通过多光子显微镜对早期乳腺导管癌的无标签鉴定

抽象

乳腺癌可以通过早期诊断可以治愈。从准确的病理诊断适当和有效的临床治疗益处。然而，由于缺乏有效的筛选和诊断成像方法，乳腺癌的早期阶段常常发展成恶性乳腺癌。在这项研究中，多光子（MPM），使用显微镜通过双光子激发荧光与二次谐波产生相结合，用于识别乳房导管癌的早期阶段。结果表明中正常乳腺组织中都细胞学特征和胶原分布的差异，非典型导管增生，原位低档导管癌，及高档导管原位癌伴微。此外，来自MPM图像中提取的三个特征中，用于描述在乳腺导管癌的早期阶段在细胞学特征胶原密度差，和基底膜圆周。他们透露，MPM具有识别的早期阶段的能力乳腺导管癌无标签，这将有助于乳腺癌的早期诊断和治疗。这项研究可能提供MPM在临床的进一步应用奠定了基础。

1.简介

乳腺癌是女性最常见的癌症，也是导致女性死亡的第二大癌症，2018年美国估计新增病例266120例，死亡40920例[1个]. 然而，70%-75%的乳腺癌与乳腺导管病变有关[2个]。非典型导管增生（ADH）是浸润性导管癌的间接前体，和原位（DCIS）导管癌是浸润性导管癌的直接前体[三–6个]。在与微浸润（DCIS-MI）导管原位癌是乳腺导管癌的前段[7个,八]。如果这些早期病变能及时发现、准确诊断并早期治疗，患者将有良好的预后。DCIS是一组高度异质性的导管内肿瘤病变，主要根据核级或坏死分为低级别DCIS、中级别DCIS和高级别DCIS [9个]. ADH的不典型增生与低级别DCIS的增殖细胞相似，但ADH范围小，完全累及的管腔少于2个，或病变小于2 mm[10,11]。DCIS-MI以导管原位癌为特征，部分癌细胞突破导管系统基底膜进入相邻间质组织，病灶直径不大于1mm [八]。DCIS- mi常发生于病变范围广泛的高级别DCIS，但也可出现于任何级别的DCIS [7个,八]。然而，由于缺乏准确、快速的筛查和诊断影像学方法，这些病变往往进展为恶性导管癌，甚至远处转移。

目前，通过病理学家苏木鉴定乳腺导管癌的早期阶段和eosin-（H＆E-）针活检标本或术后标本染色切片。虽然ADH和DCIS容易通过H＆E切片识别，DCIS-MI的识别是困难的。病理学家通过使用免疫染色标记来标记肿瘤周围肌上皮细胞和肌上皮看到细胞层的存在鉴定急性微创灶等疑似病变。然而，reslicing检测浸润的免疫标记时，微小病变可能不再出现在部分。此外，H＆E切片的病理组织学检查有其他几个缺点，包括耗时耗力的病理过程和潜在风险的偏见。因此，存在对开发可用于筛选和诊断这些早期病变快速和有效的光学成像方法的迫切需要。

多光子显微镜通过与二次谐波产生（SHG）合并的双光子激发荧光（TPEF）（MPM）是用于癌症研究和诊断[有希望的，无标记的，和高分辨率成像技术12–15]。乳腺组织中存在大量的自体荧光物质，如弹性纤维、NAD(P)H、FAD等，可产生TPEF信号[16,17]不对称胶原，如I型胶原、II型胶原、III型胶原和V型胶原更容易产生SHG信号[18]. 特别是，SHG成像通过检测组织的内源性荧光来显示细胞外基质中胶原纤维和弹性蛋白纤维的微观结构[19]。在另一方面，成像TPEF可以直接观察细胞形态及组织[变化12]。高对比度的SHG和TPEF叠加图像突出胶原重组在肿瘤间质界面，其与癌症的发展有关。因此，在这项研究中，我们试图探讨MPM成像是否可以识别乳腺导管癌的早期阶段。

