羟基磷灰石纳米颗粒在口腔条件下与牙科材料的附着

抽象

羟基磷灰石纳米颗粒(纳米羟基磷灰石纳米颗粒)在牙科应用方面受到了相当多的关注，而且它们对牙釉质的附着性已经很好地确定了。然而，目前还没有关于HAP对其他牙科材料影响的报道，这一领域的研究大多以HAP为基础在体外设计时，忽略了唾液薄膜与磷灰石的相互作用。因此,这原位初步研究旨在评估三种羟基磷灰石基溶液在口腔条件下与不同牙科材料表面的相互作用。因此，两名志愿者携带了牙釉质和三种牙科材料:钛、陶瓷和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的标本。制备三种不同形状和大小的纳米HAP (HAP I、HAP II、HAP III) HAP水溶液(5%)。在形成膜3分钟后，在30秒内冲洗10ml。用水冲洗作为对照。冲洗后立即取样，冲洗后30分钟和2小时取样。采用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)对颗粒进行了表征，并对膜- hap相互作用进行了评价。扫描电镜和透射电镜结果显示，颗粒的尺寸范围变化很大。在口腔条件下，2小时后在搪瓷、钛、陶瓷和PMMA表面出现了一层异质性HAP层。在牙釉质、钛和PMMA表面形成的膜与纳米羟基磷灰石之间可见桥状结构。总之，纳米羟基磷虾不仅可以附着在牙釉质上，还可以附着在口腔条件下的人造牙齿表面。 The experiment showed that the acquired pellicle act as a bridge between the nano-HAP and the materials’ surface.

1.简介

羟基磷灰石纳米颗粒(nano-HAP)在牙科中的应用在过去几年受到了相当大的关注[1- - - - - -4]。羟基磷灰石（CA₁₀(PO₄)₆(哦)₂)是一种钙磷酸盐陶瓷，是构成牙釉质的主要矿物成分。牙釉质是人类牙齿外层的坚硬组织。这种晶体具有针状的形态，代表了90%以上的珐琅质矿物结构[5- - - - - -7]。合成纳米羟基磷灰石被认为在形态和结构上与搪瓷的磷灰石晶体相似，具有较高的生物相容性[1,5,6]。从EPPLE M.最近的文献综述得出的结论是，当在足够剂量施加，HAP颗粒呈现无副作用的人的健康，是无毒的及非免疫原性的材料[8]。使得它期望的仿生材料的其它特性包括高表面能，高溶解性，和最佳生物活性[6,8,9]。

因此，纳米hap已越来越多地用于不同的牙科应用。例如，在修复和预防牙科中，HAP可用于加固牙釉质上最初的龋损，保护牙齿免受龋坏和牙齿侵蚀[7,10- - - - - -13]。鉴于羟基磷灰石的特性，它被添加到各种牙膏和漱口液中作为一种额外的化合物，不仅作为损坏牙釉质的修复材料，而且作为抛光、美白和脱敏剂[5,7,14- - - - - -16]。此外，文献证据表明，羟基磷灰石颗粒的大小和形状起着重要作用，影响HAP的性能和应用[17]。有几种原料合成HAP市售的，但是，根据最近的出版物，那些更小的颗粒组成达到更好的效果再矿化[15,16,18,19]。

虽然大多数文献证实纳米羟基磷灰石的这些有前途的性质，有非常不同的结果[7]。虽然越来越多的实验表明纳米HAP的潜力，修复牙釉质[1,2,19- - - - - -21]，其他研究呈现纳米HAP治疗和关于再矿化效果的标准氟化物处理之间没有差异，有的甚至表示不太有效的结果[3.,11,22]。这些不同的结论可能与所采用的方法有关。大多数关于羟基磷灰石纳米颗粒作为口腔护理产品的研究包括在体外设计，给有限的结果。这种方法并不能再现真实的口腔内情况，因为存在各种个体因素，如唾液流、营养、口腔内存在细菌等[23]。

