离子梁处理聚乙烯对辣根过氧化物酶的共价固定的机制gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

通过等离子体浸渍离子注入改性聚乙烯表面。观察到包括碳化和氧化在内的结构变化。改性聚乙烯的高表面能归因于表面上的自由基存在。通过自由基浓度的衰减解释了处理后的储存时间的表面能衰减，而含氧基团的浓度随储存时间而增加。通过与自由基的反应共价连接到改性表面上的辣根过氧化物酶。适当的阻断剂可以阻断该反应。所有氨基酸残基可以参与共价连接过程，为所有蛋白质提供普遍的附着机制。由于界面区域中的亲水性相互作用，保留附着蛋白的天然构象。共价附着蛋白的酶活性保持高。通过在SP中的未配对电子稳定来解释改性层的长期活性附着蛋白质gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba碳结构。高浓度的自由基可以给蛋白质分子提供多个共价键，破坏天然构象，并随之破坏催化活性。蛋白质与自由基结合的普遍机理可以推广到聚合物辐射损伤的各种方法。gydF4y2Ba

1.介绍gydF4y2Ba

蛋白质在聚合物表面的附着提供了一种改变生物体对表面反应的方法，因此是提高医用植入台面设备的生物相容性和功能的重要步骤[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．在医学上，所述免疫应答可导致植入假体期间或其中血液暴露于医疗装置如心脏肺机器的表面的操作的不良反应。在生物传感器中，可以使用附着的蛋白质来检测分子的环境中的存在。所附的蛋白必须被牢固地结合到所述表面，以防止它被操作条件包括液体流动的在表面上以高速率下洗掉[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．此外，表面必须使蛋白质保留其生物活性[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

考虑到必须进行的严格的协议，以获得在医疗应用中使用新的聚合物材料的批准，优选改变现有聚合物的表面而不是开发完全新的聚合物材料。可以使用多种化学物理和物理修饰来进行蛋白质结合的聚合物表面的制备，例如通过特异性活性组的连接分子提供共价结合的[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba等离子体处理[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba]紫外线治疗[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba]，以及离子束注入[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

尽管它在应用中很重要，但蛋白质在聚合物表面上的附着机制尚未被很好地理解[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba］．在给定的应用中，这种机制的不确定性可能使表面的行为不可预测。在有限的应用中，聚合物表面的物理吸附是可以接受的。然而，在某些应用中，共价键提供的更强的连接是可取的，连接基团已被用来实现这一点[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］．由连接基团提供附接的机构通常被假定为经由被预期的接头和该蛋白质的活性基团，基于聚合物和蛋白质化学的一般知识的化学共价键合。然而，没有反应产物的明确的实验证据和没有反应条件分析，它不应该被假定预期的化学反应实际上发生。的连接物结合的方法有缺点，因为它限制了显著可用底物的范围，限制在生物医学应用，这通常需要满足特殊要求它的使用。生物力学特性，低毒性，生物稳定性，和适合用于灭菌都是很重要的，并且可以决定基底的选择。另外，所述接头方法不适合，因为合适的基团在外部蛋白质表面所需和连接基化学可能影响构象的所有蛋白质。gydF4y2Ba

基于聚合物辐射损伤(等离子体处理，紫外光和离子束植入)实现蛋白质结合的方法可以提供强结合，可能是共价结合，到聚合物表面，并且已经实现，没有使用特定的连接基团[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba］．这些方法似乎广泛适用于许多聚合物表面和许多蛋白质。结合机理一直被认为是通过物理分子间的相互作用、表面的形态、活性基团(包括含氧基团或含自由基基团)，但目前还没有关于实际机制的直接证据。gydF4y2Ba

当聚合物受到离子束的修饰时，从碰撞离子到目标原子的能量转移发生，产生断裂的键，电离和大分子的电子和振动激发。对不同种类的聚合物在离子束冲击下的大量研究进行了报道和综述[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．用于改善聚乙烯上蛋白质附着的离子束植入[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba),聚四氟乙烯(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba),聚苯乙烯(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，以及尼龙[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]已经有报道。观察到改性聚合物表面与活性酶分子（包括辣根过氧化物酶（HRP）、大豆过氧化物酶、过氧化氢酶和原弹性蛋白）之间的强结合，同时保持了酶的催化活性。gydF4y2Ba

已经提出用于结合改性聚合物的蛋白质附着的提出机制彼此矛盾，并且不解释观察结果。例如，辐射损伤后聚合物表面中含氧基团的外观导致表面能量增加，尤其是其极性部分[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．如果假设蛋白质结合的机制是通过物理吸附，那么蛋白质在非极性表面的附着应该更强[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．因此，改性后的表面对蛋白质的吸引力应该会降低，这一结果并没有得到实验结果的支持[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］．修饰后蛋白质附着的增加与有效表面积的增加有关，但在对辐射修饰后的聚合物的一些研究中，表面形态没有改变或表面变得更光滑[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．含氧基团的出现被认为是蛋白质紧密结合的原因[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]，但在大分子中含有含氧基团的聚合物不经修饰不能提供强的蛋白质附着[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．本研究以等离子体浸没离子注入(PIII)技术实现聚合物表面修饰-离子束注入为例，旨在确定蛋白质附着的实际机理。特别地，我们研究了是否共价束缚是由表面能，表面化学，或形态。为了达到这一目的，我们将研究共价结合与含氧基团的存在、表面粗糙度和由接触角确定的表面能之间的关系。gydF4y2Ba

我们将PIII改性应用于低密度聚乙烯（LDPE）和超高分子量聚乙烯（UHMWPE）并附着HRP [gydF4y2Ba55gydF4y2Ba是一种广泛应用的酶，有现成的生物学、晶体学和光谱数据。聚乙烯聚合物应用于医疗设备，包括人体假肢，其中蛋白质附着起着重要作用。聚乙烯未经处理时是一种典型的高疏水性烃聚合物。离子束注入改性聚乙烯[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]已经调查过。gydF4y2Ba

2.实验gydF4y2Ba

低密度(LDPE)超高分子量(UHMWPE)聚乙烯(PE)薄膜购自Goodfellow。体育的gydF4y2Ba cm^2gydF4y2Ba0.200、0.020和0.075 mm厚度的面积在使用前用乙醇清洗并干燥至少一天。gydF4y2Ba

辣根过氧化物酶(HRP)猫。P6782和所有其他化学品都是从Sigma采购的。用于PIII的氮气纯度为99.99%。gydF4y2Ba

在电感耦合的射频等离子体中进行等离子体浸渍离子植入，该等离子体为13.56MHz。等离子体功率为100W，匹配时具有12W的反向功率。治疗过程中的等离子体密度由Handen分析有限公司的RF-Block监测治疗期间的血浆密度。基础压力为10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}托(~ 10gydF4y2Ba⁻⁴Pa)。氮气注入时的压力为gydF4y2Ba托(gydF4y2Ba Pa) and the pressure of argon during implantation was托(gydF4y2BaPa)。这种压力差为氮气和氩气等离子体提供了相同的等离子体密度。利用20 kV的偏置脉冲对等离子体中的离子进行加速gydF4y2Baμ.gydF4y2Ba在50hz的频率下，样品保持器的持续时间。聚乙烯的改性层厚度为70 nm，根据[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

样品被安装在一个不锈钢支架上，用一个不锈钢网，电连接到直径150mm的支架上，放置在样品表面前面45mm。在化学真空室实验中，使用直径为25mm的无网格样品架。gydF4y2Ba

根据对应于一个脉冲的流量乘以电量的高压脉冲的数量来计算离子液。通过将UV透射光谱与在此处使用的条件下的聚乙烯薄膜与植入的样品中的聚乙烯膜进行比较来确定一个高压脉冲的放气量来确定，以在先前的PIII和离子束处理实验中植入已知流动的样品[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

带网格的宽样品架的注量率为10gydF4y2Ba^13.gydF4y2Ba离子/厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba/秒，对于小样品持有人无网格为gydF4y2Ba离子/厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba每秒PIII治疗时间。对应于20-800秒的持续时间处理样品，对应于植入离子流量gydF4y2Ba离子/厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

对于不与空气接触的化学后处理，采用与等离子室相连的化学真空室。在等离子体处理过程中，化学室从等离子体室关闭(图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba). 将金属浴中的蛋白质溶液或丙烯酸溶液置于化学室中，泵送至溶液的蒸汽压力（20 托尔）。然后用氮气将腔室通风至大气压（750 托尔）。化学室的泵送和排气循环重复了5次，以将大气中的氧气从化学室中排出，直至gydF4y2Ba%或gydF4y2Ba托(estimation). Then the bath with solution was removed into bottom part and closed from main volume of the chemical chamber. Then the chemical chamber was pumped up to pressure of plasma chamber.

将样品压在直径为25mm的金属支架上，放入等离子室，进行处理。经PIII处理后的样品由机械臂取下，在残余压力为10的情况下进入化学室gydF4y2Ba^{−4gydF4y2Ba}－10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba} Torr. Then the plasma chamber was closed from chemical chamber. The chemical chamber was filled by nitrogen up to pressure of 20 Torr and the bath with solution was opened and moved up to the chemical chamber. The sample was immersed into the bath with solution. After exposure in solution the chamber was opened and the sample was used for an analysis.

