文摘

逆转录病毒和慢病毒载体已被证明是特别有效的系统提供感兴趣的基因进入靶细胞,体内或细胞培养。他们已经使用了一段时间的基因治疗和基因疫苗的开发。最近逆转录病毒和慢病毒载体用于产生耐受性树突状细胞,关键专业的抗原呈递细胞,调节免疫反应。因此,三个主要方法已开展诱导免疫耐受;提供强有力的免疫抑制细胞因子和其他分子、修改树突细胞的胞内信号通路和de-targeting转基因表达使用微技术从树突细胞。综述我们简要描述逆转录病毒和慢病毒载体生物学,和他们的应用程序来诱导免疫耐受。

1。介绍

病毒是专性细胞内寄生虫的进化遗传物质转移到感染细胞和使用他们的生物合成的机械复制,使壳体化和包装他们的基因组。病毒粒子通常分泌,这样他们就可以感染邻近细胞并开始一个新的感染周期。发现病毒也可以吸收和传递基因的细胞起源的可能性打开使用它们作为工具,基因修饰细胞。病毒向量的工程使得基因疫苗的发展广泛的传染病和癌症。它比较容易提高有效的免疫反应对转基因病毒编码的向量。毕竟,先天免疫系统包含所有必要的机制来识别病毒颗粒导致其强大和迅速激活。因此,病毒粒子作为“自然”佐剂。然而,激活免疫系统的能力限制的适用性自身免疫性疾病的治疗。此外,他们的应用程序的修正基因疾病也是有限的,因为他们的免疫原性。Transgene-specific免疫反应严重限制了基因治疗的成功。 However, despite all disadvantages, virus vectors have been used to establish strong antigen-specific immune suppression. This has been achieved by the expression of immunosuppressive cytokines, modulators of intracellular signalling pathways, and the incorporation of microRNA targets.

2。逆转录病毒和慢病毒载体

有一个日益增长的不同病毒物种列表被用作病毒载体。中,使用最广泛的是腺病毒、腺相关病毒、痘病毒。有趣的是,那些属于Retroviridae家庭内可能是最成功的。逆转录病毒载体,如那些基于Moloney小鼠白血病病毒(MLV)在第一工程(1]。他们也是第一个被成功地应用在人类基因治疗遗传病的校正2- - - - - -5]。近年来,lentivectors强烈出现在生物医学作为替代γ逆转录病毒载体。逆转录病毒的堂兄弟,lentivectors缺乏病毒蛋白,稳定他们的基因组合并到宿主细胞,并导致长期的转基因表达。此外,不同于简单的逆转录病毒,他们可以转换:细胞(6]。这个特征打开他们的应用程序在基因治疗基因目标高度分化的细胞神经元和树突状细胞等。

Retroviridae家族由球形病毒(80 - 120海里)包含一个二倍体、积极意义ssRNA [7,8)(图1)。核衣壳蛋白的RNA基因组是包裹(NC)和绑定到逆转录酶(RT)、整合酶和蛋白酶(PR)。核衣壳是封闭在一个蛋白质衣壳蛋白形成的壳(CA)。然后,基质蛋白(MA)环绕这个内部核心,与病毒粒子交互的脂质包膜,包含病毒包膜糖蛋白(ENV)。ENV由TM(跨膜)和SU(表面)领域,这与细胞受体结合介导病毒粒子条目。


图1
retrovirion的总体结构。retrovirion的结构示意图所示图。逆转录病毒包含一个二倍体RNA基因组相关的核衣壳蛋白(NC),形成核衣壳。这个核衣壳结构蛋白参与retrotranscription关联(RT)、集成(整合酶,)和病毒粒子成熟(蛋白酶、公关)。所有这些都是封闭式的衣壳(CA)和基质蛋白(MA)。然后,病毒粒子信封包含核心,包含包膜糖蛋白。逆转录病毒和慢病毒的包膜蛋白的跨膜(TM)和球状亚基(SU)。

