文摘
血影蛋白矩阵是结构元素的红细胞(红血球)。因此,它影响红细胞形态、膜可变形性,纳米结构,刚度,,最终,血液的流变特性。然而,对温度如何影响血影蛋白矩阵。在这项研究中,血影蛋白纳米结构的网络是由原子力显微镜记录。我们描述红细胞血影蛋白的纳米结构矩阵的变化从一个正则网络混乱模式后温度的增加从20到50°C。在20-37°С,血影蛋白网络形成了一个常规的通常结构维度 。在42-43°С,83%的血影蛋白网络假定一个不规则结构。最后,在49-50°С混乱的模式,也没有血影蛋白结构的定量估计的参数。这些结果可能是有用的生物物理研究的破坏血影蛋白网络在病理条件下,以及为研究细胞形态和血液流变学在不同的疾病。
1。介绍
红细胞(RBC)形态、膜可变形性,和纳米结构在很大程度上是与细胞骨架的结构的脂质双分子层(1- - - - - -3]。血影蛋白矩阵被认为是一个关键结构部件的红血球(4]。
温度是一个重要因素影响生物功能的对象。温度的增加会导致红细胞血影蛋白的构象扭曲矩阵(5和改变血液的流变特性6]。
各种方法已经应用于研究红细胞血影蛋白矩阵(7- - - - - -9]。最近,原子力显微镜(AFM)被用来想象血细胞和研究膜的性质。AFM对研究生物的奈米结构尤其有效到几个纳米大小的物体(10- - - - - -22]。
外部因素,如电离辐射(23)、药物(24,25),或长期储存红细胞表面的包装26),以及基因突变(27)可以破坏蛋白质和脂质膜的组件。接着是通过破坏血影蛋白矩阵。了解红细胞血影蛋白网络在不同的物理和化学侮辱的行为仍然是一个重要的科学和临床的挑战。
本研究的目的是运用AFM研究温度对构象的影响红细胞血影蛋白矩阵纳米结构的扭曲在体外。
2。材料和方法
2.1。实验装置
实验工作是根据以下方案:(1)鬼血影蛋白矩阵识别制备方法的发展(2)收购血影蛋白网络AFM图像(3)调查的物理因素(温度)对细胞的影响(4)血影蛋白的定量评估矩阵特征基于上述因素的影响
2.2。血液样本的准备
血撤军(150μL)乙二胺四乙酸(EDTA)包含microvettes (Sarstedt AG) & Co .)、德国)期间进行预防性检查八志愿者(25 - 35岁,四男四女,)。从每个捐赠者获得知情同意。所有实验进行了按照指导方针和规定的联邦研究和临床重症监护医学中心和Rehabilitology,退役军人Negovsky科学研究所一般Reanimatology,莫斯科,俄罗斯联邦。所有实验协议批准这个研究所。
2.3。温度调节
Microvettes包含血液样本被投入了一个热气球温控器TC-1/80 (SKTB SPU,俄罗斯联邦)和孵化30分钟在给定温度。温度范围如下:20°С,36 - 37°С,39-40°С,42-43°С,和49-50°С。
2.4。形成的血影蛋白矩阵红细胞表面的鬼魂
为了清晰,我们定义术语RBC鬼作为红细胞的细胞膜和细胞骨架元素缺乏胞质内容。在我们的实验中,从红细胞脂质分数被鬼魂和血影蛋白矩阵出现在表面上。
图1说明了红细胞的形成鬼魂和暴露的血影蛋白矩阵。细胞首先受到溶血(图1(一)),即150μ500 L的新鲜血液加入μL低渗的溶液组成的一部分0.9%氯化钠(Kelun, Kazpharm,哈萨克斯坦)和蒸馏水的九个部分。这发起红细胞溶血(图1 (b))。由此产生的悬浮在一个埃普多夫管离心机(宁波Greetmed医疗器械有限公司,中国)在3000 rpm 5分钟。上层清液被删除了,75粒μL的管。然后,300年μL(添加蒸馏水暂停继续溶血和悬挂不一。