文摘
一个重要因素影响的杨氏模量计算精度的原子力显微镜(AFM)压痕实验是测定硬度计压头的尺寸。这个过程通常是使用AFM执行校准光栅或扫描电子显微镜(SEM)成像。然而,上述过程经常被省略了,因为它需要额外的设备。本文提出了一种新的方法,专注于球形硬度计压头的校准,无需特殊设备,而是使用武力缩进柔软的样本数据。首先,这个问题是否在数学上可以同时计算硬度计压头的半径和测试样品的杨氏模量的限制(在示例提供了一个线性弹性响应)使用相同的力压痕数据进行了探讨。使用一个简单的数学方法,证明了上述过程在理论上是有效的。此外,为了验证这个方法在现实压痕实验琼脂糖凝胶。多个测量在不同琼脂糖凝胶表明球形压头的校准是可能的,并且可以准确地执行。因此,硬度计压头半径和软样品的杨氏模量可以确定使用相同的力压痕数据。同样重要的是要注意准确性提供类似于使用AFM校准光栅时获得的准确性。 The major advantage of this paper is that it provides a method for the simultaneous determination of the indenter’s radius and the sample’s Young’s modulus without requiring any additional equipment.
1。介绍
球形硬度计压头经常用于原子力显微镜(AFM)压痕实验软生物样品(1- - - - - -6]。他们是可取的,因为他们通常不会造成永久性伤害上述样品在缩进(至少在情况下,压痕深度并不显著大相比,硬度计压头的半径)。数据处理在使用球形硬度计压头通常是由经典的赫兹方程拟合力压痕数据(7- - - - - -9]:
在方程(1),和是材料的杨氏模量和泊松比,分别和是球体的半径。因此,样品的杨氏模量的兴趣可以准确地确定条件下样品的泊松比和硬度计压头半径是已知的。因此,它是重要的确定硬度计压头的半径,以准确计算样品的杨氏模量。
在大多数的情况下,硬度计压头半径的测量使用AFM校准光栅(10)或者使用扫描电子显微镜(SEM)成像(11]。随后,当已经确定,测试样品的杨氏模量可以计算作为拟合参数使用方程(1)。这是常见的方法在文献[5,7]。或者,可以获得一个力压痕曲线在一个样品和一位知名的杨氏模量,然后计算使用方程(1)。然而,一个有趣的问题出现了:它是数学可能确定球面的半径硬度计压头使用武力压痕数据不知道样品的杨氏模量?如果是的,有可能这个方法在现实压痕实验申请球形压头的校准?很明显,如果方程(1),然后同时决定是不可能的和只使用方程(1)。然而,应该指出的是,方程(1)是有效的只有小压痕深度与齿顶圆角半径( )(12]。文学是一个典型的极限 (13]。换句话说,方程(1)只是一个近似球形压痕,因为它准确地描述了缩进使用抛物面的革命。相反,关于球形压痕,却把压痕深度的方程是有效的为每个值(14]:
在方程(2),半径在接触深度( )(即。,depth at which contact is made between the sample and the sphere). In addition,
然而,方程(2)并不直接与样本上的作用力以来的压痕深度接触半径取决于压痕深度。因此,最近,一个新的方程推导15]:
在方程(4), 或
数量和常量的值 依赖于 比率。例如,如果 ,然后 ,在哪里 , ,和 (15]。
之前已经报道过,半空间上的作用力时,使用一个轴对称硬度计压头接触半径成正比硬度计压头和样品之间的特定的压痕深度(16]。换句话说, 。对于球形压头半径和小压痕深度, ;因此, 。对于平面圆柱压头半径为结束 , ;因此, 。作为一个结果,而使用球形压头压痕深度增加时,接触半径趋于一个极限值就等于硬度计压头的半径(15,16]。因此,应用力 应该在第一次成正比吗(非常小的压痕深度)和将成为线性(即。,成正比 )对于非常大的压痕深度(15,16]。因此,参数是一个“校正因子”以赫兹方程申请大压痕深度(即, )(15,16]。换句话说,是一个数学量占的斜率的变化吗 曲线随着压痕深度的增加。方程(4)和(6)的基本问题提供一个新的视角。