文摘

使用数组在基因组学已经导致了快速、可靠的方法来筛选有机体的转录组。它可以自动和分析工具可用,因此该技术在过去几年已经成为广泛使用的。信号转导途径主要依靠现有蛋白质的磷酸化状态;因此激酶在信号转导途径至关重要。数组技术也可以用于激酶组的分析。使阵列分析,共识缩氨酸激酶是在一个坚实的支持。与细胞溶解产物和孵化后的放射性ATP,放射性肽可以可视化和活跃的激酶在细胞可以确定。本文综述全面可用不同的激酶组阵列平台和结果迄今为止使用这样的平台。它会显示,这种技术并不很高的期望和失望是特别强大的,因为它独立物种。尽管如此,仍有改进的空间,我还应当素描未来可能的方向。

1。介绍

在过去的15年里数组和质谱技术使转录组的测定(1- - - - - -3和蛋白质组4- - - - - -6的生物样本。这些信息对我们的重要价值说明控制细胞生理的分子机制。但是,同样的,如果不是更多,重要的目标是定义这些蛋白质,参与细胞信号通路是活跃的(7,8]。酶使磷酸化酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基在其他蛋白质(激酶(9])扮演了重要的角色在决定进入细胞周期信号级联,生存和分化命运在身体的组织10]。大多数酶激酶家族的成员可以被从主序列的真核蛋白激酶催化(ePK)域约250个氨基酸,而数量小得多的蛋白激酶催化域和不共享这通常统称为非典型激酶(11]。比较激酶域内和物种之间显示巨大的多样性,这是进一步复杂化激酶参与监管的非催化功能域,交互与其他合作伙伴或亚细胞定位的蛋白激酶。在一起,在催化和非催化域解释多样性高度的功能多样化激酶在真核王国。真核激酶现在通常在7个主要分类组:环核苷酸和Ca2 +——/ phospholipid-dependent激酶;一群组成的细胞周期蛋白依赖性和cyclin-dependent-like激酶,增殖激酶,和糖原合酶激酶;酪氨酸激酶;酪氨酸kinase-like集团(实际上是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶;calmodulin-dependent激酶;酪蛋白激酶1组和STE集团(STE是无菌的萎缩,反映这一事实属于这组基因被首次发现在无菌酵母突变体的分析),其中包括增殖作用的酶作用上游激酶(12,13]。特别是,知道激酶信号通路被利用在特定的细胞是至关重要的对于理解生物学和病理学和治疗疾病14,15]。

传统的遗传和生化方法可以提供答案,但对于技术和实际的原因,通常在追求一个基因或一次通路。因此,需要一个更全面的方法在细胞在健康和疾病。为此,激酶组分析技术已经开发和他们的应用程序已经开始提供有价值的见解在大量实验和临床系统的生物学(16- - - - - -18]。

2。激酶组技术的发展

大规模并行分析使用数组技术已经成为主要的基因组和转录组的分析。从转录组的测定,了解细胞功能都得到了极大的改进。小说的见解导致转录组的概念,大多数是很必要的,能把一个细胞功能,并可能被视为最小转录组。只有一小部分的记录出现在细胞决定细胞的身份和这些关键转录表达在低水平(19,20.]。因此小在转录组表达谱的变化会导致酶的细胞发生巨大变化,导致细胞功能的显著差异。因此,全面的描述细胞的新陈代谢可能比这样更有用的基因组和转录组的描述17,21]。

本世纪初,已经取得了重要的进展调整阵列技术来测量酶活性在整个细胞溶解产物蛋白质芯片的制备蛋白质底物相互作用的评估和肽的生成芯片中的交互和酶的鉴定活动(22]。豪斯曼等人表明,雇佣肽芯片,由Diels-Alder-mediated固定激酶的底物(c - src nonreceptor酪氨酸激酶)的单层alkanethiolates黄金,允许激酶活性的定量评价23]。因此,原则上一个数组表现出特定的共识序列蛋白激酶在整个激酶组(联合活动的细胞激酶)允许一个全面完整的细胞溶解产物检测信号转导事件事实上我们能够证明的有效性等肽阵列信号转导研究展示了一代的首次全面描述颞磷酸化动力学事件引起的脂多糖刺激(24]。信心的有用性肽阵列技术为研究信号转导来自lipopolysaccharide-stimulated细胞免疫印迹分析,证实了使用获得的信号肽数组,以及演示激酶抑制剂影响磷酸化肽数组模式符合预期这些抑制剂(25,26]。显然,采用这种肽阵列技术为目的的调查细胞特性将允许更快、更具包容性的分析改变细胞代谢和细胞信号通路在连续的承诺这些细胞在分化与其他现有技术相比。