由此产生的溶解产物在500转离心5分钟。软离心后,埃普多夫管悬挂在冰箱里剩下的4°C 30分钟然后在20°C 10分钟继续溶血。包含鬼的埃普多夫管悬挂终于在3000转离心5分钟。一旦移走了上层清液,75粒μL了底部的管和10μL是放在载玻片。涂片红细胞鬼魂的单层膜是准备使用device-assisted V-Sampler(视觉-,奥地利)。鉴于逐步清除脂质在溶血(数字1 (b)和1 (c)),血影蛋白矩阵是现在暴露在RBC鬼涂片(图1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
使用红细胞鬼魂暴露膜表面上的血影蛋白矩阵报道之前(18]。在这里,只有物理方式应用于实现血影蛋白矩阵曝光:渗透(0.9%氯化钠和蒸馏H2O),离心力(3000 rpm)和温度(20°C和4°C)。我们没有使用任何化学药剂的制备RBC ghosts-neither戊二醛和特里同,等等,以避免额外的化学影响protein-lipid结构的膜。
细胞外(外表面)和胞质(内表面)结构的质膜可以通过各种方法研究[18,28]。血影蛋白矩阵在细胞外表面膜的示意图见图1 (b)和1 (d)(箭头)和图2(一)(箭头)。细胞质膜表面上的血影蛋白矩阵数据展示1 (b)和1 (d)(箭头B)和图2(b)(箭头b)。血影蛋白的结构矩阵内一侧后可以观察到膜的转变ZZ平面(数字1 (b),2(一),2(b))。
毕竟如果红细胞鬼维护两个完整表面制备步骤,然后细胞外膜表面上的血影蛋白矩阵可以得到(数据2(c)和2(d))。相反,如果上层部分删除或转移(箭头,图做准备2(b)),那么内表面出现(箭头b图2(b);B,图2(e))。
图2(c)显示了一个示例的一个血影蛋白的AFM图像矩阵获得血液样本的控制上不受任何外部因素。典型的血影蛋白网络的大小 。这样一个基本的网络中观察到 红细胞细胞外表面的幽灵。在 加拿大皇家银行鬼魂的表面,不能检测到网络。剩下的 RBC鬼魂的表面有一个血影蛋白网络的尺寸通常是> 250海里(图2(我))。只有2%的鬼魂的表面呈现转移层(图2(左))。
观察血影蛋白矩阵及其结构特点取决于制备条件。因此,增加体积的蒸馏水制备血影蛋白矩阵1.5(最高可达500倍μL)增加了十倍大血影蛋白网络(数据的数量2(d),2(g)和2(j))。旋转速度的增加红细胞鬼魂12000 rpm导致血影蛋白纤维的断裂(数字2(e),2(h),2(k)2(m))与原始程序(数据相比2(c),2(f),2(我),2(左)和85%的鬼魂转移层(图2(m))。代表血影蛋白的AFM图像矩阵在细胞质膜表面准备使用高速离心是如图2(e)和2(h)。
2.5。原子力显微镜
利用AFM想象血影蛋白矩阵和量化其特点18,20.]。我们使用了NTEGRA Prima AFM仪器(俄罗斯联邦NT-MDT有限公司)在半接触模式下。悬臂PPP-NCSTR-10(纳米传感器、瑞士)5 N / m的力常数,齿顶圆角半径10 - 15海里,76 - 263千赫的共振频率。我们也采用悬臂NSG01 (TipsNano,俄罗斯联邦)5 N / m的力常数,尖端曲率半径10 nm,和87 - 230千赫的共振频率。有512年或1024年在每一行的图像扫描点。
我们红细胞和红细胞表面扫描层的鬼魂。扫描字段是 , ,或 。研究了血影蛋白矩阵纳米结构,膜表面面积 是扫描。我们分析了2 d和3 d图像,以及相应的配置文件。图像处理和定量评估的参数,我们使用仪器的NT-MDT SPM软件。
2.6。统计分析