在一个严格的数学的思维方式,它已经证明,理论上是可以同时确定硬度计压头半径和样品的杨氏模量非常大的压痕深度( )(15]。在这种情况下( ),力压痕数据线性的 ,和球体的半径可以计算 ,在哪里的共同点是线性符合吗 - - - - - -轴和线性曲线的斜率是(15]。随后,杨氏模量可以很容易地确定从线性曲线的斜率15]。然而,在真实的实验过程为大压痕深度有关软实验样本,可以永久损伤样本;因此,很难使用这种方法。此外,当使用AFM探针的几何图1,它是不可能实现的一个压痕深度 。因此,下一个问题是如果理论上是可以确定使用小压痕深度相比,硬度计压头的半径 如果这个方法是准确的硬度计压头的校准使用真实的实验数据。本文证明了准确测定硬度计压头半径的即使 是可能的,它可以执行与精度测试样品时,可以近似认为是均匀和各向同性。新方法提供了类似的准确性和其他知名的技术(例如,硬度计压头半径的测量使用AFM校准光栅)。
2。材料和方法
2.1。一种新的方法来计算硬度计压头的半径
或
在方程(8), 是样品的模量降低。随后, 数据拟合的函数形式:
发现方程(提供的数据8)可以精确地拟合方程(9)(即。, - - - - - -平方系数等于1的结果, )只有在域 。此外,所做的功硬度计压头( )可以很容易地计算如下所示,用方程(8):
因此,
同样的程序所做的功的计算硬度计压头可以执行使用方程(9域),它是有效的 :
所做的功硬度计压头可以找到使用方程(11)和方程(13)(结果将是相同的)。因此,通过结合方程(11)和(13),它可以总结如下:
方程(16)也可以书面形式:
尽管上述方程不能倒,制表 ,与 和策划这样的列表,反向的图形功能 可以构造。换句话说,因素是计算使用方程(18)在域 ,并与两列一个表。第一列包含的值,第二列的 值。随后, 图(图2)。
因此,价值的因素可以用来揭示了吗 比率,因此,以来硬度计压头半径的值的最大压痕深度是一个已知的参数。因此,硬度计压头半径的确定取决于的确定因素(这可以很容易地使用方程(执行16))。在方程(16硬度计压头),做的功可以很容易地使用下的面积计算 图。换句话说,一个数学的观点下,硬度计压头半径可以准确地确定使用典型的力压痕数据通过求解一个简单系统的两个方程(方程(16)和(18与两个未知参数待定)(和 )。应用力、最大压痕深度,所做的功硬度计压头可以很容易地使用实验数据测量。随后,可以使用简单的方程计算(16)。然后,从方程(18),很容易只计算未知参数的比例 (参数 ,和很好地定义为解释(15])和结果来确定 。因此,如果force-indentation曲线得到纯粹的线性弹性样本,计算是一个简单的数学问题,可以执行使用方程(16)和(18),只需要一个force-indentation曲线。然而,如果感兴趣的样品可以近似认为是均匀和各向同性在一个特定范围的压痕深度,该方法也可以应用通过使用许多force-indentation曲线和通过硬度计压头半径的平均值,因为它将在以下部分中讨论。
2.2。开放AFM的数据
几个模拟曲线用于第一个测试的新方法。AtomicJ存储库(17)是用于获取力压痕数据和计算球形压头的半径。
2.3。实验
2.3.1。校准灵敏度校准和Spring的常数
探头的校准参数需要准确的定量测量。样品上的作用力可以提供通过胡克定律与悬臂梁的挠度, (是悬臂的弹簧常数,偏转灵敏度(悬臂偏转的伏特转换纳米),然后呢是测量悬臂梁的挠度(伏特))18]。挠度由系统的直接测量位敏分裂光电二极管探测器(18]。进行灵敏度校准每伏特(nm悬臂偏转信号的激光探测系统),重要的是要获得一个力与距离曲线在一个干净、坚硬的表面(如云母或玻璃)18]。随后,偏转灵敏度是由力与距离曲线,只需两个游标定位在其接触部分(18]。弹簧常数的标定进行了使用热噪声的方法(18]。当然,除了前面提到的技术,其他小说和准确的方法,如“标准化的纳米机械原子力显微镜程序(临时)”可以应用(19]。
2.3.2。接触点的决心
在测试软生物样品,一个重要的过程的准确识别是提示和示例之间的接触点。为了提供准确的结果,AtomicJ软件被用于接触点的识别;假设每一个点的曲线作为一个接触点,一个多项式precontact部分安装,安装适当的接触模型力压痕数据(17]。测试点,导致最低的总平方和是公认的接触点。