此外，大多数的在体外结果表明HAP和釉质表面[之间的直接相互作用1,2,4,17]。然而，在口腔条件下，暴露于口腔内环境后，任何表面都会立即形成一种称为获得性膜的蛋白质层。获得性膜是由许多唾液分子如蛋白质、糖蛋白、粘蛋白、免疫球蛋白、脂类、细菌成分和其他大分子组成的无细胞无细菌膜[23- - - - - -25]。该防护薄膜组件作为保护屏障，具有润滑剂的功能，并且还改变了材料表面的自由能和电荷[25]。因此，防护薄膜组件 - 磷灰石相互作用是第一步理解后面的纳米HAP的口服条件下报告的影响的机制。因此，一原位设计是评价这种交互最合适的方法，因为它再现了现实生活中的口腔条件，提供更可靠的结果。

很少有原位研究将羟基磷灰石颗粒作为一种口服产品，尽管他们一致表明羟基磷灰石增加了膜的保护作用，防止侵蚀[26]，并且它可以被用作再矿化剂〔27- - - - - -29]。最近原位出版物还表明，含有纳米hap的漂洗溶液能够减少细菌附着在牙釉质上的初始粘附，而不杀死细菌。这是由抗牙釉质表面生物膜形成的抗附着效应引起的，因此具有作为仿生生物膜管理剂的潜力[9,三十]。然而,额外的原位/在活的有机体内需要进行研究来阐明羟基磷灰石与细胞膜的相互作用和羟基磷灰石的作用机制。

由于膜并不局限于牙釉质，另一个有价值的问题是HAP颗粒是否会附着在其他牙科材料上，从而扩大其作用于通常用于口腔康复的人造牙齿表面。因此，本文的目的是原位初步研究的目的是研究在口腔条件下，纳米羟基磷矿粉是否可能附着在不同的牙体材料表面，并评估三种不同羟基磷矿粉的效果。此外，我们还评估了在牙釉质和其他牙齿基质(如钛、聚甲基丙烯酸甲酯树脂和陶瓷)之间的膜-羟基磷酰胺相互作用是否存在差异。

2.材料和方法

这原位实验对象为两名年龄在30 - 35岁之间的健康志愿者。纳入标准为口腔健康良好，无牙龈炎、龋齿或非生理性唾液流率征象[31]。没有全身性疾病;没有使用抗生素或任何种类在过去的6个月内牙周治疗的;非吸烟者;不怀孕或哺乳和缺乏矫正器具。该研究方案经德国萨尔州的医学会医学伦理委员会（编号283 / 03-2016），以及知情同意书是从受试者获得。

2.1。测试的解决方案

在不同尺寸的羟基磷灰石纳米颗粒（纳米HAP）用于测试溶液（表1)。通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)验证了颗粒的大小。将0.5 g的羟基磷灰石溶液加入10 ml双酚二酚水溶液中，配制含羟基磷灰石的试验溶液。10 ml清水冲洗作为阴性对照。受试者在不同的周内使用不同的漂洗溶液，以避免试验溶液和对照溶液之间的干扰，防止可能的交叉效应。根据我们制定的方案，每个志愿者首先使用的解决方案是控制水。一周后，按HAP I、HAP II、HAP III顺序引入HAP测试溶液;同时也尊重他们之间两周的清仓期。

2.2。样品

除了牙釉质，用于口服康复器具其他常见材料是解决：钛（上牙植入物最常用的材料），长石类陶瓷（用作牙科用修复材料），和聚甲基丙烯酸甲酯树脂（共同材料用于修复体的基底)。

2.2.1。牙釉质样品

用牛门牙制作了大约5毫米长、1毫米厚的方形搪瓷板。随后，他们使用网格砂纸(SEM和TEM的砂纸粒度为240 - 2500)进行标准化磨削，并按照以下标准清洗程序去除涂布层[三十]。First, samples were washed with 3% NaOCl for 3 min, followed by ultrasonication with distilled water for 5 minutes. Afterwards, a disinfection in 70% ethanol for 15 minutes took place. And, finally, samples were washed with sterile water and stored at 4°C in sterile water for 24 h.