3所示。竞争技术

磷酸化细胞新陈代谢的监管机构的优势吸引了很多研究人员的发展策略使细胞磷酸化事件的描述。经典,使用in-gello激酶激酶活性和蛋白质磷酸化研究化验或Western-blot-based凝胶转变技术利用之间的大小差异蛋白质的磷酸化和非磷酸化形式(27]。然而,这些都是相当繁琐的技术和不允许大量的研究样本。phosphospecific抗体的情况已有所改善,随着年代末,认识到蛋白质的磷酸化形式,但不是他们的磷酸化。使用这些抗体可以使用经典的免疫印迹检测磷酸化事件(28)也在,例如,Elisa格式允许高通量筛查kinase-activity-modifying化合物(27,29日)或组织阵列使组织学分析蛋白质的磷酸化在评估同时对成千上万的相关组织样本(30.]。主要缺点是,只有一种类型的磷酸化是研究/实验。最近,采用多色流式细胞仪、爱尔兰等人特征磷蛋白质反应环境因素在单个细胞水平在急性髓系白血病(31日]。这种方法的优点是,细胞的个体变异对磷蛋白质是评估和需要的数量很少的材料,但即使是最先进的流式细胞仪技术不允许同时评估,一般来说,更像是十抗体。这促使研究者探索技术研究细胞磷酸化与磷酸化少的先验假设事件有关,与激酶组分析的主要结果。

这些方法的优点之一是提供的一个商业Kinexus,它使用一个multiblot系统,依赖于十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺minigel电泳和多车道immunoblotters允许45以上的具体和量化检测蛋白激酶或其他信号转导蛋白(32]。当这项技术用于其全部产生几乎完全的描述细胞磷蛋白质网络,尽管它仍然是劳动密集型。或者也许是一个蛋白质组学的方法选择,通常由磷蛋白质的分离,例如,二维凝胶电泳、色谱法,其次是质谱(33- - - - - -36]。稳定在这个领域进展和最近使用强阳离子交换色谱(SCX)在低pH值对胰蛋白酶的丰富此处则第一个大规模的磷酸化蛋白质组分析网站主要从动物组织已经完成(37]。能被探测到的蛋白质斑点和明确的确定,这些方法提供了一种强大的方法监测潜在的数以百计的蛋白质的表达和调控同时,但实际上它是受这一事实的位置几乎20多个蛋白激酶2 d蛋白质组地图上都是可用的。这反映了一个事实,就像大多数信号转导蛋白,蛋白激酶在非常时刻存在水平细胞和通常由最敏感的察觉蛋白质污渍,而程序基于此处则和决心的纯化肽谱结构的耗时。这种方法的主要优势是,它是完全客观的,例如使用微流体光盘技术这种方法确定了两个小说在人类的盐皮质激素受体磷酸化网站(38]。

所有这些方法的缺点是,它们集中在静态磷蛋白质的相对浓度测定,但不解决各种实际活动的细胞信号通路(一个流行的比较是里程的汽车的仪表盘指标给行驶距离信息,但没有提供信息的速度这是发生;获得后者信息使用速度计)(39]。

