Label-Free血管成像在人类正常乳腺癌和乳腺肿瘤组织使用多光子显微镜

文摘

血管循环系统的重要组成部分,运输血液在人体和维持体内平衡的生理组织。病理上,血管往往受到疾病的影响,导致不稳定的形成,不规则,hyperpermeable血管。异常在肿瘤微环境中,泄漏的肿瘤血管与肿瘤的组织学分级和恶性潜能,也可能促进癌症的转移。视觉血管的诊断是非常重要的对于我们理解疾病的发生和发展。多光子显微镜(MPM)是一个潜在的label-free诊断工具基于二次谐波发生(宋惠乔)和双光子激发荧光(TPEF)。MPM能有效地观察形态学变化的生物组织在分子和细胞水平。在这项工作中,我们证明label-free MPM可用于可视化微观结构的血管在人类正常乳腺癌和乳腺肿瘤组织。此外,MPM可以监测血管肿瘤微环境的变化。这些结果表明,MPM将成为一个有前途的技术,临床医生研究微观结构的属性的血管。

1。介绍

血管循环系统的主要组件。根据他们的结构和功能,血管被归类为动脉,毛细血管和静脉1]。血管分析的重要性已经被引入新的医疗技术支持,旨在增强血管可视化在临床实践中。血管成像在不同临床领域扮演着重要的角色,如大脑(2)、肿瘤(3],眼科[4),和神经外科5),无论是在诊断、治疗计划和实现或评估和后续治疗的结果。血管成像可以测量血管通透性和分析细胞的异常血管的墙。他们可以确定血管生成的位置,评估血管异质性,并区分血管生成和血管正常的特点6]。在传统的组织病理学、苏木精和伊红染色())病理诊断的金标准。然而,他走时染色过程需要大量的时间,包括福尔马林固定和石蜡包埋。因此,它不能用于实时成像。计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI),正电子发射断层扫描(PET)在动物和人类提供无创性血管图像。CT允许船舶及其周围结构的三维可视化。尽管优秀的图像质量,但CT使用电离辐射和外源造影剂,这是有害的。核磁共振相关工作的基础上,对比不同的质子的密度。它不使用电离辐射但需要造影剂。然而,它也有一些缺点:扫描时间长,可能需要对强磁场对更好的信噪比,而不适合实时成像。 PET has resolutions of a few millimeters and can only detect lesions in larger vessels. Although MRI, CT, and PET imaging can be used to monitor abnormal blood vessels in tumors, they have some limitations [7- - - - - -9]。因此,有必要开发非侵入性和label-free方法更好地识别血管。

近年来,MPM已成为生物组织成像关键技术在细胞水平上,可以提供高对比度图像结构在组织的深度10- - - - - -12]。这两种类型的非线性相互作用发生在生物组织不使用外源性的污渍。在这种情况下,我们使用MPM可视化人体乳腺组织的血管结构。MPM清楚地揭示了血管壁的分层结构,可以清楚地识别正常血管和肿瘤血管。

2。材料和方法

2.1。样品制备

知情同意这项研究是获得所有的病人,医院的机构审查委员会附属联盟福建医科大学批准了这项研究。一共有25个乳腺癌患者参与了这项研究。正常乳腺组织拍摄6厘米远离肿瘤的边缘。他们处理标准病理过程的一部分,包括福尔马林固定、酒精脱水,石蜡包埋。每个石蜡块样品切成三个5μ米厚超薄半自动切片机连续组织切片的病理实验室。在成像之前,样品被酒精和二甲苯deparaffinized。中间部分是用来与苏木精和伊红染色())和组织学检查标准光学显微镜。剩下的两个相邻的部分是MPM成像。

