热力学分析髓磷脂碱性蛋白吸附液体结晶Dioleoylphosphatidylcholine单层

文摘

调查的稳定性和动态特性单层吸附在不饱和脂质dioleoylphosphatidylcholine (DOPC)与不同浓度的髓磷脂碱性蛋白(MBP),系统研究了朗缪尔应用技术和原子力显微镜(AFM)观察,基于质量守恒方程的分析方法称为热力学理论。的表面压力使得分子区域( )和表面压吸附时间( )等温线,单层的物理性质来源于不同浓度的MBP的交互液体结晶不饱和脂质DOPC分子定性研究。所显示的表面形态和AFM分析,微观区域被扩大为子阶段的MBP浓度的增加,表明疏水相互作用导致了MBP插入,从而导致积累MBP表面的单层。实验结果表明,该分区系数之间的交互MBP,不饱和磷脂DOPC和MBP单层膜上吸附的分子面积计算使用质量守恒方程。此外,不仅不同浓度的MBP的子阶段施加重大影响的安排和构象DOPC单层,它也具有一定的指导意义,探索生物膜的超分子聚合物的结构变化以及相关疾病的发病机理和治疗。

1。介绍

髓磷脂是一种不对称multilamellar膜结构由少突胶质细胞在中枢神经系统(CNS)。生化分子测试的结果表明,结构的髓鞘膜脂质影响的主要是一个紧凑的堆栈(主要是磷脂)、鞘脂类(主要是半乳糖脑苷)和蛋白质,如图1(1- - - - - -4]。

虽然MBP的交互与不同的脂质一直研究,如酸性脂质和中性脂质,定量研究之间的交互不饱和脂质dioleoylphosphatidylcholine (DOPC)和髓鞘碱性蛋白(MBP)仍被排除在讨论。DOPC称为相对丰富的甘油磷脂,存在于髓鞘,DOPC尾链是用低相位转变温度处于不饱和状态。分子结构如图2。

MBP是中枢神经系统中包含的主要蛋白质之一,本质上是一个无序的外围膜蛋白(5]。的氨基酸序列18.5 kDa MBP如图1(b)。具体来说,三两亲的α螺旋存在于蛋白质绑定到髓鞘,是位于N - c终端和中部地区。18.5 kDa接头形式的MBP代表牛髓磷脂的主要结构和成年人脑(6,7]。MBP促进的主要密集的线的形成髓鞘膜,保持紧密的髓鞘(8,9]。(在一个中立的解决方案 ),MBP显示了19日的净正电荷和等电点(π)10.610- - - - - -12]。在水溶液中,孤立的MBP几乎没有任何规律的结构。然而,与脂质使它绑定形成有序的二级结构,并进行表面构象变化(13- - - - - -15]。

由最近的研究证明,测量的最大插入压力和表面压力MBP对不同脂质层可能提供的信息交互16]。此外,发展一种无定形的蛋白质相MBP两膜之间的影响一直在观察其他研究[17]。此外,大量的定性研究进行了MBP的交互与饱和磷脂通过静电和疏水相互作用[18- - - - - -20.]。因此,研究MBP,不饱和脂质DOPC分子之间的相互作用被认为是实质性的医疗价值和生物意义判断的发病机理和确定治疗中枢神经系统疾病。

此外,我们也在我们的以前的工作11,21,22),进行了AFM研究影响由MBP DOPC单层吸附。因此,这项工作的目标是应用水(磅)单层模型和AFM图所显示的物理特性仿生膜的分子间相互作用与不同浓度的MBP和不饱和脂质DOPC分子。LB技术应用于不溶性单层悬浮在气液界面转移到固体基质通过膜的平衡23]。我们的研究结果揭示了MBP,之间定量关系不饱和脂质DOPC分子和蛋白质分子的吸附动力学上DOPC层使用热力学方法进行了定量分析。此外,MBP分子的聚合状态和分子排列在DOPC单层膜上吸附的协助下AFM观察。此外,我们获得洞察这个复杂混合物的热力学和地形的行为。

