文摘
原子力显微镜(AFM)是一个简单易用,功能强大、高分辨率显微镜,允许用户在任何水图像任何表面和条件。AFM被用于调查的结构和力学性能广泛的生物问题包括生物分子、生物材料、细胞和组织。它提供了获得高分辨率图像的能力biosamples在纳米级,允许容易实施机械特性。AFM图像的能力和与表面相互作用,在生理上相关的条件下,具有十分重要的现实和准确的医疗和制药应用。本文的目的是审查最近的趋势的使用AFM在生物材料与健康和疾病有关。首先,我们现在的AFM组件及其不同成像模式和我们继续结合成像和耦合AFM系统。然后,我们将讨论使用AFM nanocharacterize胶原蛋白,人体的主要纤维状蛋白质,它已经与许多病理条件。在下一节中,AFM nanolevel表面特征作为一种工具来检测可能的病理条件下,如骨关节炎和癌症。最后,我们将演示使用AFM研究其他病理条件下,如阿尔茨海默氏症和人类免疫缺陷病毒(HIV),分别通过淀粉样原纤维和病毒的调查。因此,AFM是理想的探索研究仪器的检测病理条件即使在非常早期的阶段,使它非常有吸引力的领域的生物和纳米。
1。介绍
原子力显微镜(AFM)属于扫描探针显微镜(SPM)的家人和开发后的扫描隧道显微镜(STM),被授予1986年诺贝尔物理学奖。AFM是一个记录的SPM大幅探针(AFM提示)之间的相互作用的小悬臂和样品表面。在1980年代发明以来,它已成为表面科学领域的基本技术。AFM在其他显微技术有几个优点,如扫描和透射电子显微镜(SEM、TEM)和光学显微镜(包括荧光共焦激光扫描显微镜)。首先,AFM提供可量化的和准确的表面高度信息,到埃水平,同时其他显微镜可以给地形对比,他们不能提供三维地形。测量和图像被AFM可以在空气中,水,或真空条件的温度范围。另外,样品准备工作很容易比用于TEM。AFM图像采集后,用户可以执行机械/电子/磁性表征样品的表面,提供定性和定量相结合的信息(1]。AFM的特点是作为一种非破坏性的工具,可以在不同条件下(空气和液体),因为它只需要基本的样品制备(如不需要脱水,标签与荧光染料或抗体,或表面涂层)(2- - - - - -5]。
AFM尼格和他的同事在1986年提出了(6)和商业afm开始出现在1990年代早期(7]。发明以来,它已迅速成为一种很流行的方法,纳米尺度高分辨率成像和力学性能表征的广泛的样本,特别是生物材料(3,8]。AFM图像的关键需求调查,尖端安装在悬臂(图1)。大量的尖端形状和几何图形是商用连同一系列悬臂弹簧常数(0.001 - 2000 N / m)和悬臂涂料,可以允许成像的软物质没有造成损害,甚至在玻璃压痕。
1.1。力和距离曲线
在本节中,应用部队在AFM尖端之间的交互和样品的表面将呈现。这些力量吸引或排斥根据AFM顶端之间的距离和示例(图2(一个))。更具体地说,如果上述距离足够大,合力是有吸引力的(范德华力)9]。相反,对于小的距离,合力是排斥由于电子轨道的重叠之间的提示和示例9]。前面提到的部队可以使用Lennard-Jones势近似(图2 (b))[10]: 在哪里和分子间力势和两个原子或分子之间的距离,分别;井深(衡量两个粒子相互吸引多少);和的距离吗 。
(一)
(b)
(c)
因为它是呈现在图2(一个),当AFM提示和样品表面之间的距离等于(是平衡距离),提示上的合力为零。此外,如果 ,合力是有吸引力的(消极的合力, ,在哪里是排斥力,吸引力,尖上的总力)。相反,如果 ,合力排斥(积极的合力, )。
1.2。应用部队在AFM操作模式
成像模式的分类是基于样本上的应用力的类型。更具体地说,在接触模式下,小费总是接触样品,合力是排斥的。相反,在非接触模式下,技巧是从未接触样品的表面;因此,合力是有吸引力的。在开发模式下,合力可以吸引或排斥自提示交替走向或远离样品的表面。最后但并非最不重要,力量模式(样品的力学性能必须测试),样本正朝着提示;因此,合力最初有吸引力,然后让人反感。AFM成像模式的选择取决于样本的特点,必须测试。例如,对于一个非生物样本,最好接触模式由于没有与样品可能造成永久性伤害。非常柔软的生物样本,非接触模式似乎是更好的选择。 However, it presents severe limitations (e.g., it must be applied in a high vacuum environment) [11,12),因此,开发模式主要用于成像柔软的生物样本。在图3,总力对距离(提示和示例)。蓝色框呈现一系列交互部队在接触区,和绿色和灰色框交互部队在非接触区域的范围和断断续续的地区(轻敲模式),分别。
AFM仪器本身由一个激光束对齐的悬臂,然后反射到一个位敏探测器(图4(一))。Τhe引起表面的精确运动与压电元素实现 框架。任何变化的探针在样品表面扫描探测器上的激光点的位置被记录并受到反馈电子,导致样品的准确表征表面(图4(一))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
AFM的独特功能之一是,一旦用户发现感兴趣的区域或有趣的特性,可以使用悬臂端应用user-determined力样本。在AFM力谱,仔细校准悬臂弹簧常数,应用力可以用来压缩样本,产生一个力与压痕数据。通过使用AFM nanoindentation过程(13- - - - - -15],试件的刚度/弹性可以记录和杨氏模量的地图可以生成样本的表面(16- - - - - -20.]。此外,进一步的研究正在进行中,改进现有的数学模型,用于定量数据从AFM的收购模式(21]。
2。原子力显微镜:成像模式
许多其他显微镜有不同类型的“模式”以谋取更多的表面信息。例如,SEM利用二级或背散射电子为了形象和提供地形信息和化学成分,分别。光学显微镜可以brightfield,暗视野,极化,或相衬模式,这取决于使用的光学。同样,AFM可以在许多不同的运营模式(数据4 (b)- - - - - -4 (g))。
在开发模式(也称为间歇模式,动态接触模式,和AC模式),悬臂调到其共振频率测量振幅(图4 (b));任何更改的振荡幅度记录提示扫描表面。与这种动态成像模式被认为是非常温柔的样品表面,高分辨率的能力,和几乎所有的横向部队消灭3,22]。
在联系方式,总是在与样品表面接触user-determined恒力(图4 (c))。在这里,用户可以跟踪粗糙,硬表面更好更快的开发模式。摩擦模式成像(图4 (d))是一种静态模式(联系方式)。这种模式适合测量摩擦表面的一边到另一边扭悬臂由转矩测量的探头沿表面光栅扫描。在摩擦力模式中,在这里,扭转的变化(摩擦特性)光电探测器与垂直变化同时记录(地貌)。大多数AFM用户将使用这个获得定性的表面摩擦的对比;然而,随着适当的校准侧向悬臂弹簧常数(23),表面摩擦系数可以计算。
在开发模式中,与地形图像,同时相位图像可以获得7]。在相位成像,系统监测信号之间的相位滞后,驱动悬臂振荡及其输出信号(图4 (e))。图像可用于评估阶段的变化成分,附着力和表面的粘弹性性质(20.,24]。