使用无柄液滴法测量PE的润湿性。采用Kruss接触角设备DS10测量接触角。将去离子水和二碘甲烷滴在样品上，并测量下降边缘之间的角度和表面。使用Rabel模型与回归方法计算表面能量及其组分（极性和分散零件）。gydF4y2Ba

聚乙烯表面的光学显微照片，用显微镜Axioskop制成，蔡司安装有CCD照相机KS-100-3.0。用于治疗像蔡司软件。使用原子力显微镜（AFM）Rasterscope C-21（DME，丹麦）以软件双示波器/ Rasterscope SPM 1.3.2获得样品表面的三维图像。测量在FZR，德国完成。gydF4y2Ba

在PIII处理后，PE样品在HRP溶液（50%）中培养 gydF4y2Baμ.gydF4y2Bag/mL in 10 mM sodium phosphate buffer pH 7) overnight at 23°C. In kinetics study, the time of incubation varied. After incubation, PE samples were washed six times (20 minutes each wash) in buffer (10 mM sodium phosphate buffer pH 7). Samples for FTIR ATR spectral analysis were washed in de-ionised water for 10 seconds to remove buffer salts from the PE surface.

用两种方法测定HRP活性。在第一种方法中，PE样品(13 mm × 15 mm)夹在两块不锈钢板之间，由一个o形环(内径8 mm，外径11 mm)隔开，密封在等离子体处理表面。顶板包含一个直径5毫米的孔。在聚合物表面加入TMB分析。30秒后gydF4y2Baμ.gydF4y2BaL被取出并加入50 μ.gydF4y2BaL of 2 M HCl followed by 25 μ.gydF4y2BaL的未反应TMB使体积达100gydF4y2Baμ.gydF4y2BaL.然后用DU 530 Beckman分光光度计在450 nm波长下测量光密度。gydF4y2Ba

在第二种方法中，PE象限样本为1cmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba被置于紫外分光光度计比色皿的底部。具有10mm长度和0.5mm直径混合器棒和电微量电机的微混合物置于比色皿的顶部。混合器的速度为100 rpm。将比色皿置于分光光度计中，并将TMB溶液加入比色皿中。分光光度计记录在动力学模式下为635nm波长的光学密度。gydF4y2Ba

1的蛋白质溶液 通过稀释浓缩液制备ng/mL浓度，以分析对应于蛋白质单层的蛋白质催化活性。如此低的浓度会产生误差，因为蛋白质附着在玻璃壁上，聚合物体积用于稀释。稀释时体积表面的BSA密封用于蛋白质附着。gydF4y2Ba

PE样品的FTIR-ATR光谱使用Digilab FTS7000 FTIR光谱仪记录，该光谱仪配有ATR附件(Harrick, USA)，带有梯形锗晶体，入射角为45°。为了获得足够的谱带信噪比和分辨率，我们使用了500次扫描，分辨率为1 cmgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．PIII处理前后样品光谱的差值通过减法得到，用来检测与表面处理相关的变化。所有光谱分析均使用gram软件进行。gydF4y2Ba

在PIII处理后原位记录聚乙烯的FTIR ATR光谱。等离子体室与光谱化学室（图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.光谱仪的红外光束通过KRS-6窗口进入装有ATR附件的光谱室。在ATR附件后，光束通过KRS-6窗口返回光谱仪到探测器。光谱室在测量过程中处于与等离子室相同的真空状态。将聚乙烯样品置于等离子体室的高压电极上进行处理。在不破坏真空的情况下，用机械臂将处理过的聚乙烯样品从等离子室的高压电极置换到光谱室的ATR晶体。因此，在PIII处理和FTIR ATR光谱记录之间，样品没有被空气暴露。直径为2mm的ATR晶体具有半球面几何形状。由于红外光束聚焦，入射角度不同，并没有满足全反射衰减的条件。它提供了高灵敏度的分析，但定量测量是不可能的。 For comparison, the same ATR attachment was used at presence of air in the spectral chamber and the treated polyethylene sample was exposed on air after PIII treatment.

在Nd:YAG激光照射（2）的后向散射模式下记录了显微拉曼光谱gydF4y2Baω.gydF4y2Ba，波长= 532.14 nm)的衍射双单色光谱仪(HR800, Jobin Yvon)与LabRam 010系统(lasstek, Adelaide, SA, Australia)。利用光学显微镜对激发的激光束进行聚焦和收集拉曼散射光。使用了100个单位的目标。在拉曼信号采集过程中，根据安装在显微镜上的带电耦合装置摄像机投射到屏幕上的图像调整样品表面位置对准。调整激光束的强度以避免样品过热。光谱分辨率为4厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}被使用了。从100-4000的范围内选择扫描的数量，为光谱提供足够的信号/噪声比。Labram软件用于光谱分析。gydF4y2Ba

XPS测量是通过光谱仪(Specs, Berlin, Germany)完成的，光谱仪配备了Al x射线源，单色仪工作在200 W，半球形分析仪和9通道线延迟探测器。在通过能量为30 eV时，在0 ~ 1200 eV范围内获得了结合能的测量谱。gydF4y2Ba，gydF4y2Ba,gydF4y2Ba通过10次扫描，获得了23 eV的区域光谱，以获得更高的光谱分辨率和降低噪声水平。gydF4y2Ba在50次扫描和0.5 s停留时间下，通过能量为30 eV的区域光谱获得了更低的噪声水平。采用CASA软件进行光谱分析。gydF4y2Ba

3.结果与讨论gydF4y2Ba

3.1。PIII处理引起的聚乙烯表面层的结构变化gydF4y2Ba

被容易地观察到作为处理过的聚乙烯的变暗离子轰击的PIII期间的效果。暗颜色对应于聚乙烯，并用离子注量的增加的表面层的碳化。暗色残留与水的改性聚乙烯表面的洗涤后，缓冲液和有机溶剂甲苯，乙醇和丙酮。碳化由拉曼和紫外可见光谱研究。gydF4y2Ba

改性表层的微拉曼光谱显示出纯碳结构的振动模式的峰，而不显示任何归因于聚乙烯大分子振动的线(图)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.拉曼光谱仪聚焦激光束的光斑约为10gydF4y2Baμ.gydF4y2Bam, larger than the thickness of the modified layer of polyethylene (70 nm). The intensity of the carbon lines is significantly higher than the intensity of the polyethylene lines because of a resonance Raman effect which is observed because the laser wavelength is resonantly absorbed by the electrons in the carbon structures. The spectrum is fitted by individual Gauss functions with maxima at 1587 cm^{−1gydF4y2Ba}和1350厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．这些行被解释为gydF4y2Ba振动(“G”峰在1587厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}),gydF4y2Ba振动（“D”峰值在1350厘米处gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})的石墨结构[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．利用已知的拉曼峰强度比的相关关系gydF4y2Ba我gydF4y2Ba(D) /gydF4y2Ba我gydF4y2Ba(G)和D、G峰位置与石墨结构域特征尺寸[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba，发现碳化层由特征尺寸为1 nm的石墨岛组成。gydF4y2Ba

碳化程度的定量分析可以从聚乙烯薄膜的紫外可见光谱中提取。未经处理的聚乙烯在小于250 nm的短波长有吸收。经piii处理的聚乙烯薄膜的紫外-可见透射光谱显示出广泛的吸收(图)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba由于离子的流量增加，肩膀逐渐转向红色并增加强度。gydF4y2Ba

吸光度的这些改变可以从两个不同的观点来查看。吸光度是通过不饱和的碳结构，其中包括稠合芳环和多烯基团引起的。在不饱和的碳结构体的缀合区域的尺寸的增加会导致其吸收发生红移。因此，吸收显示强度的观测红移和增加有不饱和基团的浓度的逐步增加和在大小共轭结构与PIII治疗的通量增加。For example, the shoulder of absorbance for polyethylene after 1600 sec of PIII treatment is observed at 2.5 μ.gydF4y2Bam波长，对应于由共轭芳香环组成的大岛，这些环排列在石墨状结构纳米石墨岛中。使用伍德沃德-费瑟法则[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba], the absorbance at 2.5 nm wavelength corresponds to graphitic island containing about 40 conjugated aromatic rings, that would have characteristic size of about 1.5 nm. This value is comparable with the 1 nm size of graphite islands estimated from the Raman spectra.

吸光度的移动对应于价电子和传导电子对应的能带之间的间隙减小。众所周知的Tauc公式可用于计算离子束注入聚合物中的能隙，如所示[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．随着PIII注量的增加，未处理聚乙烯的能隙从3 eV缩小到1600秒处理聚乙烯的0.6 eV。gydF4y2Ba

在电子自旋共振(ESR)谱图中观察到改性聚乙烯中与自由基相关的未配对电子的出现，如图所示gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．未处理的聚乙烯薄膜含有低浓度的未配对电子。作为所接受聚合物的自由基可以通过诸如光，温度和氧气种类（臭氧，过氧化物和激发氧分子）以及在聚合过程之后剩余的被困的残留自由基的环境因素产生。未处理样品的ESR强度如图所示gydF4y2Ba4gydF4y2Ba对应于50个散装样品中自由基的天然浓度 μ.gydF4y2Bam厚度。gydF4y2Ba

处理后样品ESR光谱的主要贡献来自70 nm厚度的改性表层。考虑到聚乙烯薄膜厚度的差异(50gydF4y2Baμ.gydF4y2Bam)和修饰层(70 nm)时，经piii处理的样品的ESR信号增加了160倍，相当于增加了10倍gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba与未处理材料相比，piii处理的表层自由基浓度增加了一倍。在室温下，ESR谱强度随样品储存时间的延长而缓慢降低，表明未配对电子是自由基反应的结果。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaggydF4y2Ba-因子(0.0028)的ESR信号接近gydF4y2BaggydF4y2Ba的自由电子（0.0025）和对应于α-因子gydF4y2BaggydF4y2Ba-石墨结构上离域的未配对自由电子因子[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba82gydF4y2Ba］．这些电子的原始位置可以在石墨结构的边缘。由于未配对电子的活性较高，在室温条件下寿命较短。在piii处理聚乙烯的情况下，自由基的节省是由于未配对电子的离域gydF4y2BaπgydF4y2Ba因此，自由基不可能被放置在石墨岛附近的氢、氧或其他活性粒子终止。芳香环gydF4y2BaπgydF4y2Ba-电子稳定这些未配对的电子。gydF4y2Ba

