临床分离菌株全基因组序列的比较分析人类副流感病毒4B

摘要

我们从事空气传播和呼吸道病原体的流行病学研究，特别感兴趣人类副流感病毒病毒类型4 (hPIV-4)和其他研究较少的病毒。在本文中，从一名患有轻微上呼吸道疾病的儿童的鼻咽拭子材料中接种原代猕猴肾(PRMK)细胞，检测到hPIV-4。在纯培养中分离病毒的尝试因PRMK细胞中存在一种快速生长的猿类spumavirus而受阻。从PRMK细胞培养物中提取总RNA，进行PCR，然后对其亚基因组切片进行测序融合蛋白基因提示hPIV-4为4B亚型。在进行这项工作时，其他人已经在GenBank中保存了两个完整但不同的hPIV-4B基因组。为了更好地了解hPIV-4B病毒，以及我们正在为病毒取证开发的测试方法，我们从存档的RNA中确定了病毒的整个基因组序列。我们确定的hPIV-4B基因组序列符合副粘病毒的“六规则”。在这里，我们比较和对比了目前存在于GenBank的三个完全测序的hPIV-4B基因组的遗传特征。

人类副流感病毒(hPIVs)是单链，负意义的RNA病毒属Rubulavirus、家庭副黏液病毒科它会导致儿童和成人的急性呼吸道感染。已经确定了四种hPIV血清型(hPIV 1-4);血清型4进一步细分为两个抗原亚型:4A和4B [1，2］．hPIV 1-3的流行病学和临床表现众所周知，而对hpiv4的了解相对较少，因为hpiv4难以在细胞培养中分离，且在大多数临床病毒学实验室缺乏常规呼吸道病毒检测试验[3.- - - - - -5］．虽然hpiv4病毒以前主要与年轻人的轻微呼吸道疾病有关，但最近的研究显示，这种病毒可导致更严重的感染，例如在年轻人和老年人中引发肺炎(见[3.- - - - - -5])。

hPIV-4亚型4A和B的基因组crna长度略小于>17.0 kbp。它们的病毒基因组编码核衣壳(NP)、磷(P)、非结构(V)、基质(M)、融合(F)、血凝素-神经氨酸酶(HN)和大(L)蛋白。在这项工作之前，GenBank中有两个完整的hPIV-4B序列:菌株68-333的序列[6]和SKPIV-4 [7］．

在美国的许多诊断微生物实验室中，用适当的标本接种原代猴肾(PMK)细胞以检测人类副流感病毒。这些诊断实验室可用的PMK细胞通常从各种各样的细胞中提取Chlorocebus或亚洲猕猴种，含有多种肾细胞类型的混合物。此外，PMK细胞可以包含内源性猴病毒，这些病毒或潜伏在肾脏中，或导致宿主持续但不明显的肾脏感染。它们在PMK培养物中的存在通常在细胞在培养物中维持几天以上后变得明显。无论如何，经验表明，通过临床标本检测人类副流感病毒的可能性在体外与诊断病毒学实验室常用的细胞系不同，用PMK细胞进行病毒培养效果更好。

这项工作中分析的病毒来自于芝加哥的一名两岁儿童，该儿童在采集标本时患有轻度上呼吸道感染，持续了两天(2004年10月)。在采集标本时，患者的症状包括流鼻涕、干咳、低烧和食欲减退。将患者鼻咽拭子标本用通用病毒运输培养基(BD, NJ, USA)洗脱，并将等量的溶解物接种到A549、MDCK、WI38和恒河PMK细胞中，并在35℃下接种。PMK细胞培养基中含有抗PIV5和SV40的抗体。采用检测PIV-1、-2、-3、a、B流感病毒、腺病毒和RSV的商业试剂盒(Respiratory Panel 1 DFA kit, Millipore, Billerica, MA, USA)，在p.i. 24小时和72小时，用直接免疫荧光法(DFA)检测培养物呈阴性。然而，使用fitc标记的抗piv -4抗体(目录项目编号:。5034，微孔)，散发的PMK细胞(其他细胞没有)在24小时和72小时p.i呈交界性阳性，表现出特征性的点状胞浆内染色。不幸的是，在PMK培养72小时后，约30%的PMK细胞明显出现大液泡和广泛的细胞退化(包括阴性对照)，表明PMK培养中存在污染病毒。因此，从感染hpiv - 4b的PMK培养中提取aliquot，并接种到NCI-292、Vero、LLC-MK2或CV-1细胞中，希望在不受污染病毒感染的细胞中分离出hPIV-4病毒。随后，将RNA稳定溶液(RNAlater, Ambion, Austin, TX, USA)添加到PMK细胞中，如前所述纯化总RNA [8， RNA在−80°C下存档。分离hPIV-4的尝试没有成功;该污染物被鉴定为VI组spumavirus (foam retrovirus)(数据未显示)，在接种NCI-292、Vero、LLC-MK2或CV-1细胞24小时后引起广泛的CPE(大液泡)，所有培养终止。

利用引物Para4-F (5 ' -catgggtgtcaaaggtttatc-3 ')和Para4-R (5 ' -tgctgctgtaacttgtgcagc-3 ')两步反转录PCR扩增HPIV-4的376碱基对片段F基因(8］．扩增子测序显示该病毒可能为hPIV-4B。由于2004年还没有hPIV-4B的完整基因组序列可供比较，而且我们的重点集中在其他病毒上，因此进一步的分析被推迟，直到有一个合适的时间来制定适合hPIV-4B的测序策略。