其他利用mode-based包括性格特征开尔文探针(图4 (f)),磁模式(图4 (g))。开尔文力显微镜(KFM)之一的电气特征,AFM可以执行。在这种技术中,一个接触电位差测量导电AFM探针与样品之间的利益。这种接触电位差是否定的直接外部偏置的应用程序相同的大小;然后等于功函数的差异之间的提示和示例25]。磁成像模式可以形象的磁畴结构表面当magnetic-coated悬臂扫描表面(26]。首先,振动探针扫描表面地貌,但是,调查提高了表面由一个小的距离和吸引力/排斥记录。
AFM也可以在一个操作非接触模式AFM提示的地方根本不接触样品表面(27),但这种模式不常用的生物样品鉴定。
在机械映射模式AFM测量样本刚度,杨氏模量的值,通过nanoindentation技术。在AFM nanoindentation, AFM收集indentation-force曲线感兴趣的样品而这些曲线拟合使用线弹性接触力学模型,如赫兹模型,为了估计杨氏模量(7]。应该注意的是,接触力学模型的选择将force-indentation曲线转换成弹性模是最基本和长期存在的问题28]。模量映射可以由缩进一个有序数组在表面(16]。这种技术可以非常缓慢,例如, - - - - - -像素模量地图,有一个缩进每秒要花一个小时。大多数AFM制造商已经开发出快速力量映射模式来加速这个过程在千赫级缩进,意义 机械地图可以在几分钟内。然而,在这种级别的加载速率,当缩进时间依靠粘弹性材料模量结果缺乏准确性。此外,齿顶圆角半径,这是至关重要的模量计算,将会增加在成像过程。
为了避免这种提示削弱效应在nanoindentation映射,新机械成像技术已经出现。接触共振是一个非常有用的机械映射技术材料介于50 MPa和200 GPa,由振动样品,同时进行接触模式图像。迄今为止,这项技术已经被使用仅在一些生物材料(例如,骨材料(29日)尽管这种技术适用于空气或水条件下(30.]。
在多频,AFM采用多个悬臂的检测频率(高次谐波和/或更高的弯曲固有模式)提供信息关于tip-sample非线性(31日,32]。Multiharmonic模式使用改变振幅,相位的振荡器,和其他相关谐波提供定量当地房地产地图(30.,33]。Multiharmonic,像双峰AFM需要同时激发前两个悬臂的固有模式,允许同时映射的杨氏模量和样品的变形和地形34]。因此,这些模式可以用于研究复杂的细胞和生物分子系统,在健康和疾病,并提供一个详细的定量multiparametric表征(35]。
粘弹性映射是另一个非常新颖的模式,起源于研究多频和双峰AFM。这种技术是一个动态的部队模式提供了成像的地形和软物质表面的纳米机械属性的地图(36,37]。在这里,悬臂振荡在两个固有模式频率这个第一模式记录表面特性和损耗角正切数据(调幅AM),而第二个模式记录频率变化调频(FM)与刚度有关。调幅-调频提供标本的纳米机械信息,如杨氏模量和接触刚度38),有几个优点,包括快速扫描、高空间分辨率和较低的力量应用于样品。虽然这些模式是相当新的,他们已被用于调查几个生物样本,包括蛋白质;小生物纤维,淀粉样原纤维;脂质膜;和病毒(39- - - - - -42]。也已经证明,恶性和良性细胞系存在显著差异的粘弹性响应(43]。
3所示。结合成像和耦合AFM系统和他们的应用程序
3.1。一般
虽然AFM礼物高灵敏度和分辨率成像和调查生物样品在纳米尺度上,它可以没有其他重要信息,如蜂窝组件和生化功能(4,44]。
例如,光学显微成像,特别是使用荧光,是另一个高性能的研究工具,可以提供补充信息。荧光成像技术可以揭示定位和量化细胞内分子和功能即使在单分子的水平。使用特定荧光标签、生物功能的分子机制的图像可以获得高的时间分辨率。同时,由于荧光内在对局部微环境的敏感性,有价值的信息可以获得分子特异性的细胞结构。然而,随着荧光成像空间分辨率衍射限制,其结合AFM可以产生与高时空分辨率图像和为我们提供信息和生化特征。
一般来说,AFM的结合与其他显微成像技术可以产生高质量的科学信息无法通过使用一个显微镜。
3.2。AFM和光学显微成像
光学显微技术经常为了获得互补信息AFM研究[45- - - - - -47]。使用显微镜,利用光为了获取图像,如简单的光学,荧光,和激光扫描共焦显微镜(样品形貌),可以获得有价值的信息关于细胞过程和相互作用。荧光显微镜结合荧光探针,要么是积累在细胞组件或高度敏感等环境变化改变钙离子和氢离子。因为它的内在敏感性,荧光显微镜可以形象甚至单个荧光分子如果没有荧光背景(48]。
样品形貌使用针孔方法空间限制失焦光或眩光达到图像探测器。这样,只有焦平面的形象不仅是获得提供更好的空间分辨率 - - - - - - 飞机还在 - - - - - -轴(49,50]。此外,通过结合机器视觉技术和适当的校准,不仅定性,还得到了定量数据(51]。
近年来,研究的数量的增加,AFM与光学显微技术相结合已出版。两者的结合模式可以提供独特的信息从一个细胞(图5)组织的水平。斯汤顿等人已经开发出一种新技术,它结合了AFM用共焦显微镜为了探索软异构三维样品的力学性能(52]。他们使用腺癌转移性乳腺癌细胞入侵到胶原蛋白水凝胶,确定弹性细胞和细胞外基质的性质。细胞积极入侵或完全嵌入到胶原蛋白矩阵被发现躺在基质表面硬度比细胞。这个加劲Rho-associated蛋白激酶(岩石)的依赖,表明肌动球蛋白收缩性是一个关键的球员在第一阶段的转移。软胶,增强入侵也观察到由于矩阵由入侵细胞软化由于活跃的重排或邻近纤维的蛋白质水解为入侵或者因为柔软动物组织本质上是可取的。
Stylianou等人结合信息从AFM和光学荧光显微镜研究肿瘤微环境如成纤维细胞(的边后卫)和癌症相关的成纤维细胞(保护)53]。据报道,在胰腺肿瘤,治疗被粘连形成,一种癌症特异性的纤维化。粘连形成是由于基质细胞和肿瘤微环境之间的相互作用。根据他们的研究结果,战乱国家表达myofibroblast特点,如α光滑的肌肉肌动蛋白表达、细胞伸长和板状伪足的形成,并且比的边后卫柔软。转化生长因子β(TGF -β)增加细胞刚度(杨氏模量)的两种类型的成纤维细胞和伸长,细胞扩散、板状伪足的形成,和球体只在战乱国家入侵。在另一项研究中,Cazaux等人利用AFM机械刺激,以一种受控制的方式在时间和空间,单一的免疫细胞和荧光成像技术的后果联系通过钙离子荧光探针54]。但也有使用光通过photoactivatable小G蛋白,Rac蛋白,刺激T细胞在记录细胞力学响应。Canale等人提出了一个评论文章试图揭示了有毒的脂质膜之间的相互作用和病理蛋白质聚集在神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症基于AFM研究[55]。研究Wegmann et al .,神经母细胞瘤细胞(N2a)和scrapie-infected小鼠神经母细胞瘤细胞(ScN2a)研究了AFM和免疫荧光显微镜(56]。AFM成像显示地形表面光滑的正常细胞,而scrapie-infected细胞纤维聚合表面。免疫荧光成像,使用细胞的朊蛋白(PrP)抗体(anti-PrP)透露,PrP均匀分布在正常细胞虽然倾向于在ScN2a细胞隔离在优先领域。结合表面和荧光信息,作者得出结论,聚合SCNa2细胞信号是由于结构性变化在细胞表面。最后,使用混合成像显微镜Kuyukina等人,包括AFM和样品形貌,研究了细菌生存在单细胞水平上(57]。荧光显微镜显示,细菌破坏细胞膜时暴露于不同有机溶剂压力。综合信息显示,改变大小,表面/体积比,粗糙度是可能的耐药机制。