2.2.2。钛样品

钛（Ti）的光盘通过用喷砂和酸蚀刻（SLA）微结构化表面 ,grade 2, were obtained from Dentsply Implant Systems Sirona, Mannheim, Germany (diameter 5 mm, height 1 mm). Ti discs were polished by wet grinding with abrasive paper (800 to 4000 grit). To remove the resulting smear layer and for disinfection purposes, Ti discs were immersed in isopropanol (70%) for 10 min, followed by washing in distilled water.

2.2.3。陶瓷样品

Square/rectangular ceramic slabs measuring approximately 5 mm long and 1 mm thick were cut from feldspathic ceramic blocks (VITABLOCS Mark II from VITA Zahnfabrik, Germany). These slabs were polished with grit sandpapers (from 240 to 4000 grit). For cleaning and disinfection purposes, the ceramics samples were immersed in isopropanol (70%) for 15 min, followed by a wash in distilled water.

2.2.4。PMMA样品

由Saarlandes大学的假体技术和Paladent®(Kulzer，德国)的自聚合假体树脂试剂盒(粉末和单体)按照制造商说明制备直径为5毫米、厚度为1毫米的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)树脂。抛光用的是网格砂纸(1200 - 4000粗砂)，为了清洁目的，采用了以下方案。将样品置于超声仪中3次(每次10分钟)，2次70%异丙醇，1次无菌水。最后，样品在附着到夹板上之前被干燥。

2.3。口服曝光

为了评估羟基磷灰石颗粒与获得的膜之间可能的相互作用，我们将样本安装在定制的上颌夹板中(图)1)。它们是从1.5毫米厚的甲基丙烯酸酯箔，从前磨牙延伸到第一磨牙。在夹板的颊部穿孔准备固定聚乙烯醇硅氧烷印模材料，其中每个材料被放置。

利用夹板的前，志愿者刷齿不用牙膏和用自来水冲洗不仅是为了避免从牙膏的化合物可能的干扰。After the splints were placed intraorally with 3 samples on each side (total of 6 samples of the selected material), a one-time rinse (30 s) of 10 ml of the selected solution (HAP I, HAP II, HAP III, or water) was performed after a 3 min of pellicle formation. One sample from each side was removed immediately after rinse, 30 min and 120 min after rinse. After each removal, the samples were rinsed with distilled running water to remove nonadsorbed particles. Then, samples were prepared for scanning electron microscopy (SEM). Each volunteer used the splint for two hours, from 10 h to 12 h. The use of the splint carrying 6 samples was repeated for each of the 4 materials and each of the 4 tested solutions, giving a total of 96 samples per volunteer.

2.4。扫描电子显微镜

为了表征粒度和不同粉末的形状，HAP I，HAP II和HAP III溶液直接施加到SEM样品夹持器（铝板），并通过扫描电子显微镜和能量分散X射线光谱（EDX）的评估分析in a XL30 ESEM FEG (FEI, Eindhoven, The Netherlands) at 5 kV and 10 kV at 20,000-fold magnification.

口内曝光的样品进行SEM分析准备冲洗及其与羟基磷灰石颗粒关系后，研究在不同时间的薄膜覆盖。After oral exposure, samples were washed with sterile water followed by a fixation with 1 ml 2% glutaraldehyde in 0.1 M cacodylate buffer during 2 h at 4°C. Finally, the specimens were left to airdry overnight at room temperature in the air chamber. The next day, samples were sputter-coated with carbon and analyzed by SEM and energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDX) evaluations in a XL30 ESEM FEG (FEI, Eindhoven, The Netherlands) at 5 kV and 10 kV, consecutively, at up to 20,000-fold magnification.