处理后聚乙烯的FTIR ATR光谱显示，经过PIII处理后，聚乙烯的表面层发生了显著变化(图)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.从1700到700厘米的宽连续带gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}被解释为无序碳化层中的振动，在PIII处理后出现。该条带的强度随着PIII治疗的持续时间而增加。碳化层的振动模式具有很宽的频率分布。对应于单个碳结构的振动状态没有被解析。gydF4y2Ba

在处理样品的光谱中观察到与新结构相关的一些窄振动线。这些线在1750-1600厘米的区域gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}对应于gydF4y2Ba(CgydF4y2Ba羰基、羧基、醛、内酯基团的振动gydF4y2Ba(CgydF4y2BaC)不饱和碳氢化合物碎片和芳香环的振动。在921厘米、907厘米和887厘米处有窄峰gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}观察到对应于乙烯基，偏二乙烯基和亚乙烯基。区域中的宽线3600-3200厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}对应于gydF4y2BaνgydF4y2Ba羟基、羧基和过氧化物的(OH)振动。gydF4y2Ba

由PIII处理引起的所有这些光谱变化被观察到叠加在未改性聚乙烯大分子的强烈振动光谱上，这包括不对称和对称的拉伸振动gydF4y2Ba(C-H)在2917及2860厘米处gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}， -CH中的弯曲振动gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba——组gydF4y2Ba(C-H) 1462厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}和chgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba分枝端群在1375厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，以及平面外振动gydF4y2Ba（C-H）在720/730厘米处gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}紧身上衣。未改性聚乙烯大分子的谱线强度高于新引入基团的谱线强度。强度的差异对应于修正层厚度(70 nm)与FTIR ATR分析深度(700-400 nm，取决于波数)的比值。gydF4y2Ba

与含氧基团(CgydF4y2BaO和OH)表明，改性层的氧化发生在聚乙烯样品暴露在空气中后。等离子室中剩余的氧的分压预计不超过10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}托。因此，氧进入改性聚乙烯结构的速率为10gydF4y2Ba^{−7gydF4y2Ba}在等离子室中的时间比在空气中的时间短。gydF4y2Ba

数字gydF4y2Ba6gydF4y2Ba示出了未氧化的PIII处理过的表面的ATR-IR光谱中观察到的原位与空气样品的接触之前。这些光谱表明，聚乙烯的改性层不含有包含基团的任何氧气当样品处理后暴露在空气中，在同一样品显示的光谱的gydF4y2Ba(CgydF4y2BaO)和gydF4y2Ba含氧基团的(OH)线。我们得出结论，含氧基团出现在表层是与空气反应的结果，而不是与等离子室中的残余氧反应。gydF4y2Ba

改性后的含氧基团谱线强度随时间增加而增加。例如，在1712厘米处羰基振动对吸收的依赖关系gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}上存储的时间后PIII呈现于图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．的归一化吸光度gydF4y2Ba(CgydF4y2BaO)随在空气中储存时间的延长而增加。这意味着表层羰基的浓度随着时间的增加而增加。羰基的饱和浓度取决于离子注量(PIII时间)。在PIII治疗的中位时间(80秒)观察到最大浓度，对应的离子通量为10gydF4y2Ba^15.gydF4y2Ba离子/厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．piii处理的聚苯乙烯在这样的离子通量下氧化最大时也观察到了同样的效果，这提供了最高水平的大分子破坏，但没有一个完全碳化的表层[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．这意味着氧化主要是由大分子链与大气氧的破坏所产生的自由基相互作用引起的。由于自由基的稳定，碳化结构的出现降低了氧化水平gydF4y2BaπgydF4y2Ba-电子云如上所述。gydF4y2Ba

暴露在氧气中会促进氧化过程，而暴露在水中则不会。经piii处理的聚乙烯在水中的储存动力学与改性聚乙烯在空气中的储存动力学表现出相同的含氧基团浓度曲线。在水中储存不会引起OH的增加;例如，的依赖性gydF4y2Ba(OH)线吸光度在3400 cm处gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}波兰伯在图中呈现gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．样品经PIII处理后立即放置gydF4y2Baμ.gydF4y2BaQ-water。从空气放气到放入水中，暴露空气时间为2-3分钟。与动力学过程的某些天相比，这是一个相对短的时间。水中的氧化是由于水中的氧气溶解而发生的。样品在光谱测量前被保存在水下。从水样中去除，在空气中进行光谱测定。当水从聚乙烯表层完全蒸发后(可达3小时)gydF4y2Ba(OH)吸光度点与空气氧化动力学的曲线相同。在空气和水下储存的样品，最大值的位置和线的形状是相似的。这意味着在水中储存不会改变氧化动力学，并且在氧化过程中水的存在不会起作用。同样的相似的氧化动力学被观察使用gydF4y2Ba(CgydF4y2Bao）振动线。gydF4y2Ba

用XPS谱观察了化学结构的变化。未处理聚乙烯的光谱具有单线态gydF4y2Ba线和低强度gydF4y2Ba线(碳线强度的0.1%)显示了聚乙烯表面在光线、大气氧气和宇宙射线等环境因素下的氧化(图)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.PIII处理，光谱显示了在gydF4y2Ba，gydF4y2Ba,gydF4y2Ba多重线路。这些线的配合给出了单独的新键峰，如C-O，CgydF4y2BaO,碳氮,CgydF4y2BaN, N - o, NgydF4y2BaO.氧气的出现（图gydF4y2Ba9(一个)gydF4y2Ba)在高浓度下（占总元素的10%），这与通过PIII处理的聚乙烯的FTIR光谱观察到的新含氧基团以及先前的结果一致[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．氮离子注入PIII后聚乙烯中的氮可以用注入改性层的氮离子的捕获来解释。聚乙烯中氮(总元素的2%)与氩离子PIII后(图gydF4y2Ba9 (b)gydF4y2Ba)只能用改性聚乙烯在空气中暴露处理过的样品后与大气氮的反应来解释。gydF4y2Ba

在PIII期间和之后聚乙烯表面层的结构变换可以通过自由基反应来解释。有广泛的文献文献讨论了聚乙烯中的自由基反应，由不同种类的辐射产生，包括离子束植入，UV，VUV，电子束，γ辐射，X射线照射[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba85gydF4y2Ba］．由离子引起的反应例子(gydF4y2Ba)如（方案）所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.许多这些反应都涉及离子产生的自由基(R•)。gydF4y2Ba

结果表明，聚乙烯的初始结构以双键基团、缩合芳香环、交联和无定形碳为主。在非常高的影响下，结构转变为高度交联的非晶碳。gydF4y2Ba

将处理过的表面暴露在大气中后，氧化反应就会发生，如(方案)所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

形成羰基、羧基、醛、羟基、酯、醚等稳定的含氧基团。gydF4y2Ba

在将处理过的表面暴露于大气之后，可以遵循大气氮的反应，如（方案）所示的那些gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

含sp的碳结构gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba和sp.gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba红外光谱和拉曼光谱观察到大分子中的杂化、含氧基团和不饱和碳碳键，如图所示。一些自由基在改性的表面层中保持活性，即使在PIII处理后很长一段时间内仍保持活性。改性聚乙烯表面的化学结构解释了它在许多不同化学反应中的反应性。gydF4y2Ba

在光学显微镜和AFM扫描模式下观察到，PIII后的聚乙烯表面产生了带有波纹的纹理(图)gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba）.横向波段是gydF4y2Baμ.gydF4y2Bam和波的峰值幅度的峰值是关于gydF4y2Baμ.gydF4y2Bam.假设波纹是正弦的，聚乙烯的有效表面积增加了gydF4y2Ba*在旧机器。产生波纹结构的原因可能是表层碳化、脱水过程和交联引起的内应力。所有这些过程都减小了改性层的体积。聚乙烯薄膜在轧制过程中产生的残余应力可能会影响起皱的方向。在我们的实验中，改性层为70 nm，大大小于未改性PE层，从而使内应力的弛豫在改性层中得到了调节。gydF4y2Ba

3.2。PIII改性聚乙烯的表面能gydF4y2Ba

未处理聚乙烯表面疏水，水滴在未处理聚乙烯表面的润湿角大于90°。在PIII处理后，水接触角立即变得非常低，接近24°，即非常亲水(图)gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba）.甲酰胺、亚甲基碘化物和甘油滴液的润湿角也有相同的急剧变化。总表面能从24 MJ/m增加到67 MJ/mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba）.总表面能的极性部分和色散部分的贡献是不同的。极区表面能从4 MJ/m显著增加gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba44 MJ / mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．分散部件不会从20 mj / m换多少gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba到22 mj / mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

piii改性聚乙烯的润湿角和表面能随贮存时间的延长而不稳定。在空气中储存2周后，水接触角增加到60-70°。总能量降至44 MJ/mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba时，表面能的极性部分降至14 MJ/mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．表面能的弥散部分略有增加，达到30 MJ/mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