2.3.3。测量
使用胶体AFM探针测量进行(CP-PNPL-BSG-A、sQube NanoAndMore GMBH)获得的球体的名义半径等于1μm。硬度计压头是首先校准使用AFM测试光栅TGT1 (NT-MDT仪器)。AFM使用WSxM软件进行图像处理。使用琼脂糖凝胶的实验集中在一个35毫米培养皿。选择琼脂糖凝胶,因为他们可以近似认为是均匀和各向同性。琼脂糖凝胶的泊松比可以假定等于 由于高水位的内容。杨氏模量得到了地图在琼脂糖凝胶使用AtomicJ软件(17]。
3所示。结果与讨论
3.1。应用模拟曲线的新方法
为了验证新方法的有效性,模拟曲线(从AtomicJ获得存储库(17如前所述在材料和方法)首先使用。根据AtomicJ库,生成的模拟曲线在Mathematica 8.0好像是真实的力曲线,使用球形压头。他们使用却把生成的力和压痕深度之间的关系(方程(2)),添加随机高斯分布的噪声。测试样本是一个弹性半空间内 kPa, 硬度计压头的半径 μm。悬臂的弹簧常数 。一个典型的模拟曲线呈现在图3(一个)。的最大压痕深度是400海里,最大的作用力是8.61神经网络。曲线下的面积等于 J;因此,方程(16)的结果 。使用 数据(图3 (b)),它可以很容易地得出结论:
(一)
(b)
在这一点上,必须指出的是,高斯噪声的原因,硬度计压头半径结果略小于1μ(这个结果可以很容易地证明因为当使用一个硬度计压头半径 μ米的设置AtomicJ软件;结果是 kPa略大于20 kPa)。
3.2。新方法的应用在真实的实验
测试方法的有效性在现实实验应用中,数以百计的测量在不同琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶被选中,因为它大约是均匀和各向同性材料。典型的AFM球形压头的尺寸用于进行实验呈现在图4(一)。在图4 (b)硬度计压头半径的测量, μm。在这一点上,重要的是要注意,本文提出的方法可以应用在这种情况下,方程(4)可以准确地用于描述力压痕数据。然而,在某些情况下,力压痕数据可能不完全遵循方程(4)。一个典型的例子是图所示4 (c)。在本例中,它发现的可靠性方法是更好的,如果实际数据首先拟合的函数形式:
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
同样重要的一点是要注意 和 它应该是 。随后,最大作用力可以计算使用方程(20.),也就是说,
下一步是计算硬度计压头(即所做的功。下的面积数据)和最后的因素使用方程(16)。例如,对于图的情况4 (c),
使用方程(23), , J, 。因此, μm。在图4 (d)的因素对每种情况的最大压痕深度(代表72测量的数据进行使用硬度计压头如图4(一))。实验进行的最大压痕深度范围 ,和的值的范围导致 。因此,自值决定下一步是使用 数据域 (图4 (e))。
图中给出的数据4 (e)是安装在一个线性方程如下:
完美的自适应 - - - - - -平方系数等于 。最后,使用方程(24),图中所示的数据4 (d),很容易计算出硬度计压头半径:
直方图显示的范围计算给出了在图4 (f)。数据范围小;这个事实显示了该方法的可靠性。另外,很明显,结果是几乎相同的结果获得使用AFM校准光栅(即, )。此外,使用平均值作为计算由本文提出的方法(1.0257μ米),由16个测量杨氏模量图(图展示了在相同的琼脂糖凝胶5)。因此,它是重要的确定,可以确定两个球形压头半径和相同样品的杨氏模量的测量数据集。
在图6,另一组16所测量得到的不同的琼脂糖凝胶(使用相同的协议创建一个用于创建图4)使用相同的球形压头。在这种情况下,最大压痕深度范围 。因此,使用 数据域 (图6(一)),它可以得出结论:
(一)
(b)
(c)
柱状图显示了从16个测量值计算也显示在图6 (b)。的 几乎相同的情况下72测量。这也是一个重要的结果,因为它证明了少量的测量的硬度计压头半径的确定可以准确地执行。
最后,在图6 (c),88年计算的值介绍了直方图的数字4 (f)和6 (b)和使用校准光栅的测量值(数据4(一)和4 (b)提出了)。
3.3。该方法的可靠性