4所示。激酶组分析和表达阵列

尽管设计复杂性肽数组(40,40),代谢数组表达以上数组的一个重要优势是前者nonspecies限制。大多数激酶pan-eukaryotic相同的共识序列(例如,nine-amino-acid氨基酸序列为酵母细胞周期蛋白依赖性激酶Wee1目标是相同的,植物,和人)。这提供了一个好处,那就是可以直接比较在人类细胞小鼠细胞激酶活性,可以研究生物,没有完全测序。真核蛋白质磷酸化激酶调节的重要性被广泛认可。个人激酶激酶反应的特异性催化了取决于许多因素,但最重要的一点是需要的氨基酸上下文衬底丝氨酸,苏氨酸、酪氨酸放置,但其他基质也承认激酶(氨基糖苷类,胆碱和肌醇)。尽管衬底的大范围类激酶域的总体结构仍然是相似的。对于大多数典型的蛋白激酶,这种氨基酸的确切要求上下文激酶承认其衬底尚未建立,但显然涉及8-12-amino-acid长肽段,适合在一个特定的槽的激酶结构域41]。虽然激酶显示大量的序列多样性真核王国,衬底序列和磷酸化模式显得非常保守物种之间(图1)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
激酶组原理分析使用肽数组。(a)肽阵列由肽共识图案不同的激酶在人类基因组。作为一个例子,显示了三种不同的激酶的共识序列(ISS激酶、MAP激酶和GS激酶)。孵化时溶解产物含有活性MAP激酶和放射性标记ATP, MAP激酶共识主题将由MAP激酶磷酸化磷酸与放射性标记没有伴随的磷酸化的其他主题。因此,所有激酶可以并行化验。(b)我们使用这种情况比较磷酸化溶解产物由b细胞模式的不同物种,我们观察到这些模式非常类似的物种之间。而且相比其他细胞类型显示,磷酸化的激酶基质是程控限制而不是物种限制和激酶主要序列物种之间的分歧并不是反映在不同的底物磷酸化。

5。第一代数组

如上所述,使全面的描述细胞信号转导和新陈代谢仍极其复杂。这促使发展的平台,包含空间解决哺乳动物激酶基质(42]。第一个商用平台由192肽提供激酶衬底共识序列在哺乳动物激酶组发现了两次,使用生物机器人微型智能电网"测位仪配备100 -微米针。肽被发现到,随后共价耦合分支水凝胶种载玻片。最终的物理维度的数组 毫米,每个肽有一个直径约350μ是750 m,肽点μ米(图2)。


图2
设计的典型的第一个商业肽数组激酶组分析从2003年(当时由Pepscan系统)。相对较小和PKC / PKA偏见肽组杜绝广泛实施。其低成本,然而,让这片极具吸引力的optimalisation化验条件特殊的组织类型和为此目的而广泛应用。

信心的潜在适用性激酶组分析平台来自实验的纯化激酶被添加到该数组中。数组是否会衡量合理的信息,在ATP的存在会导致适当的共识的磷酸化肽序列没有伴随的磷酸化肽(参见图1),这实际上发生:当数组孵化90分钟30°C 25 ng的持续活跃的催化亚基蛋白激酶A (PKA)33P -γ强有力的磷酸化肽的有限子集的数组使用磷光成像检测。分析已知的肽序列允许提取的最优PKA共识序列,而伴随的磷酸化肽不包含PKA共识磷酸化网站是微不足道的。孵化的PKA和数组33P -αatp并未导致阵列探测信号,证明点磷酸化是一个特定的绑定γ磷酸的ATP九肽。这些结果确定数组作为有用的工具来确定的底物特异性24]。这个设计也是测试在实际生物实际情况采用完整的细胞溶解产物和发表在相同的具有里程碑意义的研究描述了前面提到的PKA结果,包括试图的首次全面描述颞磷酸化动力学事件引起的脂多糖刺激(24,43]。希望激酶组分析总是包括新颖的信号转导的发现连接,因此这也是未遂liopolysaccharide信号。分析获得的信号肽数组显示激活的p21Ras通过脂多糖,这证实了直接测量p21Ras lipopolysaccharide-stimulated人类外周血单核细胞三磷酸鸟苷含量,代表第一个直接演示p21Ras刺激激活的人数受体家族成员(44]。进一步的信心的有用性肽阵列技术为研究信号转导来自lipopolysaccharide-stimulated细胞免疫印迹分析,证实了使用获得的信号肽数组,以及演示激酶抑制剂影响磷酸化肽数组模式符合预期这些抑制剂的作用。得出的结论是,这首先代谢数组是一个有用的方法来确定一大群激酶的酶的活动,提供高吞吐量分析细胞代谢和信号转导24),虽然这是夸大:PKA和PKC偏见衬底集及其整体少量肽不提供真正kinome-wide分析可能性。

也许对这个数组是主应用程序(除了它的使用条件optimalisation)的植物,这是相对现金拮据的(这个特定的肽组幻灯片的经济吸引力),缺少代理phosphospecific检测磷酸化的事件在免疫印迹和感染的一个重要的研究发表拟南芥与细菌病原体的减毒株两pv。番茄在工厂方法45),发现微分激酶活动通过测量磷酸化肽的共识。然而,这些天也在这个领域更高级的格式(使用46]。