2。材料和方法

2.1。材料

后建立的过程Deibler et al ., MBP从默克密理博购买化学试剂公司,从牛脑纯化和孤立,被透析对纯水(24,25]。将MBP的溶液被稀释在Tris-HCl(10毫米, ),最后实验所需的浓度 。aminometha Trimethylol甲胺(三(羟甲基), )。Dioleoylphosphatidylcholine (DOPC)是来自σ化学试剂,可以马上使用,而不需要进一步净化。在单层的研究,DOPC溶解在氯仿/甲醇的混合物(3:1, ),和存储解决方案1毫克/毫升的浓度终于派生。实验获得的水从three-distilled水系统、电阻率为18.2 M厘米。

2.2。测定表面压力使得分子区域( )等温线

的等温线的磷脂单分子层在空气/子阶段界面测量用KSV-Minitrough (KSV、芬兰)朗缪尔电影平衡。仪器上的铂Wilhelmy板可以作为一个压力传感器。表面压力测量范围从0到150 mN / m,和准确性是0.01 mN / m。用于生成的子阶段层Tris-HCl溶液pH值为7.2,10毫米的浓度。微量调节注射器是用于添加一定体积的纯水脂解子阶段或包含特定浓度的MBP的子阶段。随后,溶剂挥发性15分钟,单层压缩在10毫米/分钟的速度和压力传感器实时监控。表面压力之间的关系曲线和平均分子面积绘制。此外,单层膜能够被压缩到所需的膜压力,障碍是停止,单层的面积不变,和的曲线不同与可以记录下来。最后,改变脂质层捕获表面压力和时间。

摘要单层表面压力的准备是10 mN / m。单层是转移到新分离的云母衬底的表面使用垂直Czochralski传输方法(转移比1)。

在上面的实验中,温度是保存在子阶段 °C由外部恒温水循环。每次实验之前,槽和障碍反复与无水乙醇清洗,在清洗前用超纯水。所有的实验都重复三次,以保证曲线的重复性。

2.3。原子力显微镜观察

单层膜转移到云母衬底是在室温下自然干燥,然后进行一个商业AFM (spm: - 9500 j3日本岛津公司仪器有限公司,京都,日本)。主要组件的微悬臂和探针代表参与的AFM图像采集。AFM探针使用微v型悬臂(奥林巴斯光学有限公司,日本京都)。如果探针材料₃N₄和弹性常数为0.06 N / m。整个检测过程进行了在室温下,用扫描的速度1赫兹和一个像素点 。

2.4。热力学理论分析的MBP / DOPC交互

在我们的等温实验中,磷脂单层膜在表面的分布情况与一定浓度的MBP子阶段。基于之前的研究,磷脂是一种不溶性表面活性剂,只能是位于空气/子阶段的界面,使磷脂的浓度可以忽略不计。MBP称为溶性表面活性剂,有能力区分界面和子阶段,它可以在空气/子阶段与磷脂交互界面,和子阶段的MBP浓度不能打折(26]。整个过程系统的温度保持不变。总摩尔数的磷脂和蛋白质系统,表面积和表面单层可以测量的压力。这些参数可以用来计算不仅MBP的分区比单层界面和子阶段,分别,而且蛋白质分子所占据的膜区域。基于研究在施瓦兹和泰勒27,28),质量守恒定律可以表述如下: 在哪里 , 代表蛋白质的总量增加,显示系统中脂肪的总量,表示混合系数,被称为蛋白质的数量在子阶段,然后呢代表界面域蛋白质的数量。为了方便研究,所有的数量都是表示物质的量。

根据施瓦兹和泰勒(27,28),当亚幕中蛋白质的浓度很低,它的非理想的相互作用可以忽略,可以使水的化学势变化可以忽略不计,也就是说,在平衡条件下,和决定仅仅增加在该地区每摩尔的脂质( )和表面压力( ),在哪里可以表达的增加脂质区( )和总脂质( ),也就是说, 。当表面压力和增加每摩尔的脂质面积保持不变,和是常数。因此,根据质量守恒的情节,是一个线性的函数 。所有的参数都可以与实验数据进行了分析。