2.材料和方法

2.1。样本的准备工作

在这项工作中16例石蜡包埋的乳腺癌样品，其中包括5个例正常乳腺组织，3 ADH，5低档DCIS和3高档DCIS-MI，从福建协和医院病理科获得。参与研究的患者被诊断为21-75岁。福建协和医院的机构审查委员会（福州，中国）批准了这项研究，且患者签署参与这项研究之前，知情同意书。连续5五段 μ本研究采用m厚，石蜡切片脱蜡后，中间切片用H&E染色进一步确定实验结果，其余四个切片用于多光子成像。

2.2条。MPM系统

在这项工作中使用的MPM系统在之前已经详细描述过了[20]。简单地说，一个商业激光扫描显微镜(Zeiss LSM 880 META, Jena, Germany)配备一个外部自动锁定的Ti:蓝宝石激光器(140 fs, 80 MHz)用于所有MPM成像。未染色的样品被来自可调谐Ti:蓝宝石激光器(美国加州圣克拉拉的Chameleon Ultra, Coherent, Inc.)的810 nm光激发。20x平面消色差物镜( ,利用Zeiss, Jena, Germany)获得背散射荧光，通过光栅将其分离到32通道的GaAsP和PMT阵列探测器上，分别得到TPEF信号和SHG信号。(1) TPEF通道采用32通道GaAsP检测器(彩色编码红色)采集430 nm-695 nm荧光;(2) SHG通道使用PMT检测器(绿色标记)收集389 nm-419 nm荧光。LSM软件自动拼接出分辨率为的图像阵列 像素每帧形成一个大面积的图像。所有MPM图像都有12位的像素深度;图像是在0.77μs/像素。双向扫描模式下的最大扫描速度为1.6帧/秒( 像素)。

2.3条。组织学分析

h&e染色数字图像(40x)由CCD (DS-Fi2，尼康)光学显微镜(Eclipse Ci-L, Nikon Instruments, Japan)获得，经两位经验丰富的病理医师(Deyong Kang和Yuane Lian)确认，减少了主观观察误差。然后，两位研究人员(郑立勤和陈钟)通过将多光子图像与h&e染色的数字图像进行比较，证实了多光子图像的结果。

2.4。统计分析

为了进一步描述正常乳腺组织、ADH、低级别DCIS和高级别DCIS-MI的细胞学特征和胶原特征之间的差异，从MPM图像中量化了三个特征。导管内上皮细胞的核区用于描述导管内细胞学特征的差异，胶原密度用于描述导管周围胶原含量的差异，基底膜周长用于描述导管内病变的程度。所有的统计分析都是用IBM SPSS统计21.使用单因素ANOVA确定各组之间的统计学显着性，并且被认为在统计上显著值< 0.05。

3.结果

3.1。多光子显微成像

为了证明MPM是否具有以显示正常乳腺组织，ADH，DCIS和DCIS-MI之间在微观结构差异的能力，获得并用相应的H＆E图像相比较不同样品的MPM图像。在无标记的乳腺组织中，“屏幕门效应”出现在大场多光子图像（例如，图的多光子成像扫描1个（a） 我是说，1个（b）中，1个（C），1个（一世），1个(j)1个（k））的使“网格”出现在这些图像。然而，当我们将一个大场的视点图像分成四个等份或用于多光子成像八个相等部分时，“屏幕门效应”被显著减弱或不出现产生的多图像上。数字1个显示正常乳腺组织、ADH、DCIS、DCIS- mi的代表性MPM图像及相应的H&E图像。数字2个显示正常乳腺组织、ADH、低分级DCIS、高分级DCIS- mi的代表性MPM图像及相应的H&E图像。如图所示1个（c）中，正常乳腺组织由两个部分组成：一个是导管小叶系统，另一个是纤维组织和脂肪组织组成的基质系统。据此前的报道和当前的实验结果，细胞和弹性纤维能够产生TPEF信号（红色彩色编码）在图的1个(a)，而图中细胞外基质中的胶原产生SHG(红色编码)1个(b) (1个]. 具体来说，数字2个的（a）表明，正常导管被双层：内细胞层由上皮细胞，而外层含有肌上皮细胞。基质组织内的胶原纤维被弯曲且致密，腺泡和导管的基底膜可以在图中可以看出1个（b）中。在MPM图像这些细胞的细胞学特征和位置对准信息分别与图对应的H＆E图像相一致1个（d） 以及2个(e)，而H&E图像不能直接观察胶原蛋白的分布和基底膜的存在。