3.3。AFM和二次谐波发生(宋惠乔)成像
除了荧光成像技术,非常有前途的微观生物成像模式是基于非线性光学。这些显微技术可以提供高分辨率,不使用荧光标记的三维图像。以这种方式、结构和动态图像的活细胞获得了以非侵入性的方式。其中,二次谐波发生(宋惠乔)结合使用AFM生物样本的调查。宋惠乔发生在两个光子的频率与非线性介质和交互转换成一个新的光子能量的两倍(2 )。作为一个非线性的过程,只有noncentrosymmetric结构如胶原蛋白能够发出宋惠乔信号(58]。Stylianou等人提出了结合AFM和宋惠乔信息作为一个有价值的工具了解非线性光学性质的胶原蛋白和长期宋惠乔用作无损成像监测collagen-related疾病(59]。他们已经开发出细胶原蛋白与控制特点,可以帮助电影造型的胶原基质等多种病理条件下热损伤或模仿胶原蛋白的结构矩阵在不同组织和条件。AFM用于薄膜特性而宋惠乔信号与预定的特征和解释相关的电影。布等人研究了整合素α11β1,基质特异性受体的纤维胶原蛋白过表达在战乱国家,作为管理者的癌症基质刚度和促进肿瘤发生和转移的非小细胞肺癌(60]。图像获取和宋惠乔信号提供信息量化的胶原蛋白组织,AFM测量杨氏模量的提供癌症相关的基质。他们的研究结果表明α11个信号通路在战乱国家用交联胶原蛋白密切相关,与刚度和纤维组织胶原蛋白矩阵。在另一项研究中,罗宾逊等人进行了定量分析的3 d细胞外基质(ECM)改造,参与大量physiopathological生物学过程(61年]。胰腺星状细胞与ECM的互动进行了研究在3 d环境中通过ECM重塑。AFM研究提供胶原蛋白地形、机械性能和刚度,同时宋惠乔显微镜结合图像分析技术被用来观察和获取的图像胶原蛋白结构和拓扑和进一步量化胶原纤维排列和厚度的变化。他们的研究结果表明,增加ECM刚度在纤维化可以与ECM重塑。另外,骑士等人曾与肠神经嵴细胞(ENCCs)在体外在殖民鸡和小鼠胚胎胃肠道的62年]。他们利用AFM研究环境的刚度的影响ENCCs在体外和在活的有机体内和宋惠乔研究其结构。AFM结果显示,尽管最初的肠道间质软,ENCC殖民期间其刚度逐渐增加。补充这些发现,宋惠乔显示逐渐发展中肠组织和浓缩的胶原纤维,与上述刚度有关。此外,刘等人建议使用细胞生成mechanoresponsive细胞系统(mrc)响应专门mechanoenvironmental线索感并杀死癌症转移(63年]。宋惠乔成像报道高胶原蛋白表达与肿瘤转移。胶原蛋白网络观察更比在非癌的肿瘤区域的线性化。AFM透露刚度增加癌症地区异构。AFM和宋惠乔发现很强的相关性之间的胶原蛋白交联,增加组织刚度转移性癌症mechanoenvironment站点显示独特的存在。
3.4。AFM和扫描电子显微镜(SEM)成像
AFM和SEM是两个最常用的nonoptical扫描显微镜,可以为我们提供表面成像和高分辨率特性。扫描电镜具有优秀的景深而AFM可怜的景深,但优秀的对比平样品。扫描电镜可以测量表面的化学成分特性,和AFM可以测量其物理属性。如果只考虑图像采集时间,SEM比AFM快但它产生2 d图像虽然AFM可以给我们提供直接与样本高度的信息。
在大多数相关显微研究,可以获得更详细的信息利用SEM和AFM的优势(64年- - - - - -66年]。例如,马哈茂德等人之间进行了比较研究AFM和SEM对健康的人类肝实质65年]。肝架构映射使用这两种成像模式。AFM可视化的细胞结构,核染色质颗粒而AFM扫描电镜显示其他结构没有注意到。奶油蛋白甜饼等人利用SEM和AFM强调它们在肾癌的诊断和筛选能力基于pathomorphological病人红细胞的变化(66年]。Kaul-Ghanekar等人在另一个研究调查了细胞形态学相结合以及表面粗糙度(67年]。他们探索肿瘤抑制蛋白的影响SMAR1细胞系和肿瘤的老鼠和人类乳腺癌不同的成绩。SMAR1被发现是一个重要的调制器表面粗糙度和细胞骨架的体积。最后,他们认为SMAR1可能被用作健康和癌细胞之间的表型分化标记。艾耶等人也发现,使用AFM、SEM相结合,不同的刷层表面的正常和癌变人类宫颈上皮细胞(68年]。这些刷层很重要,与环境进行交互,可以考虑对癌细胞的部队和力学参数。在另一项研究中,Volakis等人作为异种移植物模型的研究myoferlin的影响,参与蛋白质膜动力学,在肿瘤形成和地方入侵69年]。扫描电镜和图像分析量化细胞表面积,以及板状伪足和丝状伪足的数量和长度。利用AFM图像和确定杨氏模量,一定程度的细胞刚度被发现在myoferlin-deficient细胞减少,细胞骨架网络的完整性。
4所示。AFM和胶原蛋白
4.1。一般
前面几节中提到,AFM能够获取地形图像在纳米尺度上组合在特定区域的力学性能测定。因此,表面的地形特点可以同时获得材料的刚度。小说AFM技术,如双峰AFM,增加了AFM检测的纳米表征功能成分的变化柔软的标本,如蛋白质和细胞(34]。由于其高分辨率,AFM被广泛用于生物分子如纤维状和球状蛋白质的表征。纤维蛋白的主要作用是提供机械稳定性(70年]。纤维蛋白的典型例子就是胶原蛋白和淀粉样原纤维,这是本文的下一小节中讨论。
AFM也已经广泛用于球状蛋白质的机械特性(即。、蛋白质与球面形状和表面不规则)。球状蛋白质存在结构复杂(70年),它的机械测试是一个挑战性的过程。具体来说,应用力学的经典模型,如赫兹模型,提供一些局限性分析;因此,他们只能使用大约。球状蛋白质研究的典型例子使用AFM溶菌酶、牛碳酸酐酶II,乳酸氧化酶。特别是,拉德马赫等人调查的粘弹性性质单一溶菌酶分子在云母(吸收)。理论分析的结果,他们使用赫兹模型和杨氏模量溶菌酶决心等于0.5的平均绩点(71年]。此外,对于调查牛机械性能的碳酸酐酶II (BCA II),修改提出的赫兹模型(Tatara [72年使用了)。在缺乏Guanidine-HCl,杨氏模量的原生蛋白质决心等于75 MPa (73年]。乳酸氧化酶的机械性能(乳酸测定应用于生物分析设备)测定分析力曲线的拟合数据(AFM)提供的赫兹模型为锥形和球形压头几何图形。杨氏模量的值的情况下乳酸氧化酶计算范围在0.5 - -0.8的绩点(74年]。
4.2。胶原蛋白
胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质,几乎占总额的30%的细胞蛋白在哺乳动物细胞(75年]。脊椎动物的胶原蛋白总科由50多个胶原蛋白和collagen-like蛋白质(76年,77年]。胶原蛋白的不同成员总科有不同的形状和大小,但胶原蛋白的标志是它的单体原胶原蛋白,这是由三个多肽链形成一个右撇子triple-helical结构(76年]。这些多肽链中的每一个都包含地区重复氨基酸基序(Gly-X-Y), X和Y可以是任何氨基酸- 12%的三肽序列Gly-Pro-Hyp;带电残基精氨酸、赖氨酸,谷氨酸和天冬氨酸的/大约15 - 20%的残留单体(78年,79年]。
人体有28种不同胶原蛋白,其中纤维胶原蛋白,特别是胶原蛋白类型我最感兴趣的是76年,80年]。胶原蛋白I型的主要蛋白质是细胞外基质(75年),它的特点是独特的特性,如自组装生物相容性,生物降解性、无毒性81年]。胶原蛋白I型分子形成杆状的三重螺旋组装形成原纤维(77年,82年),然后合理对齐,以形成包和纤维77年,82年)(图6(一))。有趣的是,分子是装在一个quarter-staggered时尚,形成d带(也称为D-periodicity),这是一个重复的带型约67海里(图6 (b)),这取决于组织(75年,76年,83年- - - - - -86年]。胶原原纤维的类型我都基本构建块在许多collagen-rich组织(87年,88年),它呈现出不同的形态功能(包括组织机械强度和脚手架细胞迁移)在不同组织(75年,77年,89年]。此外,胶原蛋白已被确认为一种独特的生物材料形成的新型生物工程干预措施(75年,90年- - - - - -92年]。AFM表征(成像和机械性能测量)已经广泛表现在纯胶原蛋白或胶原蛋白rich-tissues AFM不破坏胶原蛋白的纤丝的结构和可以提供的信息从胶原蛋白分子分离纤维/纤维(81年,93年]。AFM已被用于调查关于胶原蛋白大量不同的问题,从胶原蛋白结构collagen-related病理条件和胶原蛋白光学辐射或细胞相互作用。
(一)
(b)
胶原蛋白的结构和力学性能在纳米尺度上使用AFM[在各种条件下都进行了广泛的研究5,22,90年,94年]。胶原蛋白的主要利用AFM调查比较其他技术是能够提供信息关于nanotopographical特性如d带周期性(胶原原纤维由交替的差距和重叠区域的高度可再生的d带周期性大约67海里)(17]。同时,AFM可以提供数据有关的力学响应在纳米尺度上选择区域。因此,AFM是一个合适的工具检测的局部结构和机械的变化一个胶原原纤维,在一些外部因素(11,95年]。独特的能力结合信息nanotopographical并使用AFM纳米机械特性实时胶原蛋白的调查导致了开创性的解决方案(84年,96年]。
因此,AFM被用于几个调查领域相关组织含有胶原蛋白和已被证明是一个有价值的工具领域的组织学和细胞学97年]。此外,AFM已被用于调查的胶原原纤维结构的变化在纳米尺度上相关的各种病理问题如糖尿病(98年]。此外,AFM已越来越多地应用于调查关于辐射产生的影响从自然或医疗活动(如紫外线照射、射频)在组织含有胶原蛋白99年,One hundred.]。例如,紫外线照射对胶原蛋白在纳米尺度上的影响是一个至关重要的问题关于一般人群的健康,由于人类皮肤的慢性接触阳光。结果,提供的信息在纳米尺度上利用AFM技术打开了新的见解胶原蛋白研究和胶原蛋白的相关性nanofeature改变与病理情况。
4.2.1。准备Collagen-Ultraviolet (UV)辐射交互
澄清的皮肤与阳光的相互作用至关重要,因为它是人类生活的一个内在成分(101年]。太阳辐射是由红外、可见和紫外辐射(UV-C、uv - b和a)和人体的接触(例如、皮肤、眼)太阳,尤其是紫外线可以是有害的,导致晒伤,光老化,角膜损伤,和致癌作用102年,103年]。此外,紫外线照射是申请材料科学目的,包括消毒和交联生物材料104年- - - - - -106年]。紫外线可以诱导胶原蛋白的变化特性,包括结构、化学稳定性和机械性能107年- - - - - -111年),AFM技术已经广泛用于调查UV-collagen交互。
它已经表明,辐照的纯胶原蛋白与UV-C降低表面粗糙度(112年- - - - - -114年),这是一个至关重要的参数在细胞表面相声115年,116年在粗糙度改变了表面改性,用于细胞粘附和增长117年]。表面粗糙度的降低由于紫外线照射已经证明不仅在纯胶原蛋白样品还在collagen-based混合,包括collagen-poly-vinyl酒精,collagen-poly-vinyl吡咯烷酮,和collagen-poly (e-caprolactone) [112年,118年,119年]。虽然表面粗糙度是通过UV-C辐照改性,它已经表明,相同的剂量,胶原原纤维保留他们的d带结构特征(114年]。d带周期性是重要的原纤维力学性能和cell-collagen相声,虽然它一直与特定的病理条件(84年,86年,120年,121年]。此外,使用AFM nanoindentation为了研究紫外线照射的影响胶原蛋白的差距和重叠区域d带(17]。发现紫外线照射对高水平有显著的影响重叠和空白区域之间的差异,而原纤维刚度(杨氏模量)的d带区减少,这与UV-induced多肽链断开。此外,它已经表明,细胞的行为是影响细胞培养在紫外线照射过collagen-based基质(114年,122年,123年]。已经表明,细胞可以通常传播collagen-based基质与剂量有关,紫外线照射过的那些用于消毒范围细胞,但是当辐照时间增加,细胞异常生长的特征(或细胞形状)114年]。此外,它已经表明,在某些情况下,胶原蛋白的紫外辐照支持细胞生长和增强细胞生存能力111年,122年,123年]。AFM研究没有揭示重大修改地形胶原蛋白低紫外线辐照剂量时,已经提出改变细胞行为的后果要么力学性质改变和/或断链(One hundred.,124年]。
4.2.2。低级激光(iii)治疗胶原蛋白相互作用
低级激光疗法(低)或photobiomodulation [125年),适用于低级和(也被称为低功耗)激光治疗一些病理条件或异常,包括纤维肌痛、骨关节炎、结核、颞下颌关节疾病,和伤口愈合,增加兴趣。在伤口愈合的情况下,有人建议,下属机制,仍然未知部分,包括线粒体功能的增加,ATP, RNA和蛋白质合成126年]。随后,这些导致增加耗氧量和增强合成简化型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和ATP。因此,促进细胞新陈代谢观察以及增强伤口愈合主要通过增加成纤维细胞的增殖及其产生胶原蛋白的能力。虽然已经确定,胶原蛋白的作用进展LLL-collagen交互保持部分理解。Stylianou和2015年Yova使用AFM技术为了调查影响微光(辐照在红色区域,661海里)对胶原蛋白和对细胞培养的影响127年]。低辐照后,没有发现统计显著的变化在胶原基质的纳米尺度的地形特征(胶原蛋白薄膜),但负面影响(异常细胞形状)被发现在辐照胶原基质培养的成纤维细胞。纤维母细胞形状的调制和行为被记录在没有可测量的表面变化,建议这些影响不受衬底的表面性质通过表面接触指导机制(128年,129年]。这些结果提供了新的见解的澄清低强度机制和胶原蛋白的作用在这个过程。