6。激酶数组

针对第一代阵列的局限性,乔斯博士Joore当时与Pepscan很快决定增加基板的数量采用精英化的方法,也就是说,只有使用肽作为激酶基质。为此Phosphobase资源([47- - - - - -58),http://phospho.elm.eu.org/)是利用和数组包含1176底物肽的生产,其中包括所有已知人类激酶共识或多或少在重复序列,发现这些玻璃罩创建一个第二代PepChips。这些数组有效整合放射性如果与细胞溶解产物和孵化33P -γatp但未能与细胞溶解产物和孵化时这样做33P -αatp,证明这些PepChips现货磷酸化也由一个特定的绑定的γ磷酸的ATP九肽(图3)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
Pepscan系统产生激酶数组。离开了。酒吧的设计包括1176个基板的定位控制来自PhosphoBase资源,因此代表肽,在一个真正的激酶磷酸化肽的反应。正确的。反应包括共价转移终端有效磷组ATP作为数组包含放射性如果与细胞溶解产物和孵化33P -γatp但未能与细胞溶解产物和孵化时这样做33P -αatp。

信心这些阵列的有效性为研究细胞信号是由于我们使用激酶组研究分析研究的迅速影响糖皮质激素(GC)在激活T细胞信号转导(59- - - - - -61年]。GC行为的经典理论包含绑定到一个细胞内糖皮质激素受体转录和转译事件的调制紧随其后。在过去的二十年里快速增加证据,nongenomic GCs对细胞功能的影响已经积累,不符合传统的模型。一些效果的GCs发生过快被genome-dependent过程和解释这些nongenomic效应在活的有机体内显然是各种临床设置所示。的例子是快速反应(10分钟)内的GCs哮喘病人或过敏反应的终止GC管理。因此,人类CD4 +淋巴细胞治疗与地塞米松(敏捷),一个合成的GC, 10分钟,随后刺激15分钟anti-CD3和anti-CD28单克隆抗体。激酶组分析显示显著改变kinomic资料激活CD4 +细胞在敏捷治疗。有趣的是,敏捷治疗导致减少Lck和菲英岛酶活性,这是再度确认在体外激酶化验。Lck菲英岛,Src激酶家族成员,t细胞受体信号的关键球员。因此,免疫印迹显示减少下游信号分子的磷酸化细胞在敏捷治疗,指出快速GCs对早期TCR-signaling事件的影响。因此PepChip分析使用激酶数组,演示了快速改变kinomic概要文件由于敏捷处理和识别Lck和菲英岛在T淋巴细胞作为GC治疗的新靶点。得出peptide-array-based激酶组分析使用第二代Pepchip小说是一个功能强大的工具为研究细胞信号转导(59,61年,62年]。

这个激酶组的权力分析后来所示各种高调的研究,主要关注癌症的疾病。两个早期的研究,发表在《癌症研究》,用这个平台来描述的细胞事件序列的变化导致食管腺癌(63年- - - - - -66年),而其他特征信号在结肠直肠癌67年,68年),但这个平台还用于制图相关激酶的底物特异性的差异,例如,描述c-Raf和床之间的差异69年)的磷酸化目标站点DMPK E和lats2 [70年),从而在学术上是第一个真正成功peptide-array-based激酶组分析工具,用于各种物种(例如,豚鼠[71年])。一个重要最近发表的研究中使用这个平台来描述细胞的变化与分化相关激酶组在造血作用[72年),如果条件下显示,甚至重要的细胞阶段存在差异,具有挑战性,细胞信号主要是被动的。然而,随着更多的现代设计更好的平台使用近年来大幅下降。