从数学的角度来看,该方法严谨、准确,它可以应用在任何情况下,均匀和各向同性软样品正在测试使用一个完美的球形压头。然而,许多问题可能出现;第一个是如果它是精确的适合力压痕数据一个方程的形式 ( 根据方程(9)),推导出因子使用这种方法。在理论上,这个选项似乎合理;然而,一个重要的问题,这种方法是图所示7。特别是,相同的力压痕数据第一次拟合方程:
在这种情况下,使用方程(24), μm。
随后,同样的数据拟合方程:
在这种情况下, μm。
因此,得出的结论是,有无限的组合的因素和在方程 可以用来完全符合数据。换句话说,方程(27)和(28在域)是相同的 nm。相反,方程(3.2)的主要优点是它不依赖于参数 ;因此,它的结果在任何情况下一个解决方案。出于同样的原因,是不可能使用方程(21)和(22硬度计压头的校准。例如,理性思维应该是符合数据方程(20.)(见部分中给出的例子3.2)。使用这种方法, 和 。因此,似乎和可以很容易地通过求解上述方程组计算。然而,这是不可能的因为有无限的组合 ,和值可能导致相同的曲线在一个特定的域。
讨论的另一个重要的点是最大压痕深度的选择。例如,对于低 值(例如, ),的因素结果非常接近吗 ;因此,该方法可能不是准确应用。
另一方面,对于非常大的压痕深度(例如, ),力压痕数据不能准确地由一个函数的形式表示 ;因为增加的时候之前已经报道过了 比,该地区在接触深度增加而不是按比例(15]。如果 然后,在接触区域深度约等于 ,和 数据成为线性的。换句话说,的斜率 曲线下降的 比例增加(15]。只有在域 整个数据范围可以表示为的函数(9)与准确性。然而,这不是一个重要的问题在大多数情况下,因为没有理由进行压痕实验用如此大的最大压痕深度。
一个广泛的文献搜索后,发现在实际的应用中,即使压痕深度被认为是相对大,通常的情况是 。提出的一个典型的例子是郭et al .,谁执行nanoindentation癌和非癌变人类乳腺上皮细胞实验(20.]。他们使用了球形压头半径为2.65μm,实验的最大压痕深度是1.5μ米( )。另一个例子是清水等人发表了nanoindentation实验测量杨氏模量的间充质干细胞和HEK293细胞漂浮状态(21]。在这种情况下, μm和最大压痕深度导致1 - 2.5范围μ计算m。此外,Sajeesh等人成纤维细胞的杨氏模量22]。使用的球形探头半径等于 μm,实验的最大压痕深度 μm。上述例子表明,没有任何技术需要进行压痕实验使用非常大的 比率;即使非齐次样品进行测试 在大多数的情况下(其他例子也可以发现在23- - - - - -25])。此外,可能会出现的一个问题就是为什么需要硬度计压头的校准的新方法由于成本获得小费校准光栅不是很高。假设两个不同地区在同一琼脂糖凝胶(例如,区域1和区域2)应该被测试。每个实验可能会改变初始硬度计压头的形状(这也可能发生在普氏硬度仪的校准使用光栅)。因此,当测试区域2,硬度计压头半径可能会不同的地区相比,实验1。因此,齿顶圆角半径应重新测试之前实验2这当然是非常耗时。此外,第二使用校准测量光栅可能会改变(或污染)硬度计压头。然而,使用本文提出的方法,可以计算只使用的力曲线获得地区2没有重新测量齿顶圆角半径使用传统的技术。这是非常重要的,因为当测试生物样品在纳米尺度上,通常2或3不同地区在同一样品正在测试,同样的硬度计压头。是非常耗时的重新测量齿顶圆角半径。
最后一个测试,测试执行该方法的可靠性提供如下。首先,随机选择30力压痕曲线得到琼脂糖凝胶,然后随机选择30曲线得到在不同琼脂糖凝胶准备相同的协议和使用相同的硬度计压头。的 - - - - - -值计算呈现在图8。零假设的两个数据样本来自人口平等意味着使用ttest2在MATLAB进行了测试。的返回值 表明ttest2不拒绝零假设默认为5%显著性水平。
(一)
(b)
必须还指出,该方法可以应用于任何样本无论其刚度条件下,提出了大约一个线性弹性响应。尽管生物样本是高度不均匀,在许多情况下,他们提出一个线性弹性响应为一个特定的数据范围(如细胞)6,23,26,27]。因此,为了应用该方法同时计算样品的杨氏模量和硬度计压头的半径的范围缩进值样本大约可以被视为均匀应首先确定。随后,很容易应用该方法在上述数据范围。
3.4。错误的影响在杨氏模量测定球形压头校准