4.2.3。胶原蛋白的纳米机械特性
扩展使用AFM技术研究集中于胶原蛋白已经表现在过去的几十年由于许多哺乳动物的身体部位含有胶原蛋白纤维的形式(如皮肤、骨骼、软骨、肌腱包含胶原纤维)。典型的测量胶原纤维由Minary-Jolandan和Yu (11]。在他们的研究中,胶原原纤维机械差异由于d带周期性公布(杨氏模量的值被计算为gap和~ 2.2 ~ 1.2的绩点GPa重叠区域)。机械异质性由于D-periodicity也证实了Kontomaris et al。17]。机械定期条带的差异从鼠尾腱胶原蛋白也报道了格兰特et al。84年]。然而,格兰特等人把一个静态和动态压痕方法表明,地形差异不仅在弹性模还在生理上的时间行为相关的频率(0.1 2赫兹)。此外,摩根等人确定的胶原原纤维类型我杨氏模量范围 平均绩点(130年)和Yadavalli等人的范围 平均绩点(131年]。在相同的数量级进行的研究的结果提出了海姆et al .(即。,杨氏模量的值变化范围在1 - 2 (GPa)132年]。相反,温格等人提供的结果存在很大差异比较前面的值(5 - 11.5 GPa) (133年]。如前所述,AFM的关键优势是进行成像和表征在水溶液条件下,这是表明nanomechancial牛跟腱胶原原纤维的性质改变了三个数量级( 平均绩点, MPa)当从环境到缓冲条件134年]。此外,结果表明,重组牛跟腱胶原蛋白可以通过改变成像缓冲区(机械调谐78年]。它也表明,在成像相同的纤维在空气和缓冲区,直径的两倍大小。然后,胶原蛋白的机械性能大约翻了一番,增加1米单价氯盐,进一步增加了pH值降低,增加了100倍100%乙醇(下测试78年]。大多数AFM研究nanoindentation的压缩力学性能测试;然而,它是可能的胶原原纤维进行拉伸试验(135年]。这里,也表明人类胶原纤维减少了对盐敏感和pH值相比,重组胶原原纤维。以及不同含水条件下,温度的影响也进行out-nanomechanical同一个人胶原原纤维的性质变化从4.5 MPa 1°C到1.6 MPa在37°C(图7)。这说明开展纳米机械性能研究的重要性在最相关的生理条件下生物物质。
然而,机械性能在纳米尺度上的确定是一个挑战性的过程。从上面给出的结果很明显,扩展范围值的杨氏模量的值,即使在相同的样本,记录(例如,看到关于胶原蛋白广泛的杨氏模量的值在表1)。基本的原因各种各样的杨氏模量的值(即使相同的样本测试)如下:(一)提供的限制,应用力学的经典模型,常用的使用AFM分析获得的数据(b)关键的实验测定的不确定性大小如弹簧常数测定和确切的形状和尺寸的AFM小费(c)样品制备不同的使用协议(例如,测试在空气中或在液体环境中)
近似的分析讨论关于AFM缩进技术在生物样品提出了“近似AFM Nanoindentation关于生物样本和生物材料在纳米尺度上“补充材料(可用在这里)。
4.2.4。胶原蛋白在组织样本
正如前面讨论的,胶原蛋白是人体中最丰富的蛋白质,是发现在大多数组织需要某种形式的生物力学结构/强度。AFM分析既可以进行图像不仅胶原的结构组织,而且纳米机械属性。眼睛的巩膜(白色)调查显示删除episcleral层的力学性能相差很大,揭示了胶原基质层(136年]。皮肤有非凡的再生能力能够愈合本身在一个复杂的级联的生化和细胞重构过程。最近表明,纳米机械和粘弹性性质上真皮从伤口愈合后的皮肤改变96年]。成像显示瘢痕组织中胶原纤维的取向差异与健康皮肤组织相比,而且疤痕组织硬度比健康组织和健康组织保留更高的耗散特性(96年]。类似的动态/静态nanoindentation也进行猪血管(137年]。血管的外层(外膜)是一种胶原蛋白层,有助于防止过度膨胀。在这里,猪主动脉与肺动脉的外膜层相比,在含水条件下在37°C。这是表明主动脉表现出较大的粘弹性和耗散特性,这是讲得通的主动脉是在较高的压力下与肺动脉(137年]。
5。AFM和特定的病理条件
5.1。关节软骨和骨关节炎
5.1.1。软骨
关节软骨是一种结缔组织,提供耐磨关节运动和低摩擦。它覆盖的长骨头,其厚度在1 - 3毫米。关节软骨的主要功能是吸收和分发应用负载由于关节运动。另外,它还提供了保护软骨下骨的损伤。关节软骨的功能是由其产生胶原纤维网络和extrafibrillar proteoglycan-rich矩阵是高度水化(138年]。失去胶原蛋白或蛋白聚糖结构变化可能导致含水量变化,结果几个损坏的组织。之前已经报道过了,损失水合凝胶蛋白聚糖的后面是一个不可逆溶胶原的降解纤维结果赔偿关于胶原蛋白网状组织,因此患有骨关节炎软骨的发展(139年]。
各种方法能够提供直接在体外在生理条件下观察软骨。典型的例子是光学显微镜(140年,141年),目视检查和组织学(142年,143年]。然而,这些方法是有限的空间分辨率约200海里。此外,在电子显微镜中,关节软骨的超微结构的细节可以提供分子水平上,但这个过程需要脱水和软骨结合金属的化学固定染色或溅射。因此,软骨标本不能检查在接近生理条件。此外,光学和电子显微镜无法提供的测量关节软骨的力学性能。
Τhe刚度测量最直接的方法是经典的压缩测试。然而,压缩试验需要样本操作(例如,样品的表面必须高度并行和软骨切断骨头)。另一方面,macroindentation过程不需要样本操作;因此,典型的压痕测试设备可以用来评估质量的关节软骨的健康或疾病状态(144年- - - - - -146年]。这些设备通常采用硬度计压头直径范围在1 - 2毫米,以评估样品的对应到一个特定的应用负载。然而,刚度测量在毫米范围内不敏感检测病理条件(例如,早期骨关节炎)或变化由于老化144年,146年,147年]。
5.1.2中。骨关节炎
正如已经提到的,已经使用了各种方法测定软骨的病理条件;然而,他们是有限的特定条件(例如,在微尺度测量或测量nonphysiological条件)或者他们只提供特定的信息(例如,成像或机械性能)。相反,AFM提供同步成像和机械性能测量的可能性(即。杨氏模量地图)微型飞行器或纳米尺度的标本接近生理条件。关节软骨提供了一个有趣的行为根据被测试的水平。这个有趣的行为被发现使用AFM。特别是,在微米尺度,它表现得像一个统一的和非结构化的材料。因此,在微尺度,它提出了一个总体刚度值可以作为初始近似,以评估其属性。此外,必须指出软骨可以建模为一个poroviscoelastic材料;因此,整体刚度测量提供一个总模量、粘性和弹性。之前已经报道过了,值1 MPa之间的综合模量范围和60 MPa根据加载条件(~ 1 MPa低频条件(< 0.1赫兹)和~ 60 MPa高频载荷(~ 40 Hz))。