3所示。逆转录病毒基因组和矢量工程

病毒从Retroviridae家庭通常分为两组,简单(如Moloney小鼠白血病病毒、MLV),和复杂(如慢病毒)逆转录病毒。在任何情况下,两组的基因组组织在许多方面是相似的。在两组中,基因组组织从5′,3′端呕吐,波尔,ENV基因。而呕吐编码结构蛋白,波尔整合酶,编码逆转录酶和蛋白酶ENV编码病毒包膜糖蛋白负责病毒粒子进入靶细胞。这些酶都需要基因组retro-transcription cDNA、集成和成熟病毒粒子(9]。复杂的基因逆转录病毒还包含其他配件,控制病毒复制,装配,和发病机理9- - - - - -13]。其他额外的复杂的基因逆转录病毒RNA包装等重要cis-acting序列信号(ψ)[14基因在病毒衣壳化(所需)15),polypurine道(PPT)逆转录所需16,17),和长末端重复(公升)含有艾滋病毒启动子(18- - - - - -20.]。

4所示。逆转录病毒的生命周期和逆转录病毒载体

普通逆转录病毒(包括慢病毒)生命周期示意图描述图2。逆转录病毒病毒粒子结合其特定的细胞表面受体通过ENV单位。这种交互将决定特定病毒的细胞和组织取向。逆转录病毒生物学相当知名,大数量的这些受体的身份。逆转录病毒的细胞受体小鼠阳离子氨基酸转运体和钠/磷酸同向转运不同菌株的小鼠白血病病毒(MLV) [21]。在hiv - 1的情况下,其受体T细胞CD4淋巴细胞标记,和趋化因子受体CXCR4与CCR5 coreceptors [22- - - - - -24]。


图2
逆转录病毒的一般生命周期/慢病毒。慢病毒生命周期示意图在这个图。首先,病毒可以通过内吞作用进入细胞后直接与细胞膜融合绑定到特定的受体(图)的顶部。然后,逆转录病毒核心释放(核心版)和逆转录。包含互补脱氧核糖核酸病毒基因组的核心是运送到细胞核,它整合到宿主细胞的染色体(前病毒整合)。原病毒的转录发生导致传输的完整的RNA基因组,或信使RNA编码的结构和酶蛋白(翻译)。结构蛋白包完整的RNA基因组在病毒粒子萌芽(见图右),释放病毒粒子成熟后传染性病毒。

绑定的苏诱发ENV暴露其融合肽构象的变化,导致病毒粒子之间的融合和细胞膜导致逆转录病毒核心的释放到细胞质中。这个版本触发逆转录病毒基因组的逆转录反应,可能通过增加核苷酸浓度(19,25]。

病毒核心包含一个双链的互补脱氧核糖核酸复制基因组RNA是运送到细胞核后整合到宿主细胞染色体整合酶的活性(在)。而简单的γ逆转录病毒需要核膜的消失在细胞分裂过程中,复杂的逆转录病毒(慢病毒)可以主动运输的核心细胞核不需要有丝分裂(26,27]。因此,只逆转录病毒载体转导细胞在有丝分裂期间,虽然慢病毒载体可以独立转导细胞分裂状态。这个特点使得慢病毒载体基因治疗的理想高度分化,postmitotic细胞。

一旦互补dna整合到宿主细胞的染色体,它仍有病毒。这个前病毒转录基因其LTR使用细胞RNA聚合酶II和细胞转录因子。这前病毒也会保持单元中集成在整个生命,传播到子细胞有丝分裂。