象正常的管道，ADH是上皮细胞的导管内的小规模的增殖，这些上皮细胞通过小的均匀的细胞核图，其特征在于，如图所示，TPEF图像（1个（E））。如在图中可以看出1个（f） ADH基底膜激发强烈的SHG信号，基底膜清晰可见。此外，MPM图像（图1个（E） -1个（g） ）显示基底膜完整，但明显增大。高对比度叠加图像（图1个（g） 以及2个（B））清楚地表明胶原纤维的分布和微观结构和增殖的上皮细胞。这些形态细节用H＆E的图像的结果（图很好地相关1个（h）和2个（f） ）中。然而，H&E图像未能直接显示胶原纤维的微观结构和分布。

数据1个（一世）-1个（l） 显示MPM图像和相应的低级DCIS的H&E图像的示例。数字2个表明低分化乳腺导管中增生的上皮细胞与ADH导管中增生的上皮细胞相似。增生性上皮细胞的特征是细胞核小而均匀。与ADH不同，低级别DCIS涉及更多的导管或更大的导管(图)1个（g） 以及1个(k))。如图所示1个（k）时，上皮细胞的增殖管道涉及一个大的管道和相邻管道。强SHG信号表明，在基底膜和间质组织中的胶原纤维束清晰可见，和胶原纤维直由于管道的扩张成为。的MPM图像（图2个(c))低级别乳腺导管原位癌显示增生上皮细胞的细节，与H&E图像显示的细节完全相同(图)2个（G））。然而，SHG图像（图1个（j） ）显示胶原在间质组织中的分布，而H&E图像不能直接观察到胶原的分布。

DCIS与ADH和DCIS相比，DCIS- mi是以DCIS为基础的，癌细胞突破导管基底膜进入基质组织，但最大浸润病灶最大直径≤1mm。数据1个(m) -1个（p） 显示高级DCIS-MI的MPM图像和相应的高级DCIS-MI的H&E染色图像。与低级别DCIS的增殖细胞不同，高级别DCIS的增殖细胞具有更大的细胞体积、更大的细胞核、明显的核异常和核仁（图1个（m） ）中。SHG图像（图1个(n))显示出导管周围的胶原分布不均匀，有些导管周围的胶原很薄，有些导管周围的胶原很致密。其中一根导管基底膜被破坏，基质组织中的胶原不再分布在导管周围，而是无序排列，胶原密度也降低，如图所示1个（n） 是的。MPM图像显示的细胞学特征与H&E图像显示的细胞学特征相同（图1个（p） 以及2个（h） ，但h&E图像不能直接显示基底膜和基质组织中胶原的形态变化。

比较正常乳腺组织和乳腺导管癌早期的MPM图像，包括ADH、低级别DCIS和高级别DCIS-MI，MPM识别特征总结如下表1个. MPM能结合细胞TPEF信号和基质组织胶原SHG信号，对乳腺导管癌早期进行鉴别诊断。说明MPM具有为临床诊断提供准确病理信息的能力。