2.5。透射电子显微镜

为了评估颗粒的大小，从每个粉末制备5%的纳米hap溶液，并直接应用于piolove包覆的铜网格上，在TEM Tecnai 12 Biotwin (FEI, Eindhoven，荷兰)上进行分析，放大倍数高达10万倍。

此外，还进行了一个补充实验来验证膜层的存在。志愿者携带相同的夹板和2个釉质标本(每边一个)，在膜形成3分钟后用10ml的HAP溶液进行一次性30s冲洗。冲洗30分钟后，将样品从口腔中取出。在志愿者取下夹板后，立即用无菌水清洗样品以去除非粘附细菌。标本置于1,5 ml管中，1 ml 1%戊二醛固定液，4℃，1 h。初次固定后，用cacodylate缓冲液0.1 M洗涤4次，每次10 min, 4℃保存在cacodylate缓冲液中。样品在四氧化锇中室温暗室固定1小时，然后在蒸馏水中洗涤5次，10分钟，在30%乙醇中浸泡过夜。按照TEM的制备程序，在室温下进行脱水。样品通过了50% (2x 10分钟)、70% (2x 20分钟)、90% (2x 30分钟)和100% (2x 30分钟)乙醇系列。最后，在100%丙酮中进一步浸泡2次，每次30分钟，在丙酮/琥珀酸盐(Agarscientific, Stansted, United Kingdom)混合物和3%的加速剂(混合物A)中室温保存过夜。 On the following day, mixture A was poured out and a second mixture, mixture B was prepared (Araldite mixture with 2% accelerator). Samples were left again overnight in mixture B at room temperature in the air chamber. Next, a new mixture B was used to fill the embedding forms. Then, samples were incubated for polymerization for 48 h at 65°C.

最后，超薄切片切成用金刚石刀（徕卡EM UC7，德国）超薄切片，并安装在PIOLOFORM涂覆铜网上，并用在室温下乙酸双氧铀和柠檬酸铅的水溶液对比。用蒸馏水一个密集的洗涤后，生物膜可以用TEM TECNAI 12 Biotwin（FEI，荷兰埃因霍温）的放大倍数高达下进行分析，以100.000倍。

3。结果与讨论

这项初步研究首次证明了在天然牙釉质表面以及口腔条件下不同的人工牙表面可以积累圆形和结晶状纳米羟基磷矿的可能性，而膜可能对颗粒的粘附机制起重要作用。

3.1。牙釉质样品

在这项研究中，釉质应用。研究中使用人类牙齿已经下降，在过去十年中由于多种因素，如难以标准化，难以获得足够量的，而且大多是由于伦理问题[32,33]。因此，使用动物的牙齿来作为替代。牛牙釉质与人类牙釉质关于矿物组成，密度和结构相似性。牛牙齿可以大规模而容易地获得，并且它们具有更均匀的特性。此外，由于其较大规模和较平坦的表面，它们还好办[4,32,34]。

3.2。羟基磷灰石

先前公布的研究表明，该粒子的聚集体和的尺寸和形状影响HAP特性及其应用，以及颗粒尺寸为上搪瓷粘结的关键因素[4,15,16,18]。在在体外Li等人在研究中提出，粒径为20 nm的HAP晶体是纳米HAP应用的最佳尺寸[17]。在本研究中，我们评估了三种不同的羟基磷灰石粉末，其中包含纳米尺度中值大小的颗粒，假设较小的纳米颗粒(HAP I)具有更好的附着效果。用扫描电镜和透射电镜分析了各羟基磷灰石粉末的粒度。HAP I和HAP II粒径范围较小，颗粒大小具有一定的均匀性。HAP I的粒子范围从30到70纳米(图)2)，而HAP II粒子范围为60 ~ 120nm(图)3.)。HAP III的尺寸变化最大，从大约50nm到大于1的颗粒μm(图4)。上的颗粒的尺寸在该研究中应用的每个羟基磷灰石粉末的这些变化表明它们之间有一定的相似性。因此，对它们的附着力行为磷灰石颗粒口服条件下的大小影响无法详细这项研究评估。目前的研究结果表明，对于HAP综合化更好的方法应该被执行以标准化颗粒”的大小。