为了获得区域被MBP分子,有必要分析后表面积的增加蛋白质吸附到脂质膜的实验。增加的数量每摩尔的脂质区( )分析了表面压力的函数( )通过比较蛋白质的存在与否的子阶段。面积的增加归因于不仅的表面积吸附蛋白( )而且每个脂质分子的变化对该地区由lipid-protein交互( )。

每个脂质分子所占据的区域不固定蛋白质插入脂质单层时,蛋白质的表面积吸附单层的接口是明显大于每个脂质分子所占据的区域。根据以下方程,因此,蛋白质的分子面积可以计算如下:

3所示。结果和讨论

3.1。相互作用的理论分析不同浓度的MBP, DOPC单层膜在空气/子阶段的接口

不同于其他小分子表面活性剂水溶性差。它是高度挑战性的确定表面活性剂在水中的溶解度热力学或其他传统的方法,如吸附过滤结合探测器。因此,一定量的表面活性剂DOPC解决方案添加到子阶段与不同浓度的MBP。理想情况下,单层膜被压缩时,磷脂分子一直在接口,磷脂分子进入的数量的子阶段解吸非常低。它可以认为是没有损失的压缩单层膜的过程。因此,当温度不变时,表面的单层压力空气/子阶段界面监控通过使用传统的朗缪尔电影平衡。对于一个给定的等温线( )不同数量的脂质和蛋白质,由方程(质量守恒方程1)应用于计算不仅MBP的分区比单层的接口和子阶段还细胞膜蛋白质分子占领的区域。

澄清MBP的相互作用吸附单层的子阶段的不饱和脂质DOPC,进行了测量。图3显示等温线DOPC层在不同缓冲子阶段包含MBP浓度在1.0和3.8 nM之间。纯单层DOPC展品典型的等温线斜率的变化 ,面积73²分子,从液态冷凝相变发生固态(29日]。此外,如图3MBP浓度增加后,在子阶段,所有的等温线DOPC研究分子的地区转移到高,表明层进行了扩张。它可以看到从图的放大图3(一个)的初始区域纯DOPC单层大约是105²。此外,当浓度MBP子阶段是1.0,1.5,2.5,和3.8 nM,最初的面积大约是155,190,245,307²,分别。根据实验结果暗示,MBP吸附DOPC单层膜与它交互的接口和扩展分子区。

为穿透调查MBP, POPC分子与不同浓度的组合子阶段,基于质量守恒方程, ,功能之间的关系和在固定表面的压力下(10 mN / m)可以从图中获得3。越多的总量脂质添加到界面,线性斜率越小。当不变,功能之间的关系和可以确定。如图4的分布系数,斜率代表MBP, POPC之间的互动。的 - - - - - -轴截距是指数量的MBP的子阶段。因此,当 ,分区系数 ,MBP的子阶段的数量是0.02 ,通过计算可以知道一个MBP分子结合能力 DOPC分子。此外,根据方程 ,分子面积MBP以不同的浓度可以确定。当表面压力10 mN / m, DOPC添加到接口的数量是29.20 nmol, MBP的浓度为1.0 nM, MBP的分子面积是107.05²。当浓度达到1.5,2.5,和3.8 nM, MBP的分子面积为160.39,267.35和406.42²,分别。当DOPC添加到接口的数量是21.60和38.10 nmol,分子的不同浓度的MBP子阶段是显示在表中1。它可以从理论计算,建立分子区域被一种蛋白质显著大于所占据的分子区域一个脂质分子。