标准转录机器后,信使RNA编码完整的病毒RNA,并拼接版本编码病毒蛋白,生产,运输出细胞核,细胞质和翻译。病毒粒子将由特定的RNA基因组之间的相互作用和呕吐/ GAG pol多蛋白。这些RNA的包装是伴随着病毒装配和释放的细胞病毒出芽。这个萌芽发生在细胞膜,ENV糖蛋白也整合到出芽病毒粒子(28- - - - - -32]。一旦病毒粒子释放,病毒蛋白酶将发挥其活动呕吐/ GAG pol多蛋白,释放结构蛋白,赋予新成立的传染性病毒粒子(6,33]。

由于历史原因,Moloney MLV已广泛用于综合发展的基因向量(1]。工程师根据MLV基因组一个向量,呕吐,波尔,ENV感兴趣的基因删除包括一个基因(转录控制下的病毒LTR),或一个表达盒的启动子的选择感兴趣的基因(1]。生成包含传递向量的向量粒子本身,病毒蛋白的呕吐,波尔和ENV提供在反式在一个包装单元1,34]。此外,一些序列是必需的在独联体如5′和3′LTR包装信号,其他也参与在逆转录和基因组整合。Cotransfection这些包装质粒将产生逆转录病毒/ lentivirus-like粒子与包装矢量基因组。因此,细胞进入和集成后,这些向量无法重新组装和生产传染性病毒粒子,缺乏gag pol基因。因此,一旦整合,他们就会表达的感兴趣的基因传播到子代细胞。描绘lentivector工程系统方案图所示3。


图3
lentivector基因转移系统的工程。hiv - 1基因组织显示在顶部,从5′,3′,长末端重复(LTR),包装信号(PS),GAG-PRO-POL——基因,信封基因(ENV),附件的基因Vif,冲程体积,牧师,答,Nef,Rev-response元素(RRE)。这个基因组分为三个不同的质粒结构。传递向量(矢量),包含至少LTR, PS,内部启动子控制基因的转录。包装质粒,这导致的表达GAG-POL-PRO-IN,牧师,答基因的控制下巨细胞病毒(CMV)启动子。最后,信封质粒表达所需的包膜糖蛋白将授予向量粒子的取向。Cotransfection这三个质粒将导致lentivirus-like粒子的生产能力的独立电转换靶细胞的细胞周期。

虽然简单的逆转录病毒载体的优点是genome-encoded病毒蛋白质的缺乏和持续的基因表达向量集成后,他们也存在重要的局限性。主要的是病毒粒子不稳定(35),相对较低的浓度(36),无法转换静止细胞(27,37),最后,插入突变(38- - - - - -40]。有趣的是,使用lentivectors可以很大程度上克服这些缺点,主要是由人类免疫缺陷病毒(HIV) 1 (41- - - - - -43]。然而,使用lentivectors的主要优势是他们转导静止细胞的能力(27]。这至关重要的特征是由核本地化序列中整合酶蛋白基质蛋白,冲程体积,PPT序列(12,17,42]。具体步骤生成lentivectors,他们广泛不同的“代”和他们的生物安全(其它地方描述的那样6,44]。

5。免疫耐受

我们的生物体不断在直接接触一个广泛的各种各样的物质,粒子和生物多样化的起源。虽然许多这些组成一个潜在的病原体,绝大多数的他们,包括共生的细菌、花粉、酵母、螨虫,许多类型的化学物质在很大程度上是无害的。因此,在第一个实例默认这些抗原免疫反应是宽容和反应迟钝。此外,如果一个潜在的病原体引发的免疫反应是/威胁,autoprotective机制存在间接伤害和损失降到最低的宽容生物体自身的组件(自身抗原)。

因此,有很多关键的生理机制,维持免疫耐受。最重要的是克隆删除autoreactive胸腺中T淋巴细胞(45]。T淋巴细胞暴露T细胞受体(tcr)特定为特定的表面抗原。当同源抗原呈现这些T细胞,他们强烈增殖并激活效应的活动,例如,细胞毒性(图4)。然而,克隆删除无法消除所有autoreactive T细胞,或者至少T细胞特定的抗原,从未出现在胸腺。这一事实是表现在自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化症、或糖尿病,宽容对自体抗原丢失。这些抗原被B和T淋巴细胞,发挥其效应活动与戏剧性的结果(46- - - - - -51]。