此外,杨氏模量在特定地区的关节软骨在微尺度或在纳米尺度上可以计算使用AFM。之前已经报道过了,关节软骨细胞间的弹性模量矩阵展品与深度有关的增加。具体来说,杨氏模量浅区价值大约是0.52 MPa和钙化深区~ 1.69 MPa (148年,149年]。AFM比较传统方法的主要优点是能够提供关于关节软骨的功能信息。因此,使用AFM,骨关节炎等疾病可以被发现在初始阶段。AFM已经被许多研究者作为诊断工具在早期软骨的病理条件(14,15,150年]。特别是,Stolz et al。15)计算杨氏模量正常的关节软骨在微尺度(2.6 MPa)和纳米级(0.021 MPa)。结果Loparic等人在同一个数量级。关节软骨的microstiffness决心 MPa和nanostiffness kPa软骨蛋白多糖凝胶的凝胶(PG)和 kPa的胶原网络(150年]。Stolz等人研究了骨关节炎关节软骨的早期阶段,证明microstiffness并不存在差异比较健康的软骨。因此,骨关节炎的早期阶段只能发现在纳米尺度上。特别是,在纳米尺度上,nanostiffness计算为83 kPa的正常软骨和5.6 kPa的三年级骨关节炎(14]。因此,这些发现证明了能力检测骨关节炎的早期阶段使用AFM和开辟了一个新的前景AFM作为临床工具的使用。特别是Stolz等人测试了AFM在实际临床活动;从七个病人患有骨关节炎关节软骨切片(病人的年龄范围是在62 - 96年)检查(14]。这项研究的结果显示越来越软化的关节软骨与骨关节炎进展在纳米尺度上给定的年龄。必须指出的所有检测到的变化在骨关节炎的最初阶段只能发现在纳米尺度上。
此外,Stolz等人表明,生物力学和形态学变化发生在关节软骨在正常老化不同比较在骨关节炎的发生发展。软骨软化在骨性关节炎的进展是由于胶原网状组织的瓦解14]。胶原蛋白的加强网络在纳米尺度上只能检测到使用AFM [14]。因此,发现变化的能力在早期骨关节炎和区分这些变化的发生由于正常老化使用AFM的打开了一个令人兴奋的前景作为一种工具在实际临床活动。
5.2。癌症
癌症恶化与改变有关癌细胞和肿瘤microenviroment(时差)组件(151年,152年]。改变癌细胞使他们不同于正常细胞细胞形态学的变化,包括复制、沟通、粘附,细胞间或者cell-to-ECM交互,细胞入侵/转移,甚至细胞死亡。最近,它已经表明,癌细胞比正常细胞有不同的纳米机械性能和机械性能的改变细胞恶性转化过程中发挥着至关重要的作用[152年,153年]。时间由肿瘤血液和淋巴管,基质细胞(的边后卫和战乱国家),ECM(包括主要是胶原蛋白和透明质酸),和其他一些可溶性因素。肿瘤倾向于修改自己的微环境,促进肿瘤的生长和发展。例如,在多肿瘤、胰腺癌、乳腺癌等的时间组件之间的相互作用导致粘连形成,特点是战乱国家的存在和ECM组件的生产过剩154年,157年]。这多反应导致时间加强,增加了压缩机械力在肿瘤内部113年,155年,156年]。此外,时间和癌细胞之间的串扰影响的癌症细胞的特性,包括细胞增殖、迁移,并通过周围组织细胞的入侵。因此,癌症细胞和时间变化的理解在癌症进展是至关重要的,为了开发出新的和更有效的抗癌疗法或诊断技术。有几项研究相关的机械性能的影响ECM和肿瘤进展(157年,158年]。例如,它已经表明,caveolin-1 (Cav1,主要组成部分内吞作用的小窝等离子体膜,促进其他force-dependent收缩和时间加强158年]。AFM出现作为一个关键工具在这个研究领域,提供很多新颖的研究成果(4,159年,160年]。AFM可以作为一个独特的技术来研究癌症细胞属性(如经济增长、入侵和转移),时间改变,癌组织发展。一般来说,对活细胞的工作能力与高分辨率和评估纳米机械属性(例如,杨氏模量属性)使得AFM有价值的技术领域的癌症研究。除了在体外实验的AFM癌细胞,AFM已被用于研究纳米机械时间组件的属性(4以极大的潜力[]和癌症组织切片160年- - - - - -162年]。在本节中,我们首先提出了使用AFM的描述癌症细胞的纳米机械性能及其用于健康和癌细胞之间的歧视。然后,我们讨论了使用AFM研究纳米机械性能从组织切片和可能的应用对于早期癌症诊断。
5.2.1。癌症细胞
(1)高分辨率成像。虽然它已经表明,癌细胞比正常细胞有不同的特征和属性,他们仍然不确定或理解(163年]。AFM技术已经被用于研究癌症和正常细胞形态学、细胞的表面,pericellular活动、蛋白水解活性液,信息或cell-ECM交互,和纳米机械属性。
AFM的主要特征之一,它的一个主要优点是它的高分辨率成像的能力。尽管其他技术,如光学和荧光显微镜,可以提供重要的信息关于癌症细胞形态学在单细胞层面,AFM可以在纳米尺度上提供信息关于细胞形态和表面。例如,AFM已被用于研究invadopodia细胞过程延长细胞和癌细胞浸润和转移中发挥重要作用。Chasiotis等人,菲尔莫等人利用AFM图像表面的人类大脑胶质母细胞瘤肿瘤细胞(T98)胶原蛋白基质在入侵过程中(164年,165年]。他们证明invadopodia呈现一个不同寻常的nanomorphology和结果有关的细胞基质的相互作用提供了新的见解。此外,AFM高分辨率成像技术已被用于描述单液(166年],它扮演了一个重要的角色在肿瘤增殖和肿瘤微环境调制(167年- - - - - -169年]。Sharma等人运用AFM技术来研究液从正常和肿瘤细胞和显示,癌症细胞衍生液具有表面nanofilaments可能有助于在信息交流170年]。同时,AFM可以应用于调查特定细胞的活动似乎是至关重要的细胞转移,作为pericellular蛋白水解活性是重要的时间装修和癌细胞的入侵171年]。AFM可用于评估不同的平均身高,体积,pericellular矩阵蛋白质的分子量分布在身上171年- - - - - -173年]。
在细胞基质的相互作用的研究领域,AFM可以提供独特的信息交互的正常和肿瘤细胞培养基质和获得新的数据cell-ECM交互。已经证明nonmetastatic乳腺细胞坚持不如转移通过成骨细胞矿化基质分泌细胞(174年]。此外,AFM已被用于研究肿瘤细胞在不同基质的机械反应。公园等人研究前列腺癌和乳腺癌细胞培养nanoscafolds和显示不同的癌症细胞系有截然不同的反应底物等特征尺寸和纳米机械性能(175年]。此外,AFM可以用于研究和信息交互。例如,Puech等人研究了黑素瘤细胞系绑定过程中对人类脐静脉内皮细胞(176年),而劳伦等人研究了内皮细胞之间的粘附强度和癌症细胞和证明了更多侵入性细胞与内皮细胞形成最强的债券(177年]。霍夫曼等人使用AFM为了研究交互部队在肿瘤细胞和自然杀伤细胞和证明,为了分离自然杀伤细胞和癌细胞,所需的力量高当杀手细胞受体2 b4被激活(178年]。
(2)力学性能的癌细胞。另一个领域,提供了一个重要的研究兴趣是使用AFM评估癌细胞纳米机械属性。它可以提供极高精度的力量应用于细胞,和固定的生活,在自然条件下(例如,在液体条件下随温度控制),它可以同时提供定量的机械测量高分辨率成像。在细胞结构改变与癌症恶化[164年,179年,180年)和细胞的力学性能在细胞运动中发挥着至关重要的作用,转移和增长181年,182年),癌细胞的纳米机械特性的调查,与正常细胞相比,尤其科学兴趣。