针对HAP的形状特征，目前的SEM和TEM分析证实了HAP I和HAP II颗粒的结晶状结构(如图)2和3.)。数字4在透射电镜图上，三型HAP的粒子以圆形为主，但也有非小叶结构。因此，HAP III是由圆形和一些针状颗粒组成。有趣的是，这个实验中的圆形颗粒与针状颗粒附着在每个表面上的方式相似。在体外实验表明，羟基磷灰石晶体对釉质有更好的附着性，因为它们的形态与天然釉质建筑单元相似[4,17]。但另一个在体外研究表明，球形纳米HAP有很大的潜力，再矿化牙釉质[1]。据我们所知，这是第一次原位研究比较之间的球状和晶粒状的纳米HAP的影响，而事实证明，既可以坚持形成的薄膜原位在不同的牙科材料。

此外，不管它们的不同尺寸和形状的，所有三种测试的羟基磷灰石的在水溶液中有凝聚的倾向（图2- - - - - -4)，形成不同大小和不规则形状的聚集体。单个粒子在HAP III溶液中更常见，呈现清晰的圆形构象。HAP I和II在水溶液中很少允许观察单个晶体。这种聚集的倾向可能与羟基磷灰石是一种偶极分子的特性有关，因此与粒子之间的范德华力和静电力有关[三十]。对于所有的测试溶液，另一个常见的结果是每个材料表面的羟基磷灰石颗粒的数量和团簇的大小随着时间的推移而减少(如图)5- - - - - -8)。这种模式可以解释为口腔内发生的连续吸附和解吸过程[25]。用HAP溶液冲洗后，粒子和团簇沉积在材料表面。随着时间的推移，这些颗粒会溶解在唾液中。因此，单个的口内剪切力有助于将它们分裂成小的聚集物和单个颗粒，其中一些重新吸附到细胞膜上，另一些被吞食。羟基磷灰石纳米颗粒的连续溶解也会发生，并强化了这些结果。此外，较大的团簇更容易受到剪切力的影响，从材料表面脱落，以及随后的吞咽[4,16]。

3.3。羟磷灰石粘连疗效

从与水（对照）冲洗样品的SEM显微照片（图5- - - - - -8）3分钟口内曝光后显示出薄且不均匀的膜的球状结构的所有表面上。为了验证所选择的样本的试样表面TEM分析一个薄膜层的存在下进行。的TEM图（图9)验证标本上有无获得的膜。30分钟后，所有四种测试材料的薄膜覆盖面积增加，2小时后表面几乎完全打结，由唾液蛋白聚集物组成，呈球状。因此，在对照实验中获得性膜的形成是按照文献的说法进行的，即材料暴露于口腔环境后几秒内就开始吸附蛋白质并随之形成唾液膜[25]。蛋白质 - 蛋白质相互作用继续，30和120分钟后，更厚和更均匀的蛋白质膜是可见的。因此，吸收的蛋白质的量的所有测试样品中的随时间而增加。Literature indicates that the acquired pellicle growth reaches a plateau after 30-90 min, reaching its full thickness around one or two hours [25]。

当使用5%的纳米hap溶液时，纳米颗粒随机分布在所有样品的表面(如图)5- - - - - -8)。漱口后立即，大多数样本的呈现它们的表面非均匀覆盖有颗粒和簇与尺寸和形状的大的变化。HAP我和HAP II产生了大簇结构与尺寸高达4 μ在冲洗后，HAP III在所有材料表面有更好的覆盖分布。漂洗30分钟后，在SEM上可以看到黏附粒子减少，分散粒子增多;然而，也可以看到较小的星团。令人惊讶的是，几乎所有的纳米颗粒在冲洗钛样品上。最后，冲洗2小时后，甚至更小的颗粒可见的SEM图(图5- - - - - -8)和小的团簇仍然可以被发现，但粒子和团簇大于1μm的很少见到。量和羟基磷灰石簇的每个材料表面的大小随时间的减少。HAP颗粒尺寸的影响也被金等报道。在在体外实验表明，粒子在纳米范围内(<1μm)最好与珐琅质粘连[16]。该原位从Kensche等人的研究。also revealed only isolated microclusters 2 h after mouthrinsing [三十]。因此，由于较大的接触面积，较小的颗粒和团簇将更好地附着在膜成分上。