图4
抗原表达和T细胞反应。激活T细胞反应的抗原呈递树突细胞图所示。在左边,一个直流呈现相关抗原肽MHC I(球体包含“我”)或MHC II(球体包含“II”)分子。CD8和CD4 T细胞识别这些peptide-MHC分子一起额外receptor-ligand交互(聚集有关,由酒吧连接直流与每个T细胞)。这些交互伴随着各种细胞因子的存在将导致T细胞增殖(右)。CD8 T细胞将分化成细胞毒性T淋巴细胞和CD4 T细胞辅助T细胞将合作在提高抗体反应。辅助T分化可以导致免疫耐受或不同类型的免疫反应,如“Th1——”类型(主要是细胞免疫)或“Th2——”类型(主要是体液免疫)。

许多autoreactive T淋巴细胞高亲和力tcr避免克隆删除和分化成自然Foxp3 + CD4调节性T细胞,这是强烈的免疫抑制(45,52]。除了自然的亚群,另一个免疫抑制T细胞分化幼稚T淋巴细胞的外围。这些诱导亚群抗原呈现后出现“耐受性”背景下,主要由耐受性树突状细胞(dc) [53- - - - - -55]。这些耐受性DCs可以有效地利用逆转录病毒和慢病毒基因治疗技术的目标向量。

6。耐受性DCs

DCs可以触发有效免疫反应或抑制他们(56,57]。耐受性的收购活动发生在特定的情况下。概括地说,由未成熟dc抗原呈现结果Treg分化或T细胞失活/凋亡[58- - - - - -61年]。耐受性DCs通常表达低水平的表面主要组织相容性分子(MHC) I和II和其他costimulatory抗原分子表示如CD80、CD86, CD83和ICAM我53,62年- - - - - -64年]。低表面表达的分子确保之间的交互T细胞和抗原呈递细胞不会导致T细胞激活(65年]。

有多种机制DCs成为耐受性和发挥他们的免疫抑制机制。一些居民DCs,比如那些在肠道和其他粘膜组织强烈的耐受性是由于广泛的免疫抑制分子的存在。DCs也可以成为强有力地承认一些microbial-derived后免疫抑制抗原通过toll样受体(66年- - - - - -68年)、凝集素配体和免疫抑制细胞因子(53,64年,66年,67年,69年,70年]。

一般来说,所有的耐受性DCs分泌大量的免疫抑制细胞因子抗原演讲期间,如TGF -β或il - 1053,63年,66年,67年,69年- - - - - -73年]。此外,耐受性DCs移植表面的表达抑制costimulatory分子,抑制T细胞的活化作用。这是PD-1 T细胞抑制性受体配体的情况下,PD-L1 [74年- - - - - -78年]。PD-L2 PD-1第二配体,这是表达对DCs和巨噬细胞免疫抑制能力,但其仍在辩论(79年]。B7家族的其他成员也免疫抑制等B7-H3 [80年],B7-H4 [81年),而VISTA (82年]。

耐受性DCs可以在多种机制发挥其免疫抑制活动,其中包括氨基的upregulation acid-metabolising酶如精氨酸酶和吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO) [83年- - - - - -88年]。人们认为消费必需氨基酸的耐受性DCs耗尽他们从T细胞,和他们的克隆扩张是逮捕,成为“死”。