表面能的增加是由改性聚乙烯表面的化学变化引起的，特别是高能极性基团的出现。等离子体处理、紫外光、电子和gydF4y2Baγ.gydF4y2Ba-照射[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．在储存改性材料后观察到的表面能下降可能与等离子体聚合或聚合物表面等离子体处理后观察到的类似表面能下降有相同的起因[gydF4y2Ba86gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在等离子体处理的聚合物中，表面能随时间的降低和疏水性的恢复归因于表面聚合物链的扩展或扩散，以及高能量表面官能团的旋转回到聚合物体中[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]. 因此，表面能降低，疏水性增加。然而，对于经PIII处理的表面层，如图所示，聚合物链的扩散应受到与高通量改性后出现的高碳化结构相关的致密交联的阻碍。gydF4y2Ba

在我们的实验中，piii处理的聚乙烯并不能解释聚合物表面的高能量表面官能团在水等极性介质中的旋转。虽然浸入水中后，接触角从60-70°降低到51°，但我们的FTIR数据(图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)表明，这与对水的吸收有关，而不是与高能量基团的旋转有关。-OH基团的浓度在与水接触后明显增加，然后又逐渐下降。水分子在piii修饰层中停留的时间比水滴从表面蒸发所需的时间更长。这可能与水分子对含氧基团和自由基的吸收有关，这将导致水分子从改性的表面层缓慢扩散。通过OH线强度的降低，完全去除水分子后，水接触角再次增加到56°。因此，改性层在水中暴露后恢复高润湿性的原因是改性层中存在扩散的水，浸泡后接触角低是由于表层水-水相互作用的强贡献。gydF4y2Ba

疏水恢复的另一种可能的解释可能是，在大气暴露期间，活性表面吸附了不定标碳和碳氢化合物[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．尽管实验室气氛不受控制，但润湿性的变化是可重复的，FTIR-ATR光谱没有显示出任何归因于表面吸附的碳氢化合物的线的显著增长。此外，在10以下，水润湿角在空气和真空中的衰减是相同的gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}托的压力。在最后一种情况下，不定形碳和碳氢化合物在活化表面的吸附被排除或减少。因此，可以排除衰变的吸附机制。gydF4y2Ba

我们认为改性后用储存时间观察到的表面能的变化与改性聚乙烯表面的化学变化有关。这些转化的性格和动力学是复杂的，并且取决于具有不同反应速率的许多反应。可以应用大规模化学来模拟这些变换。这些弛豫过程可以使用对应于一阶反应的指数函数来装配。指数功能适用于表面能量的总组成部分，实验数据与实验数据之间的一致性，找到了理论曲线（图gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba）.拟合曲线为双指数函数形式gydF4y2Ba 在哪里gydF4y2Ba和gydF4y2Ba是典型的衰亡期，gydF4y2Ba为无限储存时间后改性聚乙烯的表面能，(gydF4y2Ba)值为经PIII处理后改性聚乙烯立即的表面能。对实验点进行拟合后，得到了表面能的极性部分和弥散部分的方程:gydF4y2Ba 在哪里gydF4y2Ba在几分钟内。特征时间表明，在PIII处理后3-4天稳定改性聚乙烯的润湿性。PIII处理后的总表面能为67 MJ / mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba极性分量为46 兆焦耳/米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．无限储存时间(35 MJ/m)后的表面能gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba4兆焦耳/米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba极性组分)与未处理聚乙烯表面的值(23.8 MJ/m)不同gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba3.7 MJ/mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba极地组件)。表面能的变化主要是由极性分量决定的。表面能的弥散分量保持在20 ~ 30 MJ/m范围内gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba用于未处理和改性聚乙烯表面。gydF4y2Ba

PIII处理后的总表面能(67 MJ/m)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba）远高于通常报道的聚合物的平衡性，其显示出的总表面能量不超过45-50 mJ / mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba88gydF4y2Ba］．高表面能有两个可能的来源:新引入的含氧极性基团和自由基。文献研究表明，表面能高达67兆焦耳/米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba不能用我们观察到的新极群来解释。所报道的含羰基的表面能均小于50 MJ/mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba88gydF4y2Ba例如，具有高浓度C的聚甲基丙烯酸甲酯gydF4y2BaO主干中的组（49 兆焦耳/米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba），用骨架中的芳环和羰基的聚碳酸酯（46.7 mJ / mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)，聚醚酯酮PEEK，主链上含有醚、酯和芳香环基团(46 MJ/m)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba）.在氢化和氧化表面的金刚石和石墨表面的情况下，47 mJ / m的表面能gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba和65。8 MJ/m^2gydF4y2Ba，分别有报道[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba]. 观察到富勒烯的低表面能，其表面没有未配对电子（48.1 兆焦耳/米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba90gydF4y2Ba]和碳氮化物（51.9-41.9 mj / mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba91gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

像石墨和钻石这样的碳结构的表面能对表面悬浮键的存在很敏感。以未配对电子端接的碳结构的表面能在4000 MJ/m范围内gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba到1000 兆焦耳/米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba92gydF4y2Ba，gydF4y2Ba93gydF4y2Ba］．这种高的表面能是由于在表层存在自由基而产生的。我们不期望我们的改性聚乙烯表面被与自由基结合的自由电子所覆盖;然而，较高的表面能确实表明，PIII处理导致了大量自由基的生成在新处理的聚合物表面。自由基在改性聚乙烯表面的存在和消失改变了表面能的极性成分，而不是像预期的自由解耦电子的强极性静电相互作用的色散成分。gydF4y2Ba

因此，我们提出，piii改性聚乙烯的润湿性和表面能的大部分变化是由与润湿液接触的表层自由基引起的。未经处理和piii改性聚乙烯在长时间储存后的表面能残留差异与自由基反应完成后出现的稳定基团相连。gydF4y2Ba

所呈现的上述结果表明，PIII处理的表面已急剧变化。表面变得更富有，具有极性分子间相互作用;化学基团如羟基，羰基，羧基，醛，酯，醚，碳不饱和基团，芳族凝聚结构和自由基的数量改变表面层的化学活性;表面形态的变化具有更高的有效表面积。gydF4y2Ba

3.3。改进蛋白质在PIII处理表面上的附着gydF4y2Ba

在HRP缓冲液中孵育期间，未经处理的聚乙烯表面附着蛋白质分子。在不含蛋白质的缓冲溶液中培养的聚乙烯表面的FTIR ATR光谱减去其光谱后显示了3300厘米的特征线gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}酰胺A，1650 厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}酰胺I和1540厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}相关的蛋白质分子的强烈吸收振动模式酰胺II（图的gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba）.在蛋白溶液中孵育的piii修饰的聚乙烯的光谱也显示了相同的谱线。然而，经过piii处理的表面光谱中的蛋白谱线比未经处理的聚乙烯样品的光谱更强烈。我们已经开发了一种标准化程序，用于使用所有三种酰胺系定量测量附着蛋白的数量。gydF4y2Ba

蛋白质谱线的强度明显低于聚乙烯的振动谱线。这与蛋白质层比红外光束的穿透深度更薄是一致的。因此，聚乙烯线的强度可以作为蛋白质光谱的内归一化标准。根据布格-兰伯特-比尔定律，吸光度(gydF4y2Ba)的红外透射谱图gydF4y2Ba 在哪里gydF4y2Ba是吸收基团的浓度，gydF4y2Ba是层的厚度，和gydF4y2Ba消光系数、结构效应是否可以通过浓度的变化来分析gydF4y2Ba的组。在ATR光谱的情况下，红外光束直接穿透到晶体附近的样品的深度是gydF4y2Ba 在哪里gydF4y2Ba为红外光束对样品的穿透深度，gydF4y2Ba为ATR晶体与样品折射率之比，λ为红外光束波长。附着蛋白的有效含量gydF4y2Ba可以使用计算gydF4y2Ba 在哪里gydF4y2Ba（酰胺gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba)为的吸光度gydF4y2Ba酰胺线，gydF4y2Ba（CHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba）是-CH的吸光度gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba-在2917厘米处拉伸振动线gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}或1462厘米处的弯曲振动线gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，gydF4y2Ba正常化系数为酰胺的比例 -gydF4y2Ba/酰胺I消光系数乘以红外光束在酰胺处的穿透深度比gydF4y2Ba我gydF4y2Ba和酰胺I波数。与未处理聚乙烯相比，piii修饰聚乙烯上的蛋白附着量大约增加了一倍。在我们之前用聚苯乙烯做的实验中也观察到了同样的差异[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，特氟隆[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]和尼龙[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

XPS光谱还观察到蛋白质的存在。具有和不具有附着的HRP蛋白的PIII处理的聚乙烯表面的XPS光谱在图中提出gydF4y2Ba14（a）gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba14 (d)gydF4y2Ba．蛋白溶液孵育后的样品用洗涤液冲洗gydF4y2Baμ.gydF4y2Baq -水，干燥后置于XPS光谱仪的真空室中。XPS谱记录在gydF4y2Ba，gydF4y2Ba，gydF4y2Ba,gydF4y2Ba地区。HRP蛋白单层预计不高于7-9 nm;因此，即使聚合物完全被蛋白质层覆盖，x射线束也会穿透蛋白质层，进入聚合物表面。因此，光谱显示了不同比例的蛋白质层峰和聚合物表面峰。减去聚合物表面的XPS光谱将只得到蛋白质层的光谱。gydF4y2Ba