在两个独立的hPIV-4B序列被保存到GenBank后，我们重新开始了测序工作。在我们的工作中，靶向hPIV-4B序列是使用基因组行走方法从存档的RNA中进行rt - pcr扩增的。重叠引物见[6，7]和我们为我们的任务设计的其他目的用于PCR扩增和测序。Superscript II逆转录酶(Life Technologies)在SUPERase-In RNase inhibitor (Ambion)和高保真Platinum的存在下进行cDNA第一链的合成Taq采用DNA聚合酶(Life Technologies)进行PCR。根据制造商的说明，使用RACE (cDNA末端快速扩增)试剂盒(RLM RACE, Ambion, Austin, TX)从vRNA中测定病毒基因组的3 '和5 '末端。值得注意的是，确定病毒基因组的3 '和5 '端序列的工作是艰苦的;使用纯化病毒颗粒产生的病毒基因组，这些任务更简单。序列使用Applied Biosystem 3130 DNA分析仪直接分析，使用大染料终结者(3.1节)化学和用于扩增的相同的寡核苷酸引物。病毒序列命名为hpiv - 4b04 -13(“04-13”表示“异常”分离株。2004年第13号)。

完整的hpiv - 4b04 -13 cRNA为17304 bp，因此符合副粘病毒的“6规则”，因为它能被6整除。BLAST全基因组分析显示，与hPIV-4B株68-333和hPIV-4B株SKPIV-4的同源性分别为98%和97%。hPIV-4B株SKPIV-4、68-333和04-13的关键遗传特征见表1．

从hPIV-4B分离物04-13中推断出的F、H-N、L、M、NP和P的氨基酸序列与该属其他7个成员的同源序列进行了比对Rubulavirus和属的2个成员Avulavirus．使用Mafft 5.8进行序列比对[9]，然后在ClustalW中进行少量手动调整[10］．采用E-INS-I比对策略，参数如下:评分矩阵(BLOSUM62)、间隙打开惩罚(1.53)和偏移值(0)。对每个基因比对，序列在分析前先修剪到5 '和3 '端第一个保守氨基酸。为了评估基因一致性，对每个基因分别进行贝叶斯分析。使用MrBayes v. 3.1.2构建系统发育树[11］．混合先验用于氨基酸模型，默认先验用于拓扑和分支长度。马尔可夫链最多运行了1000万代，并执行了停止规则，以便当分裂频率的平均偏差<0.001%时，分析将停止。进行了四次独立的分析，每一次都有1个冷链和3个加热链，默认加热参数(温度= 0.2)。每50代被取样，前25%的MCMC样本被丢弃为老化。

初步的系统发育分析表明，个体基因树之间只有一个显著的不一致(定义为存在不相容的双分区，其后验概率分别为>90%)。这种不一致包括米-支持先前观察到的腮腺炎病毒分支模式的基因分析[11］．因此，在最后的分析中，我们将6个基因的序列连接到1个矩阵中。该数据集包含10个病毒类群的4442个氨基酸特征(含空白)。6基因级联贝叶斯分析结果显示，hBIV4B分离株04-13与hPIV-4B分离株68-333亲缘关系最为密切，hPIV-4B分离株SKPIV4与另外两株分离株为姐妹组(图)1)．人类副流感病毒病毒4A被发现是hPIV-4B分离株的姐妹组。hPIV4进化支被发现是第二个进化支的姐妹群Rubulavirus由腮腺炎病毒、猿猴病毒5、猿猴病毒41和人类副流感病毒2组成的分支。

图1

Rubulavirus Avulavirus 新城鸡瘟病毒 禽副粘病毒6 腮腺炎病毒 人类副流感病毒2 猴病毒 猴病毒5 人类副流感病毒4A hPIV-4B分离物04-13与该属具有代表性的成员之间的系统发育图．基于F、H-N、L、M、NP和P蛋白的氨基酸序列串联而成的树(4442个氨基酸包括缝隙)。属的成员（；NDV和；APMV6)作为外组。所有节点的后验概率均为100。分支长度是基于推断替换的数量，如量表所示。从NDV全基因组序列中获得基因序列(RefSeq accession no.;NC_002617), APMV6 (NC_003043),（米uV;NC_002200),（HPIV2;NC_003443),41（SV41;NC_006428),（SV5;NC_006430),（HPIV4A;加入基因库。AB543336), hPIV-4B (04-13;AB543337, 68 - 333;JQ241176 SKPIV4;EU627591)。

我们的基因组水平系统发育分析结果与之前对该属的分析一致Rubulavirus［6，7，12］．正如Yea等人指出的[7]， SKPIV-4的基因组不遵循副粘病毒的“六规则”。这并不是一个排序错误;偶尔会遇到违反这一规则的副粘病毒基因组([7[， J. Lednicky，未出版)。因此，确定hPIV-4B基因组是否存在“异常长度”(即，在从病人身上分离出来的病毒中，那些长度不能被6整除的基因组与临床表现有关，也与诊断实验室用于检测病毒的灵长类细胞中hPIV-4B的传代是否导致基因组改变有关。

承认

作者感谢James F. Wellehan博士，m.s.， Ph.D. DACZM, DACVM，佛罗里达大学兽医学院，Gainesville，对副粘病毒系统发育分析的建议和对本文的评论。

参考文献

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