7所示。基因改造DCs的逆转录病毒和慢病毒载体诱导免疫抑制和宽容

DCs的能力“捕获”病毒和转导与逆转录病毒和慢病毒可以作为一个优势基因修改他们(62年,89年,90年]。然而,有两个主要问题为有效克服人类直流修改。首先,转导monocyte-derived DCs尤其困难,因为他们拥有一个慢病毒感染细胞内制约因素(91年]。其次,直流与这些病毒载体转导过程可以引起他们的表型和功能成熟,特别是当使用高多样性的转导(44,90年]。这是一个强烈的障碍克服是否达到公差。这两个问题可以规避公司的猴免疫缺陷病毒(SIV) Vpx lentivector衣壳生产过程中。Vpx可以抵消人类直流限制lentivector传导,导致较低的粒子数的使用来实现高效直流修改(92年]。然而,如果正确利用,耐受性DCs的免疫抑制能力可以利用诱导治疗免疫耐受。特别是lentivectors尤其适合修改DCs和渲染耐受性。Lentivectors可以引入基因同时coexpressing抗原与免疫抑制特性。Lentivector转导导致稳定的基因组整合和持久的转基因表达。最后一个属性是特别重要的诱导耐受性DC分化和长时间T细胞抗原表达。最后,正如长篇转基因可以表示,它不需要为特定的MHC等位基因之前识别特定的抗原表位。因此,lentivector疫苗可以很容易应用于病人不需要MHC打字。

最直接的过程来区分耐受性DCs的交付是强有力的免疫抑制细胞因子(图5)。逆转录病毒和运载体已成功地用于治疗炎症性疾病。这是组成型表达的TGF -β用腺病毒载体,导致抑制免疫反应和长期直流生存93年]。同样,组成型表达的il - 4修改DCs抑制胶原诱导关节炎小鼠模型(94年]。逆转录病毒il - 10 DCs, Epstein-Bar自然编码的病毒,强烈抑制刺激T细胞的能力在体外(73年]。类似于逆转录病毒转导,lentivectors也被用来表达il - 10。这些DCs可以有效地抑制OVA-dependent实验小鼠哮喘模型。这些修改DCs IL-10-expressing Foxp3 + treg扩大。有趣的是,il - 10表达的宿主亚被要求建立宽容,而不是由DCs (il - 10的表达95年]。


图5
主要免疫耐受的诱导策略DCs使用逆转录病毒/慢病毒载体的基因改造。在这个方案中,最利用免疫耐受的诱导策略使用基因改造DCs显示。在上面,使用慢病毒或逆转录病毒载体,在DCs免疫抑制细胞因子的表达可以诱导抗原亚群的分化,或在某些情况下,Th2细胞。在中间,lentivectors可以用来表达本构活化剂或免疫抑制细胞内信号途径抑制T细胞的分化。在底部,慢病毒载体可以实现短发卡rna针对促炎NF -等途径κB,促炎的受体,如高飞球的一击,或细胞因子抑制剂SOC3等信号。所有这些策略也导致抑制T细胞的发展。这些计划中没有显示,但所有策略导致耐受性DCs要么防止分化细胞毒性CD8 T细胞的扩张,或诱导其凋亡/无力。

除了免疫抑制细胞因子的表达,可以分化耐受性DCs针对特定的胞内信号通路(图5)。众所周知,有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)细胞外调节激酶(ERK)在DCs强烈激活免疫抑制63年,66年,96年- - - - - -One hundred.]。事实上,持续的MAPK ERK激活可以通过持续活跃的表达形式的上游MAPK MEK1/2 [97年,99年]。Lentivector交付一个既定的活跃MEK1突变与CD40 downmodulation DCs导致未成熟dc和表达的生物活性TGF -β(53,63年]。这些ERK-activated dc分化抗原Foxp3亚群在体外和在活的有机体内(53]。这些亚强烈扩大在活的有机体内后第二个抗原相遇在炎症条件下,增强抗原宽容,在鼠标控制类风湿性关节炎模型(53]。其他细胞内信号通路也被利用诱导抗原宽容。这也是本构的I型干扰素信号通路的激活在DCs。Lentivector表达式的一个既定的活跃IRF3突变体,诱导表达的il - 10修改DCs与TLR衔接分子可能通过交互MYD88 [63年]。这些修改DCs还扩大抗原Foxp3亚群在活的有机体内,抑制效应T细胞。这并不奇怪,I型干扰素通路是免疫抑制在某些情况下(101年),干扰素-β和il - 10分泌共享一个共同的信号转导通路63年,101年,102年]。因此,干扰素,β在多发性硬化症的病人管理103年,104年]。非常有趣的是,直接lentivector疫苗接种达到在活的有机体内足够数量的DCs的转导诱导宽容,这是有效的至少一个月(53,63年,90年,105年,106年]。所有这些策略的一个潜在缺点是转导DCs的有限的寿命。然而,这可以克服静脉lentivectors管理,可以转换直流前兆出现在组织导致长期转基因表达(107年,108年]。