的gydF4y2Bapiii处理聚乙烯表面的碳峰(图gydF4y2Ba14（a）gydF4y2Ba）由于存在含氧和含氮基团，是多重。的gydF4y2Ba285 EV的峰值在主峰的高能侧有一根长的尾巴。具有附着的HRP的PIII处理的聚乙烯的光谱显示在286.7和288.3 eV中清晰可见的肩部。这种尾部的拟合分析是有问题的，因为PIII处理的表面层中的不同含氧和含氮基团的高可变性。然而，减法过程可以给出分离的蛋白质光谱，其相应地归因于C-N和C = O组的286.7和288.3 eP峰。在硅晶片衬底上制备为厚层的HRP的XPS光谱，观察到相同的峰。gydF4y2Ba

未经处理的聚乙烯的XPS光谱没有显示氮(gydF4y2Ba)线，而经piii处理的聚乙烯含有少量的氮，并显示氮峰(图gydF4y2Ba14（b）gydF4y2Ba）.这种氮峰的存在可以解释为自由基与注入氮和PIII处理后空气中吸收的氮发生反应。辣根过氧化物酶(HRP)蛋白的附着在酶的顶部在400.3 eV处有一个额外的峰gydF4y2BaPIII处理聚乙烯的峰值。减法显示蛋白质gydF4y2Ba峰值如图所示gydF4y2Ba14（b）gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

氧气gydF4y2Ba只有经过PIII处理后，聚乙烯的XPS谱才会出现峰，这是由于聚乙烯表层在空气中氧化的结果。这个峰由C - O和C=O键中氧的两个单独的峰组成(图)gydF4y2Ba14 (c)gydF4y2Ba）.HRP蛋白的表面上的存在增加的强度gydF4y2Ba峰HRP含有氧。的subtracted spectra also show peaks at 531.85 and 533.05 eV attributed to oxygen in C–O and C=O bonds of HRP respectively.

在HRP蛋白中含硫氨基酸半胱氨酸和甲基半胱氨酸的存在引起gydF4y2Ba峰值与附HRP PIII处理过的聚乙烯的XPS光谱（图gydF4y2Ba14 (d)gydF4y2Ba）.HRP蛋白含有10个半胱氨酸和7个甲基半胱氨酸残基，一个HRP分子中含有17个硫原子。根据辣根过氧化物酶分子的结构，硫的含量可以计算为0.54原子%。经过piii处理的聚乙烯表面的HRP分子的XPS谱显示，由相对硫比计算出的硫的原子%为0.16gydF4y2Ba峰值强度为gydF4y2Ba，gydF4y2Ba,gydF4y2Ba峰值强度。这是一致的结果，因为XPS光谱仪的X射线束穿透样品的深度大于HRP单层的最大可用厚度（HRP分子的最长尺寸为7） 纳米）。没有HRP连接的样品的XPS光谱没有显示gydF4y2Ba峰值高于噪声水平（±0.04％）。gydF4y2Ba

从元素的强度很难确定HRP蛋白的附着量gydF4y2Ba，gydF4y2Ba,gydF4y2Ba峰。蛋白质峰值重叠了PIII处理的聚乙烯的相同峰。XPS分析的渗透深度接近蛋白质层的厚度，并且不能使用减去光谱来一致减去聚乙烯峰。的gydF4y2Ba区域可用于分析，因为聚乙烯中没有硫，但是硫原子的浓度和相应的强度gydF4y2Ba蛋白质在蛋白质中较低，并提供有限精度的定量测量。遵循这些结果，我们使用XPS在表面上的蛋白质的定性分析，仅对FTIR结果的额外支持。gydF4y2Ba

3．4．附着蛋白的构象gydF4y2Ba

知识附着蛋白的构象对于了解蛋白质分子的活性及其在生物系统中的功能是重要的。未处理的烃聚合物材料上的附着HRP蛋白质不保持其天然构象[gydF4y2Ba94gydF4y2Ba］．我们在FTIR ATR光谱法中研究​​了使用酰胺I系在PIII处理的聚乙烯上的附着蛋白的构象。gydF4y2Ba

HRP在酰胺I区域的光谱进行分析的锗晶体干燥散装HRP蛋白，以及用于在PIII处理的聚乙烯表面附着HRP蛋白。体层被选择作为对照，因为与任何衬底中的蛋白质分子的相互作用是不存在的。在用于在PIII处理的聚蛋白中的酰胺I和II区中的光谱类似，在相同的区域中的频谱上的Ge晶体的本体层。最大值，线的宽度和形状的位置保持时的蛋白共价连接是相同的。gydF4y2Ba

详细的分析是通过使用单个峰拟合酰胺I区来完成的。这些单独的峰代表了蛋白质分子中存在的不同结构:gydF4y2Baα.gydF4y2Ba- 然后，gydF4y2BaβgydF4y2Ba-片和随机链。蛋白质的个体构象的特点是这种结构的浓度的独特数量。构象的变化导致这些结构的相对浓度的变化。gydF4y2Ba

对于确定单个峰的数量和位置的第一近似，评估测量光谱的第二衍生物和使用傅里叶变换的折射率和使用傅里叶变换的去卷积进行评估，并借助于文献解释[gydF4y2Ba95gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba97gydF4y2Ba］．一个简单的无约束拟合程序提取多个组件不令人满意，因为组件的位置和宽度不能很好地确定。因此，拟合过程是通过将单个峰的宽度和位置限制在一个狭窄的范围内来进行的。拟合结果如图所示gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba．1683厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}和1676厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}谱线被解释为区域的振动gydF4y2BaβgydF4y2Ba-转，1661和1649厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}线条是由振动引起的gydF4y2Baα.gydF4y2Ba-螺旋，线在1636厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}归因于随机结构和1623厘米的线gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}被解释为gydF4y2BaβgydF4y2Ba表。使用(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，蛋白质链结构的相对浓度是根据单个峰的强度计算的。gydF4y2Ba

根据拟合结果，大干层的HRP蛋白含量为49%gydF4y2Baα.gydF4y2Ba螺旋线,23%gydF4y2BaβgydF4y2Ba-turns，随机结构的17％，和11％的gydF4y2BaβgydF4y2Ba表。该结构与参考数据的50%吻合gydF4y2Baα.gydF4y2Ba由x射线衍射测定的HRP晶体螺旋[gydF4y2Ba98gydF4y2Ba]和30-40％的gydF4y2Baα.gydF4y2Ba- HRP在PBS缓冲溶液中的螺旋[gydF4y2Ba97gydF4y2Ba］．附着层的光谱强度明显低于散装蛋白质层，但噪声水平仍然足够低，可以得到有用的拟合结果。附着在未经处理表面的蛋白质含有45%的gydF4y2Baα.gydF4y2Ba螺旋线,19%gydF4y2BaβgydF4y2Ba-turns，14％随机结构和17％的  βgydF4y2Ba表。piii处理表面附着蛋白的构象为43%gydF4y2Baα.gydF4y2Ba螺旋线,23%gydF4y2BaβgydF4y2Ba-回合，14%随机结构，12%gydF4y2BaβgydF4y2Ba表。这些值接近散装层中HRP蛋白的值。因此，我们得出结论，PIII处理的聚乙烯表面上共价连接的单层中HRP蛋白的构象保持与堆积层中的相似。gydF4y2Ba

3．5．附着蛋白的催化活性gydF4y2Ba

附着的蛋白质对过氧化氢的分解反应具有催化活性。活性是由卟啉环与钙离子作为其活性中心与过氧化物分子的相互作用提供的。当蛋白质的构象发生改变时，蛋白质的活性就丧失了。因此，蛋白质活性的分析可以作为HRP天然构象存在的简单测试。gydF4y2Ba

辣根过氧化物酶(HRP)活性可用TMB和ABTS法测定。检测分子通过与氧离子反应而改变，氧离子来自催化分解的过氧化氢。分析分子的变化是用溶液的颜色定量的，用紫外可见光谱法测定光密度。分解反应的速率取决于溶液中活性蛋白分子的浓度。因此，测试溶液的光密度可用来测量蛋白质的活性。在高浓度过氧化物的情况下，反应速率遵循一阶依赖于蛋白质分子的浓度:gydF4y2Ba 在哪里gydF4y2Ba为彩色检测产物分子的浓度，gydF4y2Ba是附着在表面的活性蛋白的浓度。gydF4y2Ba

TMB溶液的光密度，其中，与连接蛋白未处理的和PIII处理的聚乙烯浸入，显示在图gydF4y2Ba(16日)gydF4y2Ba．溶液中游离蛋白的量被监测，发现是很小的，所以所有检测颜色的变化都是由表面附着蛋白引起的。此外，还证实了改性前后的聚乙烯的催化活性均为零。gydF4y2Ba

为了比较溶液中分子的活性与附着在表面上的那些，用相同的测定测试溶液中的蛋白质活性。通过稀释对应于80ng / cm的已知量的蛋白质来制备溶液中的浓度gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba蛋白质在完全覆盖的表面[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．在稀释过程中，所有玻璃容器的壁都被牛血清白蛋白阻断，以防止由于HRP附着在玻璃壁上而导致蛋白丢失。gydF4y2Ba

附着蛋白在未经处理的聚乙烯上的反应动力学曲线比在piii处理的聚乙烯上的反应动力学曲线低2倍。因此，piii处理表面的活性蛋白的数量比未处理表面的蛋白高2倍。这个差异对应于FTIR ATR光谱所证实的附着在表面的蛋白质总量的差异。gydF4y2Ba