第一个示威AFM测量机械的癌细胞进行Weisenhorn等人于1993年在肺癌细胞,但很大变化的杨氏模量的值。后来,force-volume模式是为了提供足够的数据用于胚胎癌细胞Goldmann et al。(183年,184年]。虽然单个癌细胞的研究可以提供重要的信息关于他们的机械性能,在1999年,Lekka等人的先驱工作证明的比较调查癌症和正常细胞可以提供独特的数据(185年,186年]。膀胱细胞不同程度的恶性肿瘤被使用,结果表明,癌细胞比正常细胞柔软。这是第一个研究表明AFM可用于区分癌细胞和正常细胞的细胞可变形性。为了进一步与细胞恶性肿瘤可变形性,大量的研究已经进行不同的细胞系,包括乳房(161年,187年)、前列腺癌(161年,188年)和口头(189年肿瘤细胞,表明癌细胞比正常细胞柔软的杨氏模量的值。此外,交叉等人研究了细胞从胸腔积液的患者获得和显示,转移性细胞比良性细胞在临床样本(190年),而在许多研究中,它已经表明,细胞来源于正常或良性的组织提供一个类似的模式(153年]。所有这些研究表明,肿瘤细胞的刚度(杨氏模量)的可以被视为一种诊断方法,区分他们从正常细胞(161年]。另外,最近,这是证明了战乱国家也比正常的边后卫柔软和现在增加入侵属性(53]。此外,它已被证实比恶性和良性的细胞系存在不同的粘弹性特性(43]。更具体地说,一个癌细胞具有较大损耗角正切比良性细胞(43]。另一方面,有人建议,细胞细胞类型特异的反应[软化是一个191年),这个细胞特性单独不能作为通用指标转移进展(192年]。因此,更多的研究需要向这个方向,AFM作为诊断工具用于检测癌细胞和区别于正常的真正的临床实践。
5.2.2。癌组织
虽然在之前的章节中,我们目前的癌细胞比正常细胞柔软,这是一个普遍认为肿瘤是硬度比宿主组织(162年]。加强肿瘤是由ECM成分的增加,主要是在癌症恶化(胶原蛋白I型和胶原蛋白交联193年- - - - - -195年),它是主要的生物力学属性实体肿瘤,临床医生和病人可以感觉到在触诊。关于肿瘤的机械性能,AFM似乎是一个有价值的工具,用于评估其纳米机械特性与高空间分辨率。虽然提出了AFM有潜力成为一个独特的癌症诊断工具(162年,180年,196年),朝着这个方向是有限的(160年,197年- - - - - -199年]。
第一个研究这个领域进行snap-frozen乳腺组织,结果表明,恶性上皮是更严格的比孤立的乳腺癌细胞和ECM毗邻上皮逐渐僵硬(198年]。2012年,Lekka等人研究了组织样本endometrioid癌患者的子宫,乳房、外阴癌和他们的研究结果表明,这些组织都比非肿瘤的区域(161年]。在先锋工作,同年,Plodinec等人表明AFM可用于评估独特的纳米机械指纹人类乳房活检可用于癌症乳腺癌诊断(162年]。他们的研究结果显示,正常和良性组织呈现一个统一的刚度(杨氏模量)的分布,而恶性组织表现为两个可区分的最大值。相同的最大值为田等人在2015年人类肝脏组织,被称为低弹性峰(地蜡)和高弹性峰(玫瑰)(图8)[199年]。同时,在这项研究中,不同刚度分布和最大值的其他组织(包括食道癌、透明细胞肾细胞癌、结肠癌、和乳头状肾细胞癌)报告。
2016年,Ciasca等人表明AFM可以评估纳米机械指纹人类胶质母细胞瘤和meningothelial脑膜瘤和AFM技术可以应用于大脑肿瘤分级(200年]。同年,Ansardamavandi等人开发了聚类算法来划分和分类导出刚度(杨氏模量的值)测量(197年]。与他们的技术,他们实现将测量分为三种类别(无细胞的细胞,和纤维组织的一部分),表明AFM可以与计算相结合的方法来确定两个以上不同的组件的组织。2017年,崔等人使用AFM纳米机械指纹的调查宫颈癌和宫颈上皮内瘤201年]。研究结果表明,健康和癌症样本呈现双峰分布的杨氏模量的值与值地蜡,但癌症的消息灵通的值表明,癌组织明显比健康对照组更强硬。因此,消息灵通的值可以作为纳米机械生物标志物对癌症的诊断。同样,2017年,史等人应用一个operator-independent神经网络来识别脑癌的纳米机械指纹(202年]。他们的技术达到识别和区分癌症和健康组织在一个完全自动化的时尚。
目前所取得的成果表明AFM是产生一个新颖的技术评估癌症组织和有潜力的纳米机械性能提供一个小说早期癌症诊断的工具。
5.3。阿尔茨海默病
5.3.1。淀粉样纤维
蛋白质纤维的研究是一个重要的主题在不同的研究领域和学科。一个非常有趣的纤维状蛋白质复杂的淀粉样原纤维是高度有序的原纤结构组装从展开肽或蛋白质(203年]。淀粉样蛋白的沉积,在淀粉样斑块的形式,与许多退化性疾病有关,而淀粉样蛋白结构也被发现在许多功能不与特定疾病相关的蛋白质。参与机制仍然未知,澄清机制的颤动,淀粉样原纤维的结构特点及其物理和纳米机械特性将有助于揭示其生物作用[203年]。AFM对生物样品的纳米机械特性及其功能出现作为一个非常重要的工具研究淀粉样原纤维。例如,Roeters等人使用AFM结合其他技术(如x射线粉末衍射和红外光谱)的聚合研究内在无序蛋白质α-突触核蛋白(α年代)淀粉样原纤维(204年]。这些淀粉样原纤维与帕金森病的病理。他们的研究结果表明,结构的α原纤维不同离子强度的函数,他们认为这一敏感离子强度可能会形成差异的基础α年代有关疾病。同时,在过去几年,许多研究人员都集中在淀粉样多肽和蛋白质在界面的自组装,因为它将提供重要的信息对于理解一些神经退行性疾病的机理205年]。AFM一直工作,到目前为止,结果表明,接口发挥重要作用在组装(肽205年]。此外,最近,Watanabe-Nakayama和小野用高速AFM (HS-AFM),它允许单个分子的构象变化的视频成像,为了调查个别amyloidogenic蛋白质总成的结构动力学(206年]。
5.3.2。阿尔茨海默病
正如已经提到的,纤维粒子的形成与特定疾病。其中之一,产生巨大的社会影响,阿尔茨海默病(AD)。这疾病是神经炎的患者斑块和血管组成蛋白质淀粉样纤维总量的存款β(一个β)。更具体地说,亲水分子β积累以外的神经细胞,导致这些高毒性淀粉样斑块的形成207年]。这些淀粉样斑块由淀粉样原纤维和小的寡聚物,而不溶性蛋白质总量(208年]。虽然聚合β蛋白与神经毒性有关,相关机制尚不清楚(7]。AFM的发展后不久,这是证明了AFM研究是一个功能强大的工具β淀粉和AFM可以提供独特的信息对于理解结构的起源这个复杂的神经退行性疾病(7]。例如,1996年,AFM被用来研究自组装和合成纤维的表面结构209年,210年]。AFM已经应用于许多研究从那时起Α学习β淀粉研究目的。最近的一些研究成果使用先进、成熟,和耦合的AFM技术。此外,AFM已被用于学习β淀粉样蛋白结构在液体条件下(211年),β淀粉样蛋白聚集浓度的函数(212年]。同时,康纳利等人研究了淀粉的离子通道机制和孔隙结构使用AFM [AD病理的213年),虽然一些研究研究的形成之间的关系β淀粉样原纤维和毒性在广告214年]。此外,歌曲等人使用AFM结合荧光光谱,研究香兰素和之间的交互β多肽(215年]。他们的研究结果表明的解聚β香兰素1-42骨料的剂量依赖性的方式,作者表明,香兰素可能的潜在药理剂治疗广告。在另一项研究中,韩寒等人发明了一种复杂的AFM-based技术评价淀粉样前体蛋白(APP)解理机制在nanomolecular层面,应用乳沟的澄清机制是至关重要的新的广告发展的治疗药物(216年]。同时,巴纳吉等人研究了孤立的交联β42三(β寡聚物)的可视化HS-AFM使低聚物的结构动力学在毫秒时间尺度在纳米分辨率。据研究人员介绍,纳米表征的β低聚物的结构和动力学的发展会导致小说oligomer-specific治疗药物。在最近的其他作品,李等人利用实时AFM结合分子动力学模拟作为一种新颖的方法探讨淀粉纳米结构形成了一个潜在的五肽抑制剂(217年),而韩寒等人应用AFM探针之间的相互作用β和两种抗体(207年]。
