标信号为叶绿体和线粒体定位,而HCS1-CY只在细胞溶质积累没有任何目标特征信号(21]。因此,如果任何高碳钢/生物素和组蛋白发生相互作用拟南芥修改可能会发生在细胞溶质,之前出口的组蛋白核。

认为人类拥有生物素化的组蛋白最近质疑(35,36]。三个独立的方法,3H]生物素吸收、免疫印迹和质谱分析,用于复核人的组蛋白生物素酰化的发生(35,36]。使用每个方法,生物素化的组蛋白可以被识别在体外实验,但没有发现任何在活的有机体内实验。甚至研究小组成员,最初报道生物素化的组蛋白怀疑自己的结果,发现avidin-HRP探针用于验证生物素化的组蛋白在活的有机体内可能不可靠的(35]。研究人员还测试了BirA能否biotinylate重组体人组蛋白H2A大肠杆菌通过增加大量radioactive-labeled生物素提供给媒体。虽然从p - 67放射性信号(biotin-acceptor蛋白质作为控制)很容易检测到,没有生物素化的重组H2A确认(未发表的数据)。这些研究表明,应注意检测生物素化的组蛋白。

因此,到目前为止它一直具有挑战性的检测生物素化的组蛋白与人隔离(35]或拟南芥(本研究)。然而,HCS1本身并相互作用拟南芥组蛋白H3在体外。如果HCS1 /生物素与组蛋白相互作用拟南芥体内,可能涉及的交互机制不同于羧化酶的共价生物素酰化发生。理解这样的交互可以提供洞察如何通过生物素化的组蛋白生物素调节基因表达,而不是。

4所示。材料和方法

4.1。植物材料

拟南芥种子是surface-sterilized并分发到固体介质女士。固体介质女士在培养皿中包含4.3 g / L MS (Murashige和斯盐),1 x维生素B5 (100μg / mL肌醇,1μ克/毫升盐酸吡哆醇,1μ克/毫升烟酸和10μ克/毫升盐酸硫胺素)和0.6% (w / v)琼脂凝胶,缓冲在pH值为5.7与2.56毫米MES (37]。经过两周的增长,拟南芥收集整个幼苗RNA制备和histone-enriched蛋白分离。

4.2。克隆全长的组蛋白H3和HCS1蛋白质

总RNA制备拟南芥整个幼苗。后试剂盒(表达载体)提取,第一链的互补是由上标二世逆转录酶(英杰公司)与低聚糖dT底漆根据制造商的指示。PCR片段对应组蛋白H3(AT1G09200)和HCS1(AT2G25710)放大与表中列出的引物1。

表1
用于rt - pcr引物。
4.3。超表达的重组His-Histone H3和GST-HCS1蛋白质

放大PCR片段为组蛋白H3被克隆到一个输入向量pENTR / SD / D-TOPO,当时重组一个二进制向量pDEST17 [38]。His-histone H3的构造被测序和转化为验证大肠杆菌BL21 (AI)株(表达载体)。4小时后通过增加L-arabinose感应大肠杆菌文化传媒、总蛋白15% sds - page分离(39]。

放大PCR片段为HCS1与EcoRI和XhoI消化。然后他们被绑定到相应的消化网站pGEX4T向量。的构造GST-HCS1被测序验证,变成了大肠杆菌BL21 (DE3)菌株。4小时后通过增加IPTG诱导大肠杆菌文化传媒、总蛋白15% sds - page分离(39]。

4.4。纯化的重组His-Histone H3和GST-HCS1蛋白质

大肠杆菌细胞BL21(人工智能或DE3)生长在1 L烧瓶的吸光度OD 0.5。细胞颗粒状,洗,细胞溶解消散缓冲区(溶菌酶100 mg / L,德勤10毫米,1毫米PMSF和1% Triton PBS缓冲)(40,41]。原油溶解产物的GST-HCS1耦合glutathione-sepharose珠子(σ)。在4°C隔夜孵化后,珠子是洗广泛与PBS缓冲(2.7毫米137毫米氯化钠,氯化钾,10毫米磷酸氢二钠,磷酸氢钾和2毫米,pH值7.5)。与洗脱缓冲GST-HCS1重组蛋白被释放(10毫米三、150毫米氯化钠和20毫米减少谷胱甘肽,pH值7.5)和15% sds - page分离。His-histone H3蛋白质纯化了重组Ni-NTA珠子(Novagen)按照制造商的指示和15% sds - page分离。