溶液中稀释蛋白在溶液中的动力学曲线高于PIII处理表面上的附着蛋白质。因为HRP在聚合物表面上形成单层，所以活性蛋白的量接近在实验误差内附着在改性表面上的总蛋白质的量。通过在进入蛋白质的活性中心的测定分子中的测定分子的空间阻断，可以解释附着在表面上的溶液和蛋白质中稀释蛋白质的差异。聚合物表面在一侧的存在和表面上的蛋白质分子的致密包装均有助于空间障碍。包装密度对活动的影响如图所示gydF4y2Ba16 (b)gydF4y2Ba作为蛋白质活性的一个函数图，由FTIR ATR测量的蛋白质附着量。曲线的饱和显示出对分析的空间位阻效应。gydF4y2Ba

3.6。附着蛋白的稳定性gydF4y2Ba

只有在缓冲溶液中清洗足够的时间，才能从未经处理的聚乙烯表面去除附着的蛋白质。洗涤动力学如图所示gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba并且由蛋白质和表面之间的分子间相互作用的破坏的概率来确定。附蛋白质的活性正比于蛋白质的量。gydF4y2Ba

从未经处理的聚乙烯表面附着蛋白可以通过洗涤洗涤剂中更迅速地除去。洗涤剂十二烷基硫酸钠（SDS），Triton X-100和吐温20被用于洗涤。这些洗涤剂被接受为有效洗涤剂从不同的表面洗蛋白远[gydF4y2Ba99gydF4y2Ba，gydF4y2Ba100.gydF4y2Ba］．由于在洗涤剂分子的极性和非极性的化学基团的存在，这些洗涤剂提供了许多与蛋白强相互作用并破坏蛋白质分子与聚乙烯表面之间的分子间相互作用。一旦相互作用被破坏，所述蛋白质分子被洗掉。上的未处理的聚乙烯表面这一过程是由在FTIR光谱的蛋白质峰的消失和蛋白的活性的洗涤后在洗涤剂中损失观察到。gydF4y2Ba

由于连接在PIII处理的聚乙烯上的部分蛋白质可以在缓冲液中洗涤，因此该部分蛋白质不共价键合。然而，即使在长时间洗涤后，一些蛋白质仍然在PIII处理的聚乙烯表面上附着在PIII处理的聚乙烯表面上。在SDS，Triton X100和Tween 20洗涤剂中洗涤后，相同量的蛋白质残留在PIII处理的蛋白质上。由于蛋白质分子与PIII改性表面之间的强相互作用，这些蛋白质分子不能被洗掉。这种强相互作用不能通过物理分子间相互作用提供，但可以通过蛋白质分子与表面之间的化学键形成来解释。即使在长洗涤时间之后，这些化学键也不能与这些洗涤剂破裂。gydF4y2Ba

以前已经证明，蛋白质的附着取决于其环境的pH值(缓冲液)[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba101.gydF4y2Ba］．实验测试了pH对辣根过氧化物酶(HRP)吸附的影响。从不同pH值的缓冲液中提取的蛋白质分别附着在未经处理和经piii处理的聚乙烯表面。通过傅里叶变换红外光谱法(FTIR ATR)测定了附着蛋白的量，结果发现，无论是未经处理的聚乙烯还是经过处理的聚乙烯，附着蛋白的量都不取决于缓冲液的pH值，如图所示gydF4y2Ba(18日)gydF4y2Ba．在pH6 ~ pH8范围内，用FTIR - ATR光谱法测定了SDS洗涤剂洗涤后共价附着蛋白的量，发现共价附着蛋白的量与浸泡液的pH无关。gydF4y2Ba

一般来说，在缓冲液中加入离子化合物会改变缓冲液的离子力，并能改变浸在缓冲液中的表面对蛋白质的吸收[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba101.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba102.gydF4y2Ba］．实验考察了添加NaCl对辣根过氧化物酶(HRP)蛋白附着的影响。不同浓度NaCl溶液中的蛋白质分别附着在未经处理和经piii处理的聚乙烯表面。FTIR ATR谱图显示，在0 ~ 1 mMol范围内，蛋白质的附着量和共价键合量不依赖于盐浓度(图)gydF4y2Ba18 (b)gydF4y2Ba）.观察到各种浓度的Mg的相同的结果（OH）gydF4y2Ba_2gydF4y2BaHRP溶液中的添加剂。gydF4y2Ba

在过夜孵育后，在缓冲液中，在处理和未处理的聚乙烯上连接的HRP的浓度依赖性（图gydF4y2Ba图18（c）gydF4y2Ba）.在低浓度区域(高达10 mg/mL)，随蛋白浓度的增加，未处理聚乙烯上的蛋白附着量增加。这可以用蛋白质与聚乙烯表面接触的概率增加来解释。在高浓度区域(从10 mg/mL的蛋白质)，附着在未经处理的聚乙烯上的蛋白质的数量不依赖于溶液中的蛋白质浓度。在所有应用浓度下，piii处理表面的蛋白质附着量都高于未处理聚乙烯表面的蛋白质附着量，且不依赖于溶液中的蛋白质浓度。gydF4y2Ba

在洗涤剂洗涤后，蛋白质附着在未经处理的聚乙烯上的量显著减少，并保持不变的所有应用浓度的蛋白质溶液。低浓度(10 mg/L)的蛋白溶液在洗涤剂中洗涤后，piii处理的聚乙烯上的蛋白附着量没有变化(误差棒滞育)。在浓度较高的溶液中(从10 mg/L)，一些附着在piii修饰表面的蛋白质被冲走。然而，在piii处理的表面上共价结合蛋白的数量与蛋白溶液的浓度无关。因此，蛋白质附着在未经处理和piii处理表面的行为是不同的。gydF4y2Ba

HRP的催化活性与其具体构象连接。通过在附着之前展开HRP来分析构象变化（展开）对附着过程的影响。HRP的展开在缓冲溶液中沸腾完成30分钟后，所有活性都被破坏。之后，将蛋白质连接在PIII处理和未处理的聚乙烯表面上。发现附着和共价连接的无活性蛋白的量类似于活性蛋白质。因此，HRP蛋白的构象在未处理或PIII处理的聚乙烯表面上的附着过程中不会发挥作用。gydF4y2Ba

piii处理后的附着蛋白量随时间增加，呈饱和状态(图2)gydF4y2Ba18（d）gydF4y2Ba）.共价附着的蛋白质的量随PIII处理的时间而增加，并且还显示饱和度。自由基的浓度在相同的PIII处理时间范围内增加。未观察到所附蛋白质和测量的自由基浓度之间的完美相关性，因为测量的自由基浓度包括在聚乙烯中的大量的基团。只有表面自由基在附件过程中是有效的。这两种类型的基团的角色的这种差异具有比自由基浓度的饱和蛋白质量在蛋白质量中的效果。在约10后实现共价附着的蛋白质量的饱和度gydF4y2Ba^15.gydF4y2Ba离子/厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba离子束的光线。gydF4y2Ba

与化学键附着的蛋白质，以PIII-处理的聚乙烯的能力仍然很长一段时间后。为了研究治疗PIII的老化效应，聚乙烯样品进行处理，并在实验室条件下存储（在一个封闭的容器黑暗中，在23℃的温度下稳定的，并在70％相对湿度）两年。附着蛋白对新鲜制备的PIII表面量比对老年PIII处理过的表面（表略高gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.在误差条内，在2年的piii处理的聚乙烯表面和新处理的表面上共价结合蛋白的数量是相同的。结合蛋白质附着，PIII处理后样品的ATR FTIR光谱和表面能在储存的两年内没有显著变化，在PIII处理后的第一个月达到了稳定。因此，至少在储存两年之后，表面对蛋白质的共价附着仍保持活性。gydF4y2Ba

3.7。聚乙烯表面功能化和蛋白质附着/含氧基团对蛋白质共价附着的影响gydF4y2Ba

在这一节中，我们分析先前关于蛋白质附着在被离子、电子或电离辐射处理过的表面上的解释。如果蛋白质在piii处理表面上的附着是由化学键提供的，化学键是在处理过的聚合物在蛋白质溶液中孵育期间蛋白质分子和表面活性基团之间形成的，在聚合物膜的合成过程中，可以通过在表面引入活性基团来模拟表面活性。孵化条件并非如上所述的特定条件;因此，反应(或各种反应)必须很容易实现。这意味着改性层的基团必须具有足够的活性，才能在正常浸泡条件下与蛋白质发生化学反应。未经处理的聚乙烯不提供化学键，聚乙烯表面的活性基团是经过修饰后出现的，因此分析PIII后出现的新基团可以用来创建模拟的活性表面层来附着蛋白质。gydF4y2Ba

为了研究蛋白质附着的基团，通过引入选定的化学活性基团来模拟改性聚乙烯表面。大量文献证明，含氧基团如羰基、羧基、醛和羟基可以与蛋白质分子形成化学键[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．如上所述，经过piii修饰的聚乙烯层含有大量含氧基团，这些基团是处理过的样品暴露在空气中后与大气中的氧气发生自由基反应的结果。这些活性基团的存在在文献中被认为是改性聚乙烯表面与环氧树脂和聚氨酯胶粘剂强附着力的原因。引起反应的是粘合剂的环氧基团和异氰酸酯基团与改性聚乙烯的羧基和羟基之间的反应[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]在界面区域中。可以预期类似的反应将负责共价蛋白质附着。gydF4y2Ba

PIII后聚乙烯表面上的羟基、羧基和醛基的存在将导致赖氨酸的胺基与这些含氧基团之间发生反应：gydF4y2Ba

在许多生物技术工具中，这些反应被用来将辣根过氧化物酶与特定化合物结合[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba95gydF4y2Ba，gydF4y2Ba102.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

由于羧基与胺的活性高于羟基或醛基与胺的活性，因此羧基更可能发生反应。羧基可以通过共聚反应引入聚合物表面，而无需对聚乙烯造成任何辐射损伤。为了证明使用羧基胺反应固定蛋白质的概念，我们有意在聚乙烯中引入活性羧基。gydF4y2Ba