以下组的红细胞表面捐赠者进行分析:控制20°С(八个捐助者),36 - 37°С(四个捐助者),39-40°С(四个捐助者),42 - 43°С(四个捐助者),49 - 50°С(四个捐助者)。实验重复三次。在每个实验中,相应的样本(诽谤)红细胞鬼魂,总计24 RBC鬼样本为控制和48个不同的温度范围。总的来说,我们获得了81个样本。AFM图像的 和 是为每个样本和十RBC鬼魂从他们每个人选择了定量估计。这产生了一个810 RBC鬼。估计纳米结构特征,50的尺寸值( , )和高度( )每个红细胞鬼是衡量和考虑。对于每一个条件,1800年估计特征。实验数据的统计分析是使用OriginPro执行(OriginLab公司,北安普顿,马萨诸塞州,美国)。数据代表 偏差(SD)。误差图2(我)2(m)3 (c)代表了SD。
(一)
(b)
(c)
3所示。结果
3.1。当地Nanodefects观察血影蛋白网络
图4显示了一些示例血影蛋白网络中典型缺陷的纳米结构中观察到实验温度对血液的影响。通常,每个肌动蛋白复杂(蓝色标记图4)的血影蛋白矩阵由六个血影蛋白细丝(黄线)。然而,如图4(一)偶尔,一个连接可以被打破的。
(一)
(b)
(c)
(d)
基于AFM图像,特征长度的血影蛋白肌动蛋白细丝被估计为端到端距离节点,而高度的纳米结构是由孔的边缘之间的高差和它的最深点(图4 (b))。大小孔的血影蛋白矩阵估计的表面轮廓数据4 (c),5 (c),5 (d),6(c),6(d),6(g),6(h),7 (c),7 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
(c)
(d)
在许多情况下,我们观察到几个(3 - 4)的同步中断血影蛋白细丝在接触点锚蛋白复合体(红色标记图4 (b))。
在其他情况下,我们观察到一个破血影蛋白丝和肌动蛋白之间的关系复杂。血影蛋白的三维图像矩阵元素在图4 (c)显示六个扭曲的肌动蛋白丝连接形成一个锥形。的直径等当地陨石坑估计 。中断的血影蛋白细丝,反过来,缩短膜蛋白之间的距离,导致他们的集群(蓝色标记互相融合图4 (d))。
这样nanodefects可以单独或同时出现;然而,发生的概率是改变了温度的增加。在图所示的结构4(一)可以观察到在36 - 37°С。表示在图的拓扑结构4 (b)- - - - - -4 (d)出现在39-40°С。
3.2。红细胞血影蛋白的纳米结构矩阵是受温度的影响
与其它生物聚合物,血影蛋白的结构性质取决于血液温度。在这里,我们调查了血影蛋白矩阵在生理范围的温度孵化后血液(36-42°С),在更高的温度下(49-50°C),并在室温(20°С)。
3.2.1之上。20°С
新鲜血液是离开后在20°C microvette 30分钟, 红细胞表面出现discocytes和常规血影蛋白网络结构被观察到。典型的血影蛋白细丝长度 ,这正好与控制条件。高差是 。这种模式对应的基本变异血影蛋白矩阵。
3.2.2。36 - 37°С
孵化的血液在生理恒温器的温度36 - 37°C 30分钟不改变细胞的形态或血影蛋白的结构矩阵基本变体(数据相比5(一个)和5 (b))。
血影蛋白网络,其蛋白复合物和细丝,清晰可见(图5 (b)和5 (c))和对应的蓝色,红色,和黄色标记在图4(一)。脂质双分子层破坏的黑暗区域与区域(孔)。在图5 (c)红色箭头显示测量参数之间的结构。在概要图5 (d),相应的区域的点。典型的大小的一个洞 和高度差 。
3.2.3。39-40°С