另一个策略基于修改的胞内信号的抑制炎性信号通路(图5)。通过这种方式,他们的抑制可以在某些情况下引起宽容。一个典型的例子是抑制NF -κB通路,一个著名的促炎的路线(62年]。因此,Rel-B沉默由特定成分阻止DC成熟TLR刺激后,这一策略被成功用于治疗小鼠自身免疫性重症肌无力(109年]。相反,目标激活内源性促炎通路的负面反馈机制也可以被利用。当细胞因子信号的抑制3 (SOCS-3)在DCs中,这些修改DCs展出受损促炎信号(110年]。这些修改DCs显示显著降低干扰素-等古典促炎细胞因子的表达γ、il - 12和IL-23。他们还显示一个增强il - 10分泌。总的来说,这些SOC-3表达dc能有效地抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)的老鼠,人类多发性硬化的模型(110年]。

在某些情况下,致病性抗原导致人类自身免疫性疾病是未知的。这显然是在类风湿性关节炎。即便如此,lentivectors也可以用来抑制自身免疫性疾病没有致病性抗原的直接目标。因此,管理一个B细胞激活因子(金属)您可以阻止发炎的关节足以治疗实验胶原诱导关节炎(111年- - - - - -113年]。这些lentivectors优先转导DCs的关节发炎而不需要修改他们的取向在活的有机体内。表达的小干扰rna干扰高飞球的一击DC成熟和抑制Th17细胞分化[112年]。逆转录病毒修改的T细胞也可以达到公差与未知的疾病(uncharacterised)致病抗原。例如,引入一个OVA-specific Foxp3 + treg TCR的逆转录病毒转导修改对卵子的特异性。管理的卵子在发炎的关节炎性关节炎模型小鼠这些OVA-Treg细胞过继转移被允许的抑制炎症和骨破坏。这种规避的需要针对致病性工具抗原(114年]。以类似的方式,OVA-specific ERK-activated生成的亚群(lentivector转导)OVA-expressing DCs实现相同的目的(53,63年]。

Lentivectors还可以提供范围广泛的免疫抑制介质,如vasointestinal肽(VIP)。VIP表达lentivector-transduced DCs有效抑制DC的成熟,导致表达和抑制免疫抑制促炎细胞因子,分别。他们的治疗效果是由分化和扩张Foxp3 + treg [115年]。基本上,相同的策略,在被成功用于治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎coecal结扎和穿刺(CLP),分别为人类多发性硬化和脓毒症模型(106年]。甚至病毒蛋白与免疫抑制lentivectors诱导表达的属性可以容忍(116年]。

8。由MicroRNA-Tagging诱导免疫耐受

lentivector基因治疗的一个主要问题是其直接管理在活的有机体内提出了一个强有力的transgene-specific免疫反应。这是可取的,提高免疫力治疗传染性疾病和癌症的63年,90年,117年- - - - - -120年]。然而,这个属性的慢病毒载体对基因治疗非常不利的遗传和代谢紊乱。Transgene-specific免疫反应限制纠正细胞的生存,因此,他们的治疗活动(121年- - - - - -123年]。一个非常优雅的策略来防止trangene-specific免疫反应是通过microrna的标签(124年)(图5)。