乙烯和甲基丙烯酸与17 以甲基丙烯酸单体的wt%浓度作为模型表面。MMA浓度对应于共聚物中每14个亚甲基1个羧基的理论密度。样品在热板之间模制，热板由共聚物颗粒形成的聚四氟乙烯薄膜覆盖。成型后，用乙醇、丙酮和水处理共聚物的表面。通过ATR-FTIR光谱监测成型后共聚物表面上残留聚四氟乙烯大分子的浓度，发现无法检测到。比例gydF4y2Ba(CgydF4y2BaO)gydF4y2Ba1690厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}从羧基和gydF4y2Ba（CHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba）gydF4y2Ba2917厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba} lines of the polyethylene absorbance was found to depend on solvent treatment (ethanol, acetone, and water) after moulding. The hydrophilic solvent causes slightly higher concentration of carboxyl groups in the surface layer observed as a higher intensity of(CgydF4y2Bao）线小于新建或疏水性溶剂处理后（表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.然而，即使用疏水溶剂甲苯处理后，模膜的表面层仍然含有羧基，虽然浓度有所降低。羧基的活性通过与氢氧化钠的反应得到了证实，在1574厘米处出现了羧酸钠线gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．因此，模膜表面的羧基是活性的。引入羧基的聚乙烯表面变得轻微亲水，与水的接触角从接收聚乙烯的90°降低到共聚物的88°。gydF4y2Ba

将活性聚乙烯样品如上所述浸泡在蛋白质溶液中，并用FTIR ATR光谱和蛋白质活性进行测试。羧基表面的HRP分子附着量比未处理的聚乙烯表面低。用洗涤剂洗涤后，HRP分子的数量下降到未处理聚乙烯的水平以下。因此，共聚物中活性羧基的存在不能提供HRP的共价连接。gydF4y2Ba

在PIII处理样品中的含氧基团中的含氧基团的影响最小化可以在实验中实现，其中蛋白质在PIII处理后从未接触过空气的表面上。在实现该实验的情况下，将蛋白质溶液置于被称为“化学真空室”的真空室中，但是当水开始沸腾时，等离子体处理室和该腔室被泵送至约20托的压力。然后将化学室用氮气排放到大气压。泵送和排放的程序重复5次。然后关闭具有蛋白质溶液的容器，将化学真空室泵送至10gydF4y2Ba^{−3gydF4y2Ba}毫托。gydF4y2Ba

经piii处理的聚乙烯样品在10的真空条件下从等离子室转移到化学室gydF4y2Ba^{−3gydF4y2Ba}mTorr是通过机械臂实现的。然后将化学室从等离子室中分离出来，用纯氮气排气至部分真空(20 mTorr)或760 Torr，并将含有蛋白质溶液的容器打开进入化学室。样品浸泡在蛋白质溶液中，并在那里浸泡了一夜。在那之后，室被通风和打开到空气和洗涤程序，以去除松散结合的蛋白质应用。由于在应用蛋白质之前，新鲜处理的PIII处理样品中不含氧，因此，预计其含氧基团浓度将显著低于样品在PIII处理后暴露在空气中的正常过程(见第1节)gydF4y2Ba）预计自由基的浓度将更高。gydF4y2Ba

在部分真空(20 mTorr氮气)和氮气气氛(760 Torr氮气)中附着的蛋白质量与正常暴露在空气中的piii处理样品相同。附着的蛋白质在所有洗涤剂洗涤后仍留在这些表面，表明它是共价结合的。gydF4y2Ba

这些实验证实了上述共聚物实验，并证实了表面羧基的存在并不会导致蛋白质的附着，也不会通过表面羧基与蛋白质的胺基反应而导致蛋白质的共价键。gydF4y2Ba

其它基团如醛，氢氧化物，内酯，羰基和其他人的活动小于用于羧基，这些基团与氨基酸残差的胺基团的反应中具有更小的概率。例如，HRP分子上PMMA的附接与酯基的高浓度，在聚酰胺与酰胺基团的高浓度，在PEEK高浓度酯和羰基的，是低级或一样的未处理的聚乙烯[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba103.gydF4y2Ba］．碳碳不饱和基团对蛋白质附着的影响可以用含有芳香环的聚苯乙烯来研究。如上所示，未经处理的聚苯乙烯上蛋白质的附着率很低[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]. 表中显示了对选定代表性聚合物中存在的活性基团的全面分析gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

因此，活性氧含有和不饱和基团在表面层的存在可以不引起蛋白质的高附着以及蛋白质的共价键合和在PIII改性聚乙烯的表面层这样的基团的外观是不高的原因蛋白和蛋白质分子与表面的共价键合的附着（表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

piii改性聚乙烯表面含有高浓度的自由基。自由基会随着时间的推移而消失，因为它们能从环境中接受任何能够与自己反应的移动原子或分子。自由基具有沿着大分子和大分子链之间从表层迁移到本体的能力。同时，由于芳香结构中π轨道上的电子离域，缩合芳香环的存在使自由基得到稳定。此外，自由基也被硝基和噻唑基的存在所稳定。空间位阻效应增强了自由基的稳定性。当自由基属于一个基团时，这个基团被周围的基团包围，使得任何其他分子都无法接近这个自由基。所有这些机制都在文献中进行了讨论[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba85gydF4y2Ba］．在我们对几种聚合物的实验中，PIII处理后自由基的ESR信号保持较长时间(数月)。gydF4y2Ba

PIII处理后的聚合物表面存在活性自由基。这在以前的离子束改性聚四氟乙烯实验中得到了证实[gydF4y2Ba104.gydF4y2Ba]，当从改性PTFE自由基引起交联在放置在PTFE表面上的树脂的厚层反应。改性聚合物表面的自由基反应已被提议作为用于蛋白质附着的机制[gydF4y2Ba105.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

自由基可以参与与蛋白质分子的化学反应，并在聚合物的改性表层与附着的蛋白质之间形成化学键。然而，合成具有表面活性自由基的初始聚合物大分子似乎是不可能的。gydF4y2Ba

HRP的量的FTIR分析表明，附着于仅暴露于真空的样品的蛋白质的量与空气暴露样品相同（表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba). 然而，在真空中暴露的样品中，蛋白质的活性低于空气暴露的样品。酰胺I线的反褶积表明，在空气和真空中附着在表面的蛋白质的构象不同（图1）gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba). 1638年的强度 厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}线，归因于无序链，是更高的真空附着蛋白质。另外，在真空中添加蛋白质后，不同样品的光谱对光谱的偏差更大。如此强烈的偏差意味着蛋白质构象是随机的。这种随机的构象变化表明构象易受随机因素的影响，如在表面随机分布的高浓度自由基。高浓度的自由基会导致在分子和表面之间形成一个以上的共价键。这种多重键的形成既会引起随机构象的变化，也会通过过度的展开而导致蛋白质活性的丧失。gydF4y2Ba

总之，存在重要的证据，即自由基对蛋白质和PIII改性表面之间观察到的共价键的形成负责。gydF4y2Ba

3.8。阻止共价附着到piii处理表面gydF4y2Ba

如果自由基负责共价附着，则应通过使用在PIII处理之后和蛋白质附着之前使用的特异性阻断剂来选择性地阻断自由基的活性。gydF4y2Ba

研究发现，应用特定的低分子量组分可以阻止蛋白质在piii处理的聚乙烯上的共价吸附。实验中，用苯乙烯、己烯、聚四氢呋喃(PTHF)、乙二胺、苄硫醇和2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基(TEMPO)在不同溶剂(甲苯、丙酮和乙醇)中处理PIII改性聚乙烯表面。处理后，聚乙烯样品用纯溶剂洗涤，以去除非粘结的阻塞分子。利用附着分子的特定基团谱线，通过FTIR ATR光谱监测堵剂在聚乙烯表面的存在。用初始聚乙烯进行的对照实验表明，堵塞分子不会粘附在未改性的表面上，而洗涤程序足以去除所有未结合的堵塞分子。观察到所有的阻断剂都附着在piii处理的表面。阻断后，蛋白如上所述附着在处理过的聚乙烯表面。FTIR ATR谱图显示SDS洗涤剂洗涤前后附着蛋白的量见表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

附着蛋白质的数量取决于蛋白质分子与被阻断表面之间分子间相互作用的细节，而这又取决于阻断剂。烃类化合物(己烯和苯乙烯)在piii修饰表面上的吸附不会很大程度上改变附着的蛋白质的数量。阻断分子中极性基团的存在(如乙二胺、聚四氢呋喃和TEMPO)降低了附着蛋白的数量。这一趋势与疏水表面附着的蛋白质的已知数据一致[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

通过SDS洗涤测试，已吸附的己烯和苯乙烯层上共价附着蛋白的数量与未堵塞的piii处理表面上相同。在被乙二胺和PTHF阻断的表面上，共价附着蛋白的数量减少。在被吸附的TEMPO和苄硫醇封闭的表面上，共价键蛋白的含量最低。gydF4y2Ba

被测试的封闭分子一旦附着在表面上，都不会对蛋白质具有特定的化学活性，因此，蛋白质分子不会化学附着在封闭表面上。含有自由基的阻滞剂在含有自由基的表面上可能表现出不同的行为。己烯和苯乙烯分子含有碳双键，这些碳双键在自由基存在的情况下打开，从而有可能聚合形成聚己烯或聚苯乙烯层gydF4y2Ba