3.2条。定量分析

在图2个在细胞核和细胞质之间，TPEF信号强度变化很大，因此我们可以手工绘制细胞核的轮廓。如图所示2个(d)，我们在ZEN back软件中手动绘制细胞核轮廓后，自动得到细胞核面积。这个细胞核是用ZEN back软件手工圈出来的，用来测量细胞核的大小。从正常、AHD、低级别DCIS和高级别DCIS- mi标本中随机选择20个界限清楚的细胞核。具体来说，核领域是 在正常的乳房组织中， 在ADH， 在低级DCIS中，以及 在高级DCIS-MI中。根据单因素方差分析，我们提供了一个条形图（图3(一个))，以显示不同组别间的显著性。我们的研究结果没有显示统计上的核面积差异( )正常乳腺组织和ADH（间 )和ADH，低档DCIS（间 )。然而，其他两组之间有统计学上的显著差异( )。

对于每个样本，三个相同大小的随机SHG图像( 像素）被选择用来计算胶原密度。胶原密度被定义为像素数A与总B的比率，和像素数A是总像素数B减去低阈值数量（低强度SHG信号和背景信号）的像素数。为了避免对胶原密度的定量测量的“网格”的影响，我们选择在每个“网格（尺寸中间的测量位置（ROI） 像素)”;例如，我们选择了图中白色矩形的位置和大小1个（b） 以量化胶原密度。胶原密度的平均值和标准差为 对于正常乳腺组织， 抗利尿激素, 对于低级DCI，以及 为高档DCIS-MI。柱状图3 (b)）统计的结果显示有统计学差异显著（ )任何两组之间的胶原密度。

为了量化正常导管的大小和损伤所涉及的大小，我们使用了ZEN回软件手动绕基底膜和自动获取其圆周上，如图1个（f） 是的。为了减少“网格”现象对基膜周长定量测量的影响，除图外，我们选择图像中没有“网格”的管道基膜进行测量1个（J）。对于正常的，低档DCIS样品中，选择了三个完整的导管对每个样品计算基底膜圆周。然而，对于样品ADH，被选择的一个或两个完整的导管对每个样品计算基底膜圆周。具体而言，在正常管道基底膜围是 ,在ADH管道是 ,在低级别DCIS中 ,而在高档DCIS-MI，那就是“∞”，因为高档DCIS-MI有一些不完整的基底膜。我们做了基底膜周的单因素方差分析测试，发现无统计学差异显著（ )正常情况下和ADH（间 ),其余两组差异有统计学意义( ),如图所示3 (c).

4。讨论

以SHG和TPEF为靶点的MPM被广泛应用于肿瘤研究和检测，如术中实时检测、边缘实施评估、肿瘤诊断等[13,19,21–24]. 此外，MPM在乳腺癌的研究中也起着重要的作用，包括术中对乳腺病变的快速评估、乳腺肿瘤进展的检测以及胶原密度在乳腺肿瘤发生和发展中的作用[15,25,26]。然而，很少MPM研究已经进行了乳腺导管癌的早期阶段[进行16，尤其是在ADH和DCIS-MI的MPM成像方面。近年来，乳腺导管癌的这些早期阶段因其治疗后预后良好而受到越来越多学者的关注[27]。DCIS与DCIS- mi的鉴别是乳腺病理诊断的难点。由于DCIS和DCIS- mi的治疗策略不同，肿瘤细胞浸润的存在是临床医生和病理学家关注的中心问题。

在乳腺导管癌的早期病变，必须有在细胞学特征的差异，这是肿瘤分期的一个非常重要的指标[25]。高分化DCIS- mi的细胞核明显大于DCIS和ADH，如图所示2个和3(一个).正常乳腺组织，ADH，和低档DCIS的细胞核大多椭圆形。然而，高品位的DCIS-MI的细胞核大小差异，具有圆形和椭圆形的形状。此外，乳腺病变也具有在不同阶段的细胞外基质不同的变化。我们没有发现在核领域和基底膜周围正常乳腺组织和ADH（图之间存在统计上显著差异3(一个)和3 (c))。但是我们发现在胶原蛋白密度在正常乳腺组织和ADH之间的间质组织统计显著差异。因此，可视化在细胞外基质细胞学特征和胶原形态的能力是在确定乳腺导管癌的早期阶段非常有益的。在这项研究中，我们使用通过MPM TPEF信号从细胞内自体荧光和SHG信号从胶原胞外基质结合[检测细胞学特征和胶原结构特征28]。