4.5。抗生物素蛋白沉淀化验

拟南芥整个幼苗在均质提取缓冲(20毫米Tris-HCl pH值8.0,10毫米EDTA, EGTA 1毫米,150毫米氯化钠,2毫米Na3签证官4NP-40 Triton x - 100年,0.2%,0.2%,和1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物)。混合解决方案是用三次,然后在16000 g离心10分钟4°C。250年μL上层清液与NeutrAvidin孵化珠子(热科学),洗过两次与洗缓冲区(SDS在PBS NP-40 1%, 0.1%)和PBS(两次42]。每次孵化后离心分离或洗涤步骤树脂颗粒状的100 g 30年代。在4°C隔夜孵化后,上层清液被除去,树脂与缓冲洗一洗一次额外的时间和清洗缓冲B (0.4 M氯化钠在清洗缓冲),最后一次50 mM Tris-HCl, pH值7.5。要洗提生物素化的蛋白质,50μL释放缓冲区(2% SDS、30 mM的生物素,50 mM磷酸盐、100毫米氯化钠,6毫米尿素,2 M硫脲)被添加到树脂,然后在RT孵化15分钟,15分钟在96°C。后来,树脂颗粒状通过离心5分钟在16000 g和得到的上层清液收集和15% sds - page分离。膜时探测的主要抗体组蛋白H3(爱荷华州立大学),抗体稀释1:500年和5000年二次抗体稀释1:。信号频带被发现与西方闪电后化学发光试剂(珀金埃尔默Inc .)膜被我探索125年链霉亲和素(8.0×105cpm),放射性标记的信号被检测到使用台风扫描仪(GE)。

4.6。制备Histone-Enriched蛋白质拟南芥整个幼苗

经过两周的增长,拟南芥整个幼苗被切除,均质均化缓冲(1米Tris-HCl pH值9.5,0.5米的pH值8.0 EDTA, 1 M氯化钾,1 M蔗糖,0.1% (v / v) 2-mercaptoethanol,和1米精胺)(43]。均相溶液通过纱布过滤。特里同x - 100后添加到最终的浓度1% (v / v),滤液被设置在冰上10分钟。在1800 g离心10分钟后在4°C,颗粒一直和resuspended 5毫升同质化缓冲区。离心后在4°C 1800 g 8分钟,球一直和resuspended 5毫升裂解缓冲(10毫米pH值7.9消息灵通的,1.5毫米MgCl2德勤,氯化钾10毫米,0.5毫米,1.5毫米PMSF;PMSF和德勤之前添加使用)。2 M H2所以4被加入到溶解产物一滴一滴地最后一个0.4米的浓度。在冰上孵化1小时后,混合溶液在13000转离心10分钟4°C。与三氯乙酸提取上清液和沉淀,最终浓度为20%。设置在冰上30分钟后,样本在13000转离心20分钟在4°C,以及颗粒与冷丙酮洗干一夜之间在4°C。

4.7。二维凝胶电泳

Histone-enriched蛋白质(150μg)和补液缓冲区(8 M尿素,2%的皮套裤,20毫米德勤,0.5% IPG缓冲区,和痕量溴酚蓝)250年第四卷μL, pH值条装上13厘米(pH值9 - 12)。条被患者为2小时20°C,和第一个维度等电点聚焦是由使用能源论坛IPGphor合作系统(Amersham-Pharmacia生物技术):20 V 10小时,1小时100 V, 500 V为1小时,1小时1000 V, 2500 V为1小时,最后8000 V,直到总人力资源达到至少80000。二维电泳之前,带平衡与温柔摇30分钟在SDS平衡缓冲(50毫米Tris-HCl pH值8.0,6 M尿素,3% (w / v) SDS, 20% (v / v)甘油和0.125% (v / v)集中tributylphosphine)。平衡后,条放在顶部的20% SDS - page凝胶和琼脂糖封密封解决方案(0.5% (w / v)琼脂糖在SDS缓冲加几粒溴酚蓝)。免疫印迹分析,主要抗体streptavidin-HRP (Biosignaling)和core-histones (Abcam)稀释1:100和1:1000年,分别。二次抗体稀释1:5000。信号频带与西方闪电化学发光检测试剂(珀金埃尔默公司)。

4.8。销售税拉化验

蛋白质纯化GST-HCS1最先孵化与glutathione-sepharose珠子1小时在4°C,然后5μg His-Histone H3蛋白质被添加。在4°C隔夜孵化后,珠被广泛分析缓冲区(10毫米玫瑰,100毫米氯化钠和10毫米β巯基乙醇,pH值7.0)和2 x resuspended SDS加载缓冲区。沸腾和离心后,上清液由15% sds - page分离。免疫印迹分析,主要抗体的销售税和组蛋白H3(圣克鲁斯生物技术)稀释1:1000和二次抗体稀释1:5000。信号频带与西方闪电化学发光检测试剂(珀金埃尔默公司)。

利益冲突

作者声明没有利益冲突的行为和报告工作。