右边的最后一个自由基可以用于下一次与苯乙烯或己烯的反应，也可以保留这个自由基用于蛋白质的吸附。此外，在表面合成一层聚苯乙烯或聚己烯大分子，可以将自由基沿着大分子转移到附着层以上的新表面gydF4y2Ba

下面这个方案中，己烯和苯乙烯不能阻止蛋白质的共价结合，与实验观察一致。gydF4y2Ba

乙二胺和含有PTHF在分子的主链氧或氮。在自由基的存在下，这些分子可通过分子到表面的烃部分被附接，但在这些分子中的氧和氮原子都可能从母体分子在自由基和存在分离自由基不能保持阻挡分子中gydF4y2Ba

因此，这些分子不能转移自由基通过层。因此，这些分子附着后，蛋白质就不可能附着了。这两个分子(乙二胺和PTHF)可以部分阻断表面，阻止蛋白质的附着，这在实验中观察到。gydF4y2Ba

TEMPO和苄基硫醇分子的堵塞能力最高。TEMPO含有一个由与硝基共轭的芳香环稳定的自由基，但其自由基活性高，足以引起化学加工中的自由基反应。因此，TEMPO与piii修饰表面的结合，预计是两个自由基之间的反应，一个来自TEMPO，另一个来自表面gydF4y2Ba

在附着TEMPO后，PIII修饰的表面没有自由基，蛋白质附着被完全阻断。同样的原因也适用于苄基硫醇分子，其中S–H基团对自由基非常活跃gydF4y2Ba

结果表明，改性聚乙烯表面的自由基与苄硫醇和TEMPO发生反应，使改性聚乙烯表面不具有蛋白质附着的活性。gydF4y2Ba

因此，特异性阻滞剂的反应支持了蛋白与piii修饰表面共价结合的自由基机制。gydF4y2Ba

3.9。聚氨基酸附着gydF4y2Ba

本研究旨在确定蛋白质中的哪些化学基团通过自由基参与到PIII修饰表面的共价键合。自由基能与多种分子发生反应。从这个角度来看，蛋白质分子中的所有氨基酸残基都可能与经PIII处理的表面形成共价键。一个化学键足以使蛋白质分子共价结合。为了证实通过许多不同类型的氨基酸残基可以进行共价结合，我们在经PIII处理的聚乙烯上附加了许多不同的聚酰胺酸。通过这种方式，我们模拟了当蛋白质分子中存在选定氨基酸残基时，这些氨基酸残基的附着。gydF4y2Ba

早前就观察到离子束注入游离丙氨酸和亮氨酸后聚乙烯表面的活性[gydF4y2Ba106.gydF4y2Ba］．但由于它们的分子质量低，单个氨基酸有可能扩散到整体中。为了确认反应是在表面上进行的，我们使用了高分子质量的多氨基酸来排除扩散到本体中的可能性。在20种最常见的氨基酸中，侧链上有7个不同的化学活性基团(甲基、芳香环、羟基、胺、巯基、羧基和吡啶)。因此，可以通过连接7种不同的多聚氨基酸来模拟20种氨基酸的活性，每一种多聚氨基酸都有7个不同的侧链基团。gydF4y2Ba

聚氨基酸的附着在未处理和PIII处理的聚乙烯上进行并用FTIR ATR光谱测试。选择聚氨基酸的分子量，尽可能接近HRP的分子量。除了在水溶液中具有有限的溶解性并且从丙酮溶液附着，所有聚氨基酸都从水性缓冲溶液中附着。用于测试共价连接的SDS洗涤程序与除聚-L-色氨酸外的蛋白质附着相同，仅用纯溶剂洗涤。附着实验的结果呈现在表中gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

从表中可以看出gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，并不是所有的多氨基酸都能很好地附着。这意味着所有氨基酸中的端基(碱和酸)和酰胺主基都不能被认为是活性结合基团，而结合必须通过侧基进行。gydF4y2Ba

SDS洗涤前后，聚l-组氨酸和聚l-赖氨酸含量均较高。这与HRP在piii处理的聚乙烯上观察到的行为相似。聚l-甘氨酸是一种疏水性聚氨基酸，洗涤前后聚l-甘氨酸的含量均低于附着聚l-组氨酸和聚l-赖氨酸的含量。这是预期的，因为piii处理的聚乙烯是温和的亲水性。然而，洗涤剂洗涤后，一些聚l-甘氨酸分子仍留在piii处理的表面，表明共价键发生了。gydF4y2Ba

聚l-色氨酸、聚l-蛋氨酸、聚l-苏氨酸、聚l-异亮氨酸和聚dl -丙氨酸从丙酮溶液中分离得到。在这种情况下，由于丙酮分子的存在，表面和这些分子之间的物理相互作用与那些在水溶液中应用的物理相互作用大不相同。然而，piii处理表面上的化学键提供的附着应是相同的，独立于环境。这种化学键将是共价的，因为没有任何物理作用会强大到足以承受在纯丙酮中洗涤。gydF4y2Ba

聚l-谷氨酸在piii处理的表面附着能力较低。如本节所述，经piii处理的聚乙烯表面有酸基团gydF4y2Ba．在缓冲溶液中，将酸基团转化为离子形式并防止表面与溶液的酸性分子紧密接触。因此，很可能是聚-1-谷氨酸分子不能足够接近表面，以允许与自由基进行化学反应。gydF4y2Ba

聚l-酪氨酸从碱性溶液中附着，因为它在pH中性溶液中的溶解度低。由于表面存在羧酸基团和溶液中存在钠离子，聚l-酪氨酸分子与聚l-谷氨酸存在同样的问题，即与表面达到足够近的相互作用，以实现任何化学作用。这可能是聚l-酪氨酸在piii处理表面附着能力较低的原因。然而，需要注意的是，聚l-酪氨酸在未经处理的聚乙烯表面显示出很高的附着能力，而表面附近的离子相互作用并不起主要作用。聚l -苏氨酸在丙酮溶液中有较强的吸附。gydF4y2Ba

在聚-1-甲硫氨酸附着下观察到与PIII处理的聚乙烯表面的巯基群反应。预计甲硫氨酸和胱汀素-SH组将参与与PIII改性表面的自由基的化学反应。gydF4y2Ba

总之，所有的多氨基酸都有可能附着在piii处理过的表面上。在特定情况下观察到的低附着，我们用靠近表面的缓冲层中的特定离子相互作用来解释。这种具有piii修饰表面的氨基酸残基的普遍行为是由活性自由基的存在提供的。然而，在蛋白质分子中，单个氨基酸残基参与与经过piii处理的表面化学键的能力还取决于蛋白质的构象和蛋白质分子相对于表面的方向。gydF4y2Ba

如果能证明这些方法在聚合物表面或附近提供足够浓度的活性自由基，那么蛋白质与自由基结合的普遍特性可以推广到聚合物辐射损伤的各种方法。在这种情况下，本文所描述的蛋白质附着机制可以应用于辉光放电等离子体、紫外光照射、电子束修饰、x射线修饰、gydF4y2Baγ.gydF4y2Ba- 含碳聚合物的 - 含碳聚合物（抛光和刮擦），碳沉积方法（如石墨簇，碳纳米管和石墨烯）具有稳定的自由基的碳沉积方法。图中提出了聚乙烯和蛋白质附着的PIII处理的阶段gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

4.结论gydF4y2Ba

等离子体浸渍离子注入是一种离子束植入的类型，并产生聚乙烯的薄表面层中的结构变化。这些变化包括以下内容：gydF4y2Ba(我)gydF4y2Ba一种含双键、共轭双键、芳香环、缩合芳香环的不饱和基团的碳化过程，其数量不断增加，最终形成石墨岛;gydF4y2Ba（ii）gydF4y2Ba活性自由基和显示长期稳定性的自由基的出现；gydF4y2Ba(3)gydF4y2Ba处理后的样品暴露在空气中后羧基、羰基、醛、羟基等含氧基团的外观;gydF4y2Ba(四)gydF4y2Ba含氮基团在植入和暴露于空气后的外观;gydF4y2Ba(v)gydF4y2Ba表面能随自由基的出现而增加，随着自由基的衰变和含氧基团的出现而降低;gydF4y2Ba（六）gydF4y2Ba波状表面的波状形态gydF4y2Ba

附着在经piii处理的表面上的蛋白质数量比未经处理的表面高出2倍。piii处理表面上的附着是通过蛋白质分子与修饰表面形成共价键，而未处理表面上的附着是通过物理分子间的相互作用。gydF4y2Ba

蛋白质分子和修饰表面之间的共价键是通过与活性自由基反应形成的，活性自由基由于未配对自由电子的离域而被保留在共轭结构中。用选定的分子阻断修饰表面可以消除自由基或阻止它们的迁移，从而阻止蛋白质的共价附着。gydF4y2Ba

蛋白质分子具有多种可用于键合的活性氨基酸残基与表面上的自由基键合。这意味着PIII处理的表面可以为各种蛋白质提供共价连接，条件是蛋白质分子能够足够接近以建立化学键。如果可以证明这些方法可以证明这些方法在表面上或附近提供足够浓度的活性自由基，则可以延伸到自由基对自由基的局部辐射损伤方法。gydF4y2Ba

由于界面上的亲水性相互作用，附着蛋白质的天然构象保留在经PIII处理的表面上。然而，表面上高浓度的自由基会与蛋白质分子形成多个共价键，破坏天然构象，从而失去催化活性。因此，蛋白质构象（和活性）的保持需要优化表面上的自由基浓度。gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

作者要感谢海伦·史密斯和罗伯特·汤普森的贡献，他们参与了多胺酸和蛋白质的实验。gydF4y2Ba

参考gydF4y2Ba

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