3.2。吸附的MBP DOPC单层膜上

DOPC系统的界面吸附被评估在没有或MBP浓度增加。所显示的图5,当最初的表面压力达到10 mN / m,表面压力往往表现出下降趋势,表明压缩后的脂质分子在界面停止将MBP分子重新排列或高相对分子量将携带一些DOPC分子子阶段,从而导致表面压力下降。从曲线,可以直观地分析了MBP浓度增加子阶段,表面压力变化的动力学和程度影响显著的单层膜的脂质成分。减少数量,如下: 。发现更高浓度的MBP子阶段导致更强的MBP, DOPC分子之间的相互作用。此外,发现更多MBP分子转移DOPC分子子阶段,与他们互动,从而使单层稀疏的。表面压力未能进一步下滑超出3500年代和最终达到平衡态,这表明,MBP已经吸附在DOPC单层或MBP已经进入到子阶段产生聚合结构。因此,脂质层和MBP之间的相互作用被认为是疏水相互作用。总之,MBP的吸附容量DOPC单层很大程度上是依赖子阶段的MBP浓度和单层膜的脂质成分在空气/子阶段的接口。

3.3。AFM观察不同浓度的MBP吸附在不同的脂质膜

在此系统中,当表面压力10 mN / m,空气/子阶段的单层界面被转移到光滑的云母衬底和AFM观察到。这个系统是定意确定MBP会导致DOPC单层的构象变化。清楚地揭示了AFM图像,蛋白质分子分散在云母表面(图6)。图7说明了混合层的表面形貌和不同浓度的MBP, DOPC,和它可以发现大量的蛋白质颗粒分散在表面microdomains混合层。每个图像的规模酒吧是5μm。如图7(一)域是均匀分布在云母衬底在缺乏MBP, microdomains展览一个统一的“petal-like”结构,分子排列是相对较近。当子阶段的MBP浓度1.0 nM(图7 (b)),大型单层表面形态的变化,“花形”结构的microdomains更加明显。图7 (c)清楚地表明petal-like结构(图7 (c)放大图的照片吗7 (b))。与崛起的蛋白质浓度在子阶段(图7 (d)),花瓣——就像microdomain增长增量的结构。MBP浓度为2.5 nM时,单层的继续增长,花瓣般的结构,发现零星的蛋白质是分散在microdomain的表面。当MBP的浓度上升,至3.8 nM,单层膜的微观结构面积是越来越稀少的。总的来说,子阶段的MBP浓度越大,面积越大petal-like microdomain和脂质膜结构越来越稀疏。此外,它可以发现,蛋白质颗粒分散在表面的单层。与此同时,随着浓度的上升,MBP将聚合,这表明MBP分子的影响已经被DOPC域在单层吸附形态与DOPC分子的交互。图8介绍了表征混合层的形态变化无论存在与否MBP,每个图像的规模酒吧是10μm。相互作用的动态过程不饱和脂质DOPC和MBP可以更直观地理解使用模型图如图9。首先,MBP, DOPC分子之间的相互作用会导致MBP分子吸附界面(图9(a))。其次,在压缩过程中,MBP分子挤出的接口和携带一些磷脂分子子阶段,从而导致膜被进一步放松(图9(b))。

4所示。结论

这项研究提供了坚实的实验证据MBP, DOPC之间的互动。在目前的工作,表面活性不饱和烃的DOPC一半已经彻底研究。实验的结果证明(1),我们已经成功地应用数学和物理方法来确定可能的吸附MBP DOPC单层的。这些结果证实了有趣而新颖的结构和热力学性质。根据质量守恒定律,计算出一个MBP分子结合能力 DOPC分子和分子区域被MBP浓度不同。(2)考虑到等温线,可以判断,MBP DOPC单层渗透liquid-expanded阶段,挤出的单层liquid-condensed阶段。此外,当表面压力很低,可以吸附到脂质单层MBP,每个分子从而增加脂质区域。(3)AFM图像进一步表明,MBP与DOPC密切互动,可能诱发DOPC单层构象变化。总之,应用热力学性质研究MBP, DOPC分子之间的相互作用提供了一个更好的理论和实验基础获得深入的了解MBP保持髓稳定和紧张。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

工作得到了国家青年基金(11804264)和特殊的科学研究项目由陕西教育部门(19 jk0429)。

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