小分子核糖核酸(microrna)组成的非编码rna的集合,形成基因表达的转录后的监管体系的一部分。microrna包含小20 - 24元序列,称为siRNAs,部分内生mrna的补充。这些siRNAs可以抑制基因表达的主要(但不仅限于)诱导信使rna降解。这内生监管体系也利用防止免疫攻击使用慢病毒载体基因修正细胞基因。结果表明,转基因表达专业抗原呈递细胞负责抗原T细胞反应。这些T细胞发挥细胞毒性对transgene-expressing细胞活动。因此,为了避免T细胞反应,转基因的表达是阻止尤其是专业抗原呈递细胞通过引入目标序列haematopoietic-specific microrna的142 3 p转基因(125年]。因此,转基因的信使rna编码将在造血细胞退化的血统(淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞和DCs),但不是在其他细胞谱系。142年3 p-tagged lentivectors可以静脉注射不提高transgene-specific免疫反应导致长期转基因表达肝细胞(125年]。而非免疫沉默,这种策略诱导transgene-specific宽容的扩张Foxp3 + treg [126年]。作者的研究表明,转基因表达肝细胞被要求扩大亚(126年]。microrna的142 3 p-tagging第九凝血因子有效地用来表达在肝脏,导致校正实验血友病B (127年]。

9。生物安全方面的考虑在逆转录病毒和慢病毒载体的应用

生物安全的考虑显然是一个优先级应用新的实验性治疗人类的疾病,可能时使用更传统的方法加以解决。这是一些自身免疫/炎症的情况下疾病如风湿性关节炎或糖尿病。使用逆转录病毒和慢病毒载体的生物安全问题尤为突出显示在第一次临床应用MLV-based逆转录病毒载体治疗x连锁SCID和慢性肉芽肿性疾病。在x试验的情况下,大量开发的治疗儿童白血病,可能与转录upregulation插入突变的原癌基因(38,128年- - - - - -130年]。的前病毒的公升可以部分解决这个问题(self-inactivating lentivectors [20.,131年,132年),因为病毒增强剂,它们包含强烈使该细胞的原癌基因还会导致异常,转录和可变剪接128年,129年,133年,134年]。所有这些基因毒性效应也可以预防,至少对宽容的感应,使用nonintegrating lentivectors (NILVs)。可以生成这些lentivectors直接通过引入整合酶的灭活突变编码区,或integrase-binding网站在转会向量(118年,135年]。因此,矢量仍在细胞核作为附加体,和长期的表达式是实现非区分细胞,适用于直流基因改造。NILVs已被证明是有效的基因修改的视网膜,肌肉和大脑(135年- - - - - -138年),它们已经用于疫苗(108年,118年,139年,140年]。

基因毒性效应可能更严重的低分化细胞中,而不是在终末分化,postmitotic细胞。因此,提高生物安全的另一种方法是物理目标lentivector粒子所需的细胞/组织。这可以通过pseudotyping逆转录病毒/慢病毒载体粒子。包膜糖蛋白(ENV)出现在粒子的表面决定了特定的靶细胞识别。然后,ENV绑定到适当的细胞受体后,向量粒子进入细胞。逆转录病毒和慢病毒载体可以获得大量不同包膜糖蛋白,芽细胞的细胞膜生产商。有趣的是,这些病毒颗粒表现出自然所赋予的取向结合糖蛋白(141年,142年]。最包膜糖蛋白用于lentivector pseudotyping是疱疹性口炎病毒糖蛋白(VSV-G) [41,42,143年,144年]。Pseudotyping VSV-G提出了许多优点,包括粒子的稳定性和高效价矢量的准备工作(29日]。重要的是,VSV-G带来病毒载体颗粒范围非常广泛的宿主细胞,其中包括老鼠和人类DCs (10,29日,145年]。因此,潜在的,限制lentivector取向可能会导致更安全在活的有机体内基因传递和增强疗效的lentivector剂量的减少。