5.4。病毒和艾滋病毒
5.4.1之前。病毒
AFM打开了一个新的前景的调查病毒的物理性质(218年,219年]。研究关于病毒和病毒的结构性质力学促进工程的物理特性以提高他们的应用程序在生物和分子生物学220年]。特别是,AFM能够获得纳米尺度下地形图像的生物对象(如病毒)。第一次成像尝试关于病毒,使用扫描探针显微镜(STM),是由气压et al。221年]。可视化是噬菌体的病毒粒子Φ29。但在STM图像样本必须是电子导电粒子是覆盖着一层金属,远非其生理条件。这种限制已经克服使用AFM,哪些不需要导电性。AFM已广泛用于地形属性的确定病毒,部分拆卸病毒,病毒衣壳,核酸等。222年- - - - - -225年]。此外,可以使用AFM为了研究活细胞内病毒感染过程(226年- - - - - -229年),测定病毒和其他分子之间的交互部队(220年]。
病毒是固态对象;因此,机械性能的测定是可能的。几乎所有空衣壳,杨氏模量已经确定的假设下,衣壳是均匀和空心理想化的几何220年]。此外,壳厚度和空衣壳的规模被认为是类似于真正的衣壳的尺寸(218年,220年]。杨氏模量测定,薄的弹性理论和有限元分析模型粒子通常使用。然而,这种方法的有效性杨氏模量测定是在讨论230年]。一种不同的方法测定病毒的力学性能是基于考虑病毒粒子和AFM悬臂作为两个理想弹簧串联。在这种情况下,粒子的“弹簧常数”可以确定使用以下方程: 在那里,的值是有效弹性常数的计算(从力和距离曲线的斜率)和是悬臂的弹簧常数。然而,尽管刚度,计算使用弹簧常数,是一个对象的属性,它并不仅仅取决于材料,还取决于对象的尺寸和几何形状。
此外,机械性能测定病毒的一种备选方法是结构强度的决心。在大多数情况下,力与距离的线性曲线时失去了一个特定的力量。线性的损失是由于机械故障或屈曲的粒子。此外,它必须指出,粒子的力学性能测定,使用许多load-indentation曲线。力实验粒子通常不会造成永久性损害。然而,数量大的压痕实验可能导致非线性力学响应或机械故障。这种行为是由粒子的材料疲劳引起的。
5.4.2。艾滋病毒
在医学病毒的一个典型的例子,具有重要意义和社会影响,可以使用AFM测试方法,是人类免疫缺陷病毒(HIV)。艾滋病毒是一种包膜逆转录病毒的遗传物质,在第一阶段的开发是一种单链RNA (231年]。在成熟阶段的发展,病毒基因组RNA用壳体包裹在一个锥形的衣壳(231年]。艾滋病毒衣壳是一个圆锥壳长度~ 100 - 120 nm病毒成熟的组装过程中形成约1500衣壳蛋白分子(这些分子被组织成250五个一和大约12五聚物)。这些五聚物诱导曲率的存在必要形成锥形状的衣壳232年- - - - - -234年]。
衣壳的刚度的计算是强制性的评估任何关于衣壳脱壳的力学模型。几个实验测定力学性能的HIV 1粒子使用AFM已经在过去的十年里(220年,231年,235年,236年]。特别是,Ramalho等人nanoindentation技术应用于测量空衣壳的刚度独立于病毒的信封。特别是,体外组装的野生型和突变体hiv - 1重组衣壳蛋白和孤立和变异hiv - 1核(即。,衣壳)进行了测试。这个研究结果变异明显比野生型硬组件。彭日成等人调查的机制在成熟病毒颗粒的物理性质变化,这些变化的影响在病毒生活方式(235年]。他们的研究结果表明,艾滋病毒提供了一个成熟期间严重减少颗粒刚度所介导的病毒包膜蛋白。Kol等人比较成熟和不成熟的艾滋病病毒的机械性能使用AFM nanoindentation [236年]。成熟的hiv - 1病毒的弹簧常数计算等于0.22 N / m而不成熟的hiv - 1病毒的弹簧常数计算等于3.15 N / m。此外,杨氏模被发现是0.44绩点和0.93 GPa的成熟和不成熟的hiv - 1,分别,这意味着不成熟的hiv - 1病毒硬度比成熟的一个。关于艾滋病病毒的研究是非常重要的,因为成熟的机械软化由于HIV - 1(这是由于Env-Gag交互)的损失可能是感染发生前的必要条件(220年]。
6。结论
nanocharacterization AFM是一个独特的工具,包括高分辨率成像和纳米机械测量,在不同环境条件下的生物样本。新进展的AFM启用同步成像与其他形式提供新的视角。目前大量的研究证明了AFM的能力评估nanocharacteristics独特的生物样本,可以与不同的病理条件。因此,AFM是理想的探索研究仪器的检测病理条件即使在非常早期的阶段,使它非常有吸引力的领域的生物和纳米。
缩写
| 3 d: | 三维 |
| 广告: | 阿尔茨海默病 |
| AFM: | 原子力显微镜 |
| 应用: | 淀粉样前体蛋白 |
| ATP: | 三磷酸腺苷 |
| 战乱国家: | 癌症相关成纤维细胞 |
| 样品形貌: | 激光扫描共焦显微镜 |
| ECM: | 细胞外基质 |
| ENCCs: | 肠神经嵴细胞 |
| 的边后卫: | 成纤维细胞 |
| 艾滋病毒: | 人类免疫缺陷病毒 |
| HS-AFM: | 高速AFM |
| 同类产品: | Integrin-linked激酶 |
| KFM: | 开尔文力显微镜 |
| 低强度: | 低级的激光治疗 |
| mrc: | Mechanoresponsive电池系统 |
| NADH: | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的形式 |
| PrP: | 朊蛋白 |
| 扫描电镜: | 扫描电子显微镜 |
| 宋惠乔: | 二次谐波发生 |
| SPM: | 扫描探针显微镜 |
| STM: | 扫描隧道显微镜 |
| 透射电镜: | 透射电子显微镜法 |
| 时差: | 肿瘤微环境 |
| 紫外线: | 紫外线 |
| VASP: | Vasodilator-stimulated磷蛋白质。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
补充材料
近似的AFM nanoindentation关于生物样本和生物材料在纳米尺度上。(补充材料)