In summary, after 2 h of intraoral exposure, all samples presented a scattered and heterogeneous layer of nano-HAP in contact with the pellicle outer layer. A homogeneous coverage could not be achieved, probably due to the complex interaction that occurs in the intraoral environment, or due to the shape and size of the selected particles. Until now, the scarce原位关于这一主题的文献仅报道了HAP颗粒与牙釉质表面之间存在粘附[9,三十]。但是根据目前的研究结果，我们可以得出结论，羟基磷灰石纳米颗粒也会附着在其他牙齿表面，如钛、陶瓷和聚甲基丙烯酸甲酯树脂，这在牙科预防领域开辟了一个很有前景的研究领域。然而，这项研究也存在一些局限性。磷灰石颗粒在不同测试表面上的粘附相互作用的稳定性没有经过更长时间的评估。另一个明显的限制是志愿者的数量，这使得无法进行定量分析。这种选择的原因与每个志愿者使用口腔内器械次数的增加有关。因此,更多的在活的有机体内/原位具有较高数目的受试者实验需要进行阐明薄膜磷灰石相互作用背后的分子机制。

每种材料的物理化学特性影响膜和生物膜的形成，也可能影响HAP的沉积[35]。Comparisons between all materials showed that ceramic samples had the smallest quantity of HAP accumulated after 2 h (Figure7），而PMMA样品所呈现的相同的时间后的颗粒和簇的较高数目（图8)。从PMMA孔隙度和保留方面说明了它具有较高的HAP沉积协会[36,37]。在所使用的HAP溶液中，HAP II和III对钛试样的覆盖效果更好，而HAP I中几乎没有羟基磷灰石颗粒。类似的覆盖是可见的三种解决方案之间的珐琅质和PMMA表面。数字7结果表明，在抛光过程中，陶瓷表面不规则的地方还会聚集来自羟基磷灰石的颗粒。因此，无论圆形或微晶的形状和大小如何变化，所有三种被测试的HAP纳米粒子都能附着在覆盖着薄膜的搪瓷、钛、陶瓷和PMMA上。

更高SEM倍率来分析累积的纳米HAP和覆盖的每个基板表面的防尘薄膜组件之间的相互作用。Interestingly, when the hydroxyapatite containing solutions were applied, it was possible to observe connective structures between the particle and the pellicle formed on enamel, titanium, and PMMA surfaces after 2 h of oral exposure to the respective rinses (Figure10)。On ceramics, there was no possibility to find these connective structures due to reduced quantity of HAP on this surface after 2 h. According to Vukosavljevic et al., pellicle precursors proteins, such as histatins or statherins have a high affinity to hydroxyapatite crystals present on natural teeth, starting the acquired pellicle formation process [38]。因此，合成的纳米hap的粘附性可能与这些作为粘结剂的膜组分有关。更多的在活的有机体内/原位应该进行研究来详细阐明这些关系。

4。结论

首次提出，无论形状和大小，所有纳米羟基磷化氢作为口腔上升液，在口腔条件下在牙釉质、钛、陶瓷和PMMA表面均有良好的异质性覆盖。因此，纳米羟基磷酰胺不仅可以附着在牙釉质上，而且可以附着在口腔条件下的人造牙表面。初步实验表明，在获得膜存在的情况下，纳米羟基磷化镓与材料表面之间可以形成桥梁。

鉴于纳米HAP粒子在牙科中的重要性日益增加，了解这些粒子与口腔内环境的相互作用机制具有重要意义。尽管在这个初步研究中获得了有趣的结果，但它的局限性意味着需要更多的实验与更多的对象，以更好地阐明膜-磷灰石的相互作用。

数据可用性

所有支持结果的数据都在手稿中。

利益冲突

作者宣称，有兴趣对此文件发表任何冲突。

致谢

作者要感谢为TEM准备样品的Belinda Konig和德国研究基金会(DFG, SFB 1027)对这项研究的部分支持。

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