当血液在孵化39-40°C 30分钟(图6(一)),细胞的形态学改变。Discocytes达 的细胞,echinocytes ,和目标细胞(codocytes) (绿色箭头,图6)。发现了两个血影蛋白网络集合体:第一(数字6(b) -6(d))对应 的情况下,第二个(数字6(f) -6(h)) 显示的情况下,代表血影蛋白的2 d图像矩阵和纳米结构的一个片段。在乐团1中,血影蛋白矩阵正则结构(数据显示6(b) -6(d)),但是网络元素的大小是大于20°C和观察到36 - 37°C(图5);具体地说,它是计算 。2 d图像(数字5 (b)和5 (c)配置文件(图)和相应的表面6(d))表示,整个肌动蛋白复杂是有缺陷的。当地的拓扑nanodefects平截头体的形式与高度 。
在某些区域的血影蛋白网络,失真可以探测到另一种类型的连接,即不连续的锚蛋白复杂,导致部分环结构(数据4 (b)和6(c))。几个邻国的间断连接在这个温度范围内高于在36 - 37°C。
乐团2显示一个不规则,血影蛋白的无序结构矩阵(图6(f) -6(h)),它不同于有序网络观察之前(数字5 (b)和5 (c))。在乐团2,典型的距离显示广泛的分散, 和 。
3.2.4。42-43°С
温度升高到42-43°С导致靶细胞单层的增加 (图6(e))。整体的比例2型血影蛋白矩阵(图6(f)和6(g))也增加到 。的典型参数血影蛋白纳米结构 和 。此外,血影蛋白矩阵不均匀表面不规则的整个网络。确切地说,它看来更不规则的细胞的中心,符合目标结构。
3.2.5。49-50°С
这是血影蛋白变性的温度(29日]。总损伤血影蛋白细丝可以导致改变血影蛋白矩阵作为一个整体,进而导致红细胞形态学的变化。如图7(一),红细胞表面的形状不同,在36 - 37°C(图5(一个)),discocytes只占 的细胞。
血影蛋白的AFM图像网络(图7 (b))显示明显差异而控制(图2(c)和5 (b)), 被强烈的细胞外表面损坏。定期形血影蛋白矩阵没有观察到的,这也意味着它是不可能进行适当的定量估计的参数。一个混乱的模式是观察到的表面(图7 (c)),其典型的参数 和 (图7 (d))。此外,突出结构表面观察,可能由血影蛋白,蛋白质,或囊泡。
血影蛋白矩阵纳米结构的形状和几何参数也估计基于AFM 2 d图像重建的梯度分布对其表面纳米结构的高度, (图3)。明亮的轮廓代表领域 值大。这发生在高度突然改变的地区,如不连续和蘸血影蛋白网络检测到。相反,黑暗的地区与地区 ;也就是高度并没有改变。
因此,温度的增加从36到50°С导致大量血影蛋白矩阵纳米结构的转换,从一个普通血影蛋白网络不规则和无序模式。代表血影蛋白的动力学矩阵纳米结构转换的函数增加温度如图8。随着血液温度的增加,不同的血影蛋白矩阵配置的比例鬼红血球表面的变化,总结了图的直方图8(e),颜色直方图对应标记在AFM 2 d图像数据所示8(一)-8(d)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
从20到50°С,血影蛋白的百分比的网络元素< 250海里了 (20-36°C) 最后(39-40°C) (49-50°C)。
血影蛋白的变化矩阵纳米结构之间的连接与中断相关血影蛋白细丝和膜蛋白,膜蛋白和集群拓扑下降,血影蛋白变性。这些过程的概率随温度,导致一定的动态网络配置。
4所示。讨论