我们的结果显示，MPM是一种有效的和有前途的临床工具，以确定早期乳腺导管癌。它不仅提供了可与病理学“金标准”的h&e染色切片图像相比的高分辨率细胞学特征，而且还为细胞外基质提供了额外的胶原成像信息[22]. 核面积和基底膜周长的定量结果显示，ADH和低级别DCIS具有相似的细胞学特征，但低级别DCIS病变范围更广，累及的导管更多。与ADH和低级别DCIS相比，高级别DCIS-MI细胞核较大，部分导管基底膜被破坏，导致部分癌细胞向邻近间质组织增殖。胶原密度的定量统计结果反映了细胞外基质胶原含量的变化，是肿瘤分期的重要指标[25]。因此，这三个变量分析将有助于确定乳腺导管癌的早期分期。

相比新鲜未固定的组织样品，石蜡切片样品的MPM成像具有很强的荧光背景由于福尔马林固定[29,三十]. 因此，图像背景更加均匀，能够与细胞核或其他成分产生良好的图像对比度。在本研究中，TPEF信号主要来自弹性纤维、NAD（P）H、FAD和福尔马林溶液。固定高级核的TPEF信号主要来自福尔马林溶液，不随固定条件的改变而改变。以数字表示1个（o）和2个(d)，我们观察到，在未固定的新鲜乳腺标本中，高等级细胞核中有一个或多个红点(核仁)，但高等级细胞核中没有TPEF信号(红点)[25]。在另一方面，新鲜未固定的组织样品的MPM成像可以缩短用于快速术中诊断，因为新鲜样品不要求步骤，如固定和染色。然而，在实际的临床程序，ADH和DCIS-MI的新鲜组织标本更难以收集。

随着对MPM的日益重视，许多研究表明MPM在临床翻译的可行性方面具有很大的优势[20,25,31,32]。然而，与目前公认的临床成像系统(超声、x射线计算机断层成像或层合成像以及MRI)相比，MPM对于组织的高分辨率成像的穿透深度有限。微型多光子内窥镜和灵活的小直径MPM探针克服了这项技术以前的局限性[33–36]。Huland等。和Demirhan等。已经开发出一种紧凑而灵活的多光子显微内窥镜来观察肝，肾，结肠麻醉大鼠[33,34]。Yan等人使用基于梯度指数(GRIN)透镜的荧光内窥镜成像系统来实现在活的有机体内动态荧光微内镜成像监测麻醉小鼠皮下血流运动[35]。此外，卡斯滕等。successfully exceeded the 600 Hz frame rate with a multifocal multiphoton endoscope [37]. 因此，我们的研究离体人乳腺组织将提供在体内和诊所MPM的进一步应用，如术组织和术后病理分析的实时诊断的基础。

5个。结论

总之，MPM是一个非常有用的工具，用于乳腺导管癌早期的无标记识别，包括ADH、低级别DCIS和高级别DCIS-MI。通过高对比度MPM图像，可以定量分析乳腺导管癌早期细胞核、基底膜和胶原密度的微结构变化。经TPEF和SHG联合应用的多光子显微术有可能用于临床诊断，并有助于更好地治疗这些疾病。

数据可用性

本文提供了评价本文结论所需的全部数据。与本文相关的其他数据可向作者索取。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

陈忠臣、郭文辉和康德勇对这项工作作出了同样的贡献。

致谢

这项工作是由中国国家自然科学基金（批准号：81671730），福建省卫生和教育研究的联合基金（WKJ2016-2-28），中央指导地方科技发展的专项资金支持（2017L3009），并计划长江学者和创新团队大学（IRT_15R10）。

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