自从AFM压痕法通常用于测定杨氏模量的分布的软示例中,一个重要的点也讨论可能的错误的影响计算。例如,方法对72年的测量显示在图4 (f)显示比例不同而使用AFM校准的测量光栅。尽管使用AFM测量光栅也不是100%准确,认为硬度计压头的半径是1.01的真正价值μm和1.0257本文提供的计算结果μm。杨氏模量计算的误差在这种情况下可以使用方程(计算8)以下形式:
特别是,假设杨氏模量使用吗 μm和杨氏模量的计算使用吗 μ米,比 提出了如下:
在图9,错误比例计算使用方程(30.)。域使用 。误差计算域:
小压痕深度 , 根据方程(1)。因此,对于大 比率,比例误差有点大。误差范围在0.7% -0.8%相比是微不足道的,因为它是小杨氏模量计算中提供的错误如果赫兹方程(1)用于一个压痕实验使用的球形压头 (这是普遍接受的限制使用方程(1)[11])。在这种情况下(例如, ),的因素在方程(6)的结果13]:
因此,百分误差在这种情况下是:
3.5。总结了该方法的步骤
在本文中,一种球形硬度计压头的校准的新方法,直接从force-indentation曲线,提出和讨论。该方法的主要优点是,它可以用来同时计算球形压头半径和样品的杨氏模量(如果样品可以被认为是均匀和各向同性)使用一个典型的组force-indentation曲线。此外,它可以使用即使数据不完全遵循方程(4)。在这种情况下,数据可以被安装在方程(20.),该方法同样可以应用使用拟合曲线而不降低精度。应遵循的步骤测定硬度计压头半径的准确的总结如下:(我)一种近似均匀和各向同性材料(未知的杨氏模量)如琼脂糖凝胶应该作为参考样本。自的范围相对较小,呈现图吗4 (f),不需要处理成百上千的力压痕曲线。可能,15 - 20曲线足以结束在一个精确的计算。然而,的范围应该测试结论如果结果是准确的;标准偏差应该小。标准差等于10%的平均值应该是可以接受的(例如, )。在这种情况下,错误有关计算应该是大约10%。假设比如硬度计压头半径的误差10%相比,真正的价值(即, μm,假设真正的价值是1μ米)。在这种情况下,杨氏模量计算的误差百分比根据方程(30.()将约4.65% )与其他系统误差对AFM实验(28](2)数据应该被安装在下列方程(以防数据不准确地按照方程(4)): (3)使用拟合曲线下的面积(所做的功等于硬度计压头),最大力量(例如, )和实验的最大压痕深度的因素可以计算:
在情况下, 或接近 ,测量应该重复因为很大的压痕深度的方法是无效的,和小压痕深度,精度低(iv)使用数据呈现在图2(导致使用方程(18)),为每个值的因素 ,的 可以很容易地计算比例。因此,自是一个已知的参数在每种情况下,可以计算出(v)的 的计算,直方图的值也应该构建评估的范围值。的意思是等于硬度计压头的半径。应该也用直方图得出结论是否值的范围很小。广泛的范围值,应该重复校准
该方法的步骤也总结了图10。提出了工作的意义有很多不同的方面。首先,有趣的数学问题是否理论上是可以计算的和使用相同的力压痕数据(关于球形压痕)回答。此外,结果表明,该方法可以很容易地应用在实际AFM实验。这个事实是非常重要的,因为它减少了所需的设备执行AFM压痕实验(校准光栅或扫描电镜成像是不再需要)。此外,可以同时计算出硬度计压头半径和均匀和各向同性软材料的杨氏模量也很重要,因为它大大减少了时间,实验的实验工作,预算。AFM缩进是一个功能强大的方法,生物样品在纳米尺度上的机械特性。方法的应用程序有很多特别是在医学诊断(例如,癌症诊断)29日- - - - - -31日]。因此,简化实验程序的能力可能会增加应用方法在实际临床应用的可能性。
4所示。结论
方法用于AFM的校准球形硬度计压头压痕实验提出了关于软生物样本和讨论。首先,它表明,在数学上可以同时计算硬度计压头的半径和样品的杨氏模量,就象一个弹性半空间。此外,它也表明,提出的方法可以用在真正的压痕实验。测量的结果在琼脂糖凝胶显示方法的准确性与精度标定提供了使用AFM光栅。
数据可用性
所有的数据都包含在手稿。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这部分工作是塞浦路斯研究和创新基金(文化/ AWARD-YR / 0119/0012)。