在目前的研究中,我们进行在体外生物物理实验中显示特定拓扑nanodefects血影蛋白矩阵不同的血液温度条件下。温度的主要因素研究的任何材料分子间相互作用和影响,因此,相变的物质。温度是特别重要的生物分子,如聚合物和生物聚合物,其中血影蛋白是一个例子30.]。重点解决当前工作温度的影响在生理范围内(36-42°C)的血影蛋白矩阵结构。
血影蛋白矩阵的血影蛋白是主要的蛋白质;它是由纤维分子的长度180 - 200 nm和2 - 3纳米的厚度31日]。血影蛋白分子由两个大的α和β多肽链,反平行的方向有关,与100 nm的长度。二聚体self-associated为四聚体,这些与锚蛋白相互作用。绑定的锚蛋白胞质域使细胞骨架的连接到质膜(图4)。在战争结束后,四聚物结合蛋白质带4.1和短肌动蛋白丝,形成一个网络32,33]。
在正常生理条件下(36 - 37°C),大部分的血影蛋白矩阵纳米结构(> 70%)形成一个常规网络间距与血影蛋白细丝(数据的长度5,8(一),8(e))。生理温度更高(39-40°C)导致过渡状态(图6,8(b),8(c)8(e)),只有20%的血影蛋白矩阵形式定期形成有序结构网络和40%,但与间距大于控制,剩下的血影蛋白矩阵是一个不规则的结构中发现并不像一个网络。该分布的结果可能会改变细胞的形态和血液流变学改变。最后,在42-43°C,几乎95%的血影蛋白矩阵形式不规则结构。
特别注意给温度的范围49-50°C,血影蛋白变性的发生(29日]。这导致了红细胞膜在体外失去稳定(29日]。在这种情况下,血影蛋白矩阵是在混乱的状态在几乎所有红细胞鬼魂(图7,8(d)8(e)),使它无法充分量化的参数血影蛋白结构。
所有这些过程和测量数据的统计特性,解释了为什么在39-40°C同时观察规则网络和不规则的结构,而在36 - 37°C的血影蛋白矩阵有一个定期和定期间隔的结构,和49-50°C它获得一个明显的不规则结构。
温度的增加会导致破裂的债券血影蛋白矩阵,类似于观察到毒性和氧化因素的作用。血影蛋白的纳米结构矩阵变化将导致不同的结果,取决于因素作用于肌动蛋白(34]或锚蛋白连接(35,36]。
当地改变血液中温度变化所引起的血影蛋白矩阵潜在活性中心局部拓扑缺陷红细胞细胞膜。类似的局部拓扑缺陷后观察药物的作用,电离辐射,长期储存的血液15,23,25,37),导致红细胞表面生物物理过程的改变。
血影蛋白矩阵的改变可以改变血液的流变特性。先前的研究已经调查了红细胞表面力学性能之间的关系,血影蛋白矩阵的结构基础。例如,他们探索之间的相关性大小的细胞的细胞骨架网络,加强3]。细胞膜骨架被认为是负责维持红细胞的形状和允许大变形,使它能够顺利通过狭窄的毛细血管的重复(4]。可逆重排的血影蛋白网络已被证明,允许快速和大变形,从而保证膜的机械稳定性28]。考虑到他们作为膜骨架结构节点,肌动蛋白细丝直接控制红细胞膜的生物力学属性(38]。理论研究也一直在进行建立变形红细胞表面的力学性能之间的关系和血影蛋白的结构矩阵30.]。同时,目前仍不清楚。特别是,血影蛋白的结构在活的有机体内及其变化过程的底层膜变形时还在等待澄清(39]。
5。结论
使用直接在体外生物物理实验在控制的条件下,我们展示红细胞血影蛋白的纳米结构矩阵变化从一个普通的网络混乱的模式,增加温度。本研究可以作为理解的基础体温的增加会影响红细胞膜纳米结构,形态,最终,血液流变学。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。
确认
这项工作已被科技部支持的高等教育“俄罗斯的俄罗斯联邦和学术项目5 - 100。“我们要感谢Editage (http://www.editage.com)英语编辑。