7所示。应用生物系统相同的激酶数组

比较基因组分析展示了大量不同的激酶组不同的真核生物。这些差异反映在高度不同数量的激酶在不同真核生物的基因组(例如,答:芥基因组包含610明显的激酶,智人基因组展品518激酶,d .腹似乎有239激酶,酿酒酵母有115个激酶基因,恶性疟原虫展品只有65假定的激酶),以及高度发散结构。例如,植物和单细胞真核生物没有任何明显的酪氨酸激酶的激酶组,尽管植物磷酸化酪氨酸残基的检测,表明酪氨酸磷酸化在这些生物通过其他类型的激酶介导的动物。引人注目的是,106年的假定的激酶美国非洲酒基于主序列,只有67在面包师orthologues酵母和区区47 orthologue智人。的恶性疟原虫激酶组中,30%属于一个叫做FIKK蛋白激酶家族并没有找到在其他真核生物组(73年]。植物含有一组丝氨酸/苏氨酸激酶受体激酶,没有找到其他真核生物,但最有可能共享一个共同的进化起源与受体酪氨酸激酶存在动物,因此有时集体和称为受体激酶。而真菌如酵母和脉孢菌似乎没有受体激酶集团的代表,黏菌,盘基网柄菌discoideum,有几个例子。因此,真核蛋白激酶家族显示大量的多样性在基因水平,但在衬底的水平低得多。这是利用激酶数组(74年,75年),例如,旨在定义最小真核激酶组,使用激酶肽数组。一组细胞提取磷酸化的底物被确认是常见的不同成员的动物,植物,真菌王国,并可能因此被称为最小真核激酶组(负责磷酸化的激酶的底物参与,在别人,过程如转录、翻译、和细胞骨架重组)(76年,77年]。这些结果表明真核激酶的散度观测的主要序列是不反映在底物水平磷酸化,它揭示了一个相当有限的基质空间激酶的酶家族在真核生物中。此外,最小真核激酶组标识显示一系列激酶的底物的存在已经出现在一个祖先的真核生物为真核生物的生活自从仍不可或缺。

这个数组与对象无关的特性设置进一步凸显了这个平台的成功在植物,甚至细菌激酶信号传导。碳代谢的调节植物细胞敏感响应可用碳代谢产物的水平。到底哪些代谢物感觉到尚不得而知,但很明显,高水平的外部蔗糖和葡萄糖在一定程度上模仿植物中碳传感的重要方面包括感应sucrose-1-fructosyltransferase (1-SST),存储碳水化合物的合成的关键酶,果聚糖。sucrose-stimulated细胞激酶活性的变化拟南芥采用肽数组包含1176种不同的激酶基质(78年上面描述和结果显示一个信号转导级联顺序sucrose-dependent激活的受体酪氨酸激酶,失活的植物同系物LKB1and SNRK1跟着地图的激活kinase-like信号盒,反过来激活各种效应途径包括我/ Wee1反应;作者的结论是,LKB1 / SNRK1 / MAP激酶信号级联(79年)是一个主要的效应在植物糖传感。同一组进一步开创了植物激酶组分析(80年]。植物抵御感染的生物攻击者通过产生不同的激素和这些的影响拟南芥使用激酶激酶组监控数组。微分许多激酶磷酸化的底物不同激素之间的家庭是观察和证据相声也发现了(81年]。这些天,PhosphoBase-based数组(当前商业供应商Pepscan转眼间)已成为植物激酶组分析的主要工作(82年]。

有趣的是,尽管激酶反应eukaryotic-restricted的教条,也在其他形式的生命遇到激酶(83年]。Eukaryotic-like丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STPKs)中鼠疫属(细菌组臭名昭著的涉嫌造成鼠疫),但他们也被确定土壤中的微生物Myxococcus克桑托斯在人类病原体,如结核分枝杆菌,甚至11 STPKs编码。只有两个(PknG和PknK)可溶性蛋白质,而其他九STPKs包含一个跨膜域。此外STPKs也被发现铜绿假单胞菌、肺炎链球菌而在金黄色葡萄球菌。至少两个细菌等价物,YpkA鼠疫和PknG结核分枝杆菌,已被证明是直接参与的subversion宿主细胞在各自的感染过程。的一个很好的表征提供了细菌激酶可能意味着什么红球菌属fascians(84年- - - - - -86年]。然而,这些激酶的精确的生物功能和底物特异性尚未定义,因此是知之甚少。最近,PknB激酶的激酶数组已经应用金黄色葡萄球菌。革兰氏阳性细菌是人类微生物群的一部分,但它可以变成一个危险的病原体,导致广泛的感染(87年,88年]。PknB激酶是由三个细胞外的面域(penicillin-binding域),中央跨膜域和细胞内激酶域。使用磷酸化多肽微阵列PknB的决心,表明PknB proline-directed激酶(89年,90年]。这些结果被质谱证实。惊人的观察,人类的序列可用于细菌的肽数组来确定衬底偏好激酶的激酶显示了极端的进化压力性质的基板接触,说明这个进化选择压力应该揭示生活的本质的重要方面。