逆转录病毒和慢病毒载体已成功准型与范围广泛的不同的外源病毒蛋白质146年,147年]。为例,小鼠白血病病毒amphotropic (MLV-A),长臂猿猿白血病病毒(GALV)和猫科动物内源性逆转录病毒(RD114)信封31日,148年- - - - - -153年]。Lentivector pseudotyping甲病毒信封赋予特定的取向对老鼠和人类DCs (154年,155年];有趣的是,杆状病毒gp64授予肝细胞转导能力而不是从免疫系统细胞,一个属性,可以利用免疫耐受的诱导156年,157年]。这个属性可以被利用来防止transgene-specific免疫反应。

Pseudotyping麻疹病毒H / F ENV包膜糖蛋白赋予人类B和T细胞转导能力休息,与目标的可能性,这些免疫细胞类型的感应公差(30.,158年]。

此外,lentivectors也可以准型与修改病毒糖蛋白,赋予新取向矢量微粒。只是作为一个例子,特定的基因打靶在活的有机体内DCs是圆满完成通过引入选择突变辛德毕斯病毒包膜蛋白E1 / E2,增强约束力DC-SIGN (159年,160年]。

10。结论

因为逆转录病毒载体已被证明是有效的系统提供感兴趣的基因进入靶细胞被用于基因治疗和基因疫苗的发展。是什么让他们好的系统是他们缺乏病毒蛋白,并稳定整合到目标细胞。慢病毒载体,由复杂的逆转录病毒,有属性,克服一些简单的逆转录病毒载体的限制,包括更高的病毒粒子的稳定性和滴度和插入突变的频率较低。对免疫治疗尤其重要的是,他们可以转换高度分化的细胞如DCs (6]。

直流与逆转录病毒载体转导引起他们的表型和功能成熟。虽然这是一个优势在治疗感染性疾病或癌症的不利影响,当免疫耐受是期望的结果,因为它是在治疗自身免疫。

Lentivectors提供免疫抑制介质抑制转导dc的成熟可以用来诱导宽容。另一方面,有不同类型的成熟dc,并不是所有的诱导免疫反应。有耐受性的外围DCs提供耐受性信号与高亲和性autoreactive T细胞识别,导致它们分化成诱导Treg [53- - - - - -55]。可以使用这些耐受性DCs实现免疫耐受。区分耐受性DCs有三个一般(最常用)方法;强有力的免疫抑制细胞因子的交付,针对胞内信号通路导致耐受性的表现型(MAPK / ERK激活),和抑制炎性信号通路(NF -κB通路)。什么使lentivector转导DCs特别优雅的方法是,它可以应用没有先前的MHC输入直流会自动呈现抗原转基因。虽然coexpressing抗原的结合提供免疫抑制特性感兴趣的'耐受性的反应抗原。

通过lentivectors基因疗法,而有前途的,有限的成功是因为这些向量诱导强烈transgene-specific免疫反应在活的有机体内限制纠正细胞的生存和他们的治疗活动。为了克服这个障碍,microrna的标签可以用来防止转基因表达专业抗原呈递细胞通过引入一个序列的目标具体microrna在这些细胞,或在某些成熟阶段。

原则上使用逆转录病毒载体将会看起来更适合需要提高免疫系统疾病,如癌症。但由于我们的免疫系统,可以优雅的诱导免疫或宽容,其调制使用基因治疗方法可能被证明是一个有效的系统来对抗过分保护的反应我们的免疫系统,这可能会引起自身免疫性疾病。

作者的贡献

作者的贡献同样在论文的写作。

确认

即Dufait由伊拉斯谟(欧盟)资助的奖学金。k . Breckpot是科学Research-Flandes基金资助的。d . Escors是由一个英国关节炎研究职业发展奖学金(18433)。