8。测量酶激酶组反应特点:PamGene平台

虽然第一代slide-based阵列技术被开发出来,这个平台的沉闷测量酶动力学是越来越多的感觉。Pamgene公司已经使用一个平台不断注入样品通过一个矩阵和的协会评估荧光受体分子。这使动态测量96口井格式并意识到使用荧光标记antiphosphotyrosine这个平台,可以用来衡量特定肽的酪氨酸残基磷酸化。从PamGene多孔微阵列平台与其他微阵列格式的不同之处在于,它允许开发特性,比如速度和动态测量的能力。衬底有500倍面积比传统的平面阵列,这是特别有用激酶组配置文件应用程序的足够的测量生化反应需要nonlimiting访问酶的底物。快速杂交是激酶组配置的资产,因为它可以区分为底物的亲和性不同绑定。这个实时“活”监控功能还创建的可能性研究孵化环境变化的影响,例如,温度,进一步分离系数区分不同的结合亲和力。目前存在3单位提供的PamGene基于微阵列基板材料相同但不同大小的吞吐量仪器。有PamStation 4(小规模的学术研究),PamStation 12(诊断),96 PamStation化合物筛选和临床蛋白质组学。在具有里程碑意义的研究中,Sikkema等人确定全球酪氨酸激酶活动概要文件在30小儿脑瘤:9瘤,8 pilocytic星形细胞瘤和13个原始neuroectodermal肿瘤(PNETs)的10成神经管细胞瘤(91年- - - - - -93年]。在这项研究中Pamchip酪氨酸激酶微阵列系统组成的144肽代表关键蛋白质酪氨酸磷酸化位点已知参与信号转导过程采用。在小儿脑瘤可以观察到高水平的磷酸化肽与磷酸化共识序列Src家族激酶(还有其他)。验证肽数组数据,Src磷酸化水平取决于西方墨点法,确认Src激酶激活。确定Src激酶的作用在肿瘤恶化10小儿脑瘤细胞系(6成神经管细胞瘤,3星形细胞瘤,1室管膜瘤)受到蛋白磷酸酶1 (PP1),一个强有力的Src家族激酶抑制剂。剂量依赖性降低细胞生存在所有这些细胞系,观察显示可能的治疗窗Src抑制治疗小儿脑瘤。得出结论,Pamgene方法代表了一个新的高通量方法生成酪氨酸phosphoproteomes,概念也凸显了这个平台的力量文档激酶活性的变化在可拆卸的斑马鱼的巢穴Hertog集团,毫无疑问这个领域的世界领袖(94年]。目前其主要用途是在医药行业(95年),而且各种学术研究使用平台发表[96年),记录,例如,人类大脑的激酶活性(97年),这还不可能Pepchip数组因为高背景由于脑脂质。

相对不发达的主要缺点在于bioinformatical Pamgene周围的框架的方法。而对于slide-based肽阵列各学术团体发展竞争bioinformatical分析工具(93年,98年- - - - - -One hundred.),通常高度复杂的,还没有这种情况对Pamchip结果。而且后者平台没有可靠的丝氨酸/苏氨酸应用程序验证,酒吧一些具体的异常(101年]。最后,phosphospecific抗体的亲和力特定底物(不同102年- - - - - -104年),这使得它更难以解释的结果。优势在于其非放射性高通量格式和健壮的日常稳定。

9。Kinomics数组

为了应对日益激烈的竞争,kinomics数组是由Pepscan转眼间。理论上这些肽数组包含1024(少在实践中,由于定位控制,等等)不同的激酶基质一式三份。这些基质被选为理解信号转导,其效用,有助于解释相比之前的设计。此外,从理论上讲,phosphospecific抗体可用于每一个主题,促进理解。缺点是某些信号途径的代表名额不足,尤其是在TGFb / BMP通路(至关重要的,例如,对于了解结直肠癌(105年- - - - - -107年]),其灵敏度日常变化(使集群的大批数据困难),和一个相当大群hyperspots似乎总是被磷酸化。实际上,这些幻灯片是孵化与细胞溶解产物2小时在湿润的炉子37°C +33P -γatp或33P -αatp(控制共价的特定的绑定)。随后,2 M氯化钠的数组是洗,triton - x - 100 1%, PBS、0.1%的渐变,和水,随后数组暴露于phosphoimaging屏幕72小时和扫描phosphoimager(例如,860年富士风暴,斯坦福,通用电气、美国)。点的密度与阵列测量和分析软件,免费软件充分被用于网络。为分析集群使用的斯皮尔曼相关系数计算为每个组合集和执行集群使用约翰斯顿分层聚类方案。每个肽磷酸化的平均和标准偏差,商议amplitude-based分层的方式决定。如果背景磷酸化存在,这个amplitude-based分布可以被描述为一个指数。因此确定500年的指数描述振幅的行为至少磷酸化肽的应该给一个适当的描述数组背景磷酸化和在实践中这样做。磷酸化肽的平均减去1.96倍标准差较高的价值预期描述背景分布被认为代表真正的磷酸化事件。这个数组有三套,我们已经验证了更多200纯化激酶对肽数组,它允许高度自信的语句的激酶活动出现在配置文件。

设计一直利用回答各种生物的问题,主要是有关人类病理学,例如,在癌症(108年- - - - - -110年),凝血(111年- - - - - -117年),和炎性疾病One hundred.,118年),以及多个其他应用程序是可能的。最近的一项研究中,例如,利用这个平台来描绘Idh2基因突变的影响在神经胶质瘤细胞的新陈代谢,而一个非常壮观的研究平台用来描述恐惧的影响在人类白细胞激酶组采用高空弹跳跳的方法和选择的平台现在主力激酶组分析方法,说明了发现coilin如磷酸化目标与对人类神经系统影响vaccinia-related [119年]。最近一个继任者成功的平台设计,是可以通过PEPSCOPE公司。基于kinomics幻灯片通过从hyperspots被扑杀,并配以肽传感先前未被充分代表的途径,这应该是一个强大的幻灯片。然而,尚未发表,因此这张幻灯片的领域等待验证

10。其他和未来的平台

虽然不像之前描述的平台,广泛应用各种其他成功的平台是可用的(120年- - - - - -122年),包括well-publishing幻灯片将牛肽序列,已经成功地应用在许多设置,尤其是在描述传染性牛物种生物学重要的原则(123年- - - - - -125年]。几项研究采用自制的数组,例如,使用点合成方法(126年- - - - - -129年)或者只是简单的磷酸纤维素纸绑定技术(130年,131年),还被人类激酶组阵列的技术正在成为该领域的一个因素(119年,119年,132年),但使用有点老技术。此外,一个系统涉及PCA寡核苷酸spatially-addressed肽存在。在这个系统激酶反应发生在溶液中,然后在空间上分开PCA编码的基础。蛋白溶解产物也被分析使用Luminex immunosandwich [133年,134年),一种bead-based激酶磷酸化检测(135年),但这不是一个激酶组分析平台美国这篇。然而,本研究确定了Src为侵入性癌症作为一个潜在的目标,与获得的结果与Pamgene平台(93年]。最后,为基础的解决方案mass-spec-dependent方法可能有实质性的价值。更具体地说,通过当前因素限制价值平台包括使用放射性物质通过使用33P -γatp检测磷酸化事件,构成监管负担,妨碍了大小的实验,可以执行相结合是昂贵的相比,稳定同位素;并迅速衰减阻碍了定量对比实验在不同的日子里进行;表面化学工件由于高度多肽斑点和无法做适当的酶动力学;严格的设计要求,由于经济必要性成批打印数组;不能独立的单个或多个磷酸化事件在一个肽;缺乏的可能性现在目前在双通道测量,例如,转录组决定使用核苷酸标签使用两个不同的fluorphores比较两个样品;和工作要求subphysiological ATP浓度。所有这些因素可以通过使用溶剂型化验mixed-peptide解决方案的孵化与细胞溶解产物和ATP(或稳定同位素(例如,2H -γatp)允许多通道比较)和后续使用质谱分析。这个技术允许识别个人的肽基于其独特的重量(所有氨基酸亮氨酸和异亮氨酸有不同的分子量除外)和识别这些肽的单个和多个磷酸化事件基于离散体重变化引起的。引进这样的技术,然而,需要广泛的验证以及评估其性能相对于基准的技术,在casu激酶组分析使用数组和直到那时仍将是当前平台选择调查人员的首选。