2.2。多光子显微成像系统

MPM成像系统是一个商业设备结合蔡司LSM 880激光扫描显微镜和锁模钛蓝宝石激光器,可调从690纳米到1064纳米。在我们的实验中,选择810海里的激发光MPM成像。在渠道模式中,图像可以同时在两个独立渠道收集。一个频道检测宋惠乔信号(绿色编码)从395纳米到415纳米,而其他通道的检测TPEF信号(红色的)设置从428纳米到695纳米。在λ模式中,光谱图像是通过收集发射信号在389到716纳米之间。为了获得清晰的图像大面积,我们选择了一个20 x (Plan-Apochromat, ,蔡司,耶拿,德国)客观工作通道模式,选择了63 x (Plan-Apochromat, ,蔡司,耶拿,德国)油浸物镜λ模式。

3所示。结果

3.1。确定通过MPM血管壁的结构

阐明MPM是否有可能识别血管壁的结构,我们执行MPM的动脉壁图像无污点的人类乳腺组织部分。除了毛细血管的血管壁内膜腔表面向外,中模,外膜(13]。血管壁的胶原蛋白和弹性蛋白是重要的组件,导致血管壁的强度,以及胶原蛋白的数量和结构主要是什么定义血管壁的机械性能(14]。

数据1(一)和1 (b)分别宋惠乔和TPEF图像。在图1 (c),有明显的血管壁的不同层和层之间的接口,因为不同的内源性信号层。因此,三层的位置的血管壁容易辨别的。MPM图像,内膜(位置1)产生强烈的TPEF信号(图1 (b)(图)和弱宋惠乔信号1(一))。内膜由内皮细胞和皮下层(包含少量的胶原纤维和弹性纤维)。图像显示一个强烈TPEF信号从内皮细胞胶原蛋白和弹性纤维,而弱宋惠乔信号。在船的横截面,内膜出现高度波浪结构因为船的墙壁是狭隘的13]。血管的内膜被MPM容易分辨,而H&E-stained形象图1 (d)。膜媒体(位置2)是由主要是平滑肌细胞和一些弹性蛋白和胶原纤维。中模表现出一种很强的MPM图像TPEF信号从平滑肌细胞和弹性纤维(图1 (b)),而弱宋惠乔信号从胶原蛋白(图1(一))。外膜包含弹性蛋白纤维和致密的胶原纤维(13]。动脉外膜(位置3),图像显示一个强烈宋惠乔信号从胶原纤维(图1(一))和一个TPEF信号从弹性蛋白纤维(图1 (b))。覆盖图像显示血管壁的结构细节和高对比度。此外,与H&E-stained形象相比,血管壁的组件可以通过MPM的图像更清晰。

3.2。光谱分析层的血管壁的结构

因为血管壁的内源性成分不同,光谱成像的血管壁也进行了阐明非线性光信号的起源。组织部分很兴奋在激发波长为810 nm收集发射光谱,和非线性发射光谱收集389至716海里λ模式下使用光谱探测器。图2显示了内膜的发射光谱(蓝色)、媒体(红色),动脉外膜血管壁的(黑)。血管壁的发射光谱是由两部分组成:一个窄的发射峰大约一半的激发波长(810海里)TPEF宋惠乔信号和一个广泛的发射光谱的信号从430和716海里。比较和宋惠乔TPEF信号强度的三层血管壁,发现内膜的宋惠乔信号强于的媒体,而内膜的TPEF信号弱于媒体。外膜展品宋惠乔强信号,因为它含有致密的胶原纤维。

3.3。识别各种血管通过MPM在正常乳腺组织中

演示MPM的能力来检测血管不同的体系结构,我们也各种血管成像。在本文中,我们确定了四个主要类型的显示血管壁的结构和空腔的直径。图3显示了MPM图片和相应的H&E-stained图像不同类型的血管。第一行图3显示MPM图像(a、b和c)和相应的H&E-stained形象(d)的小动脉,可以看到,血管壁的三层捕获MPM与清晰。有大量的墙壁的小动脉平滑肌,可收缩或放松改变血液(交付的数量13,15]。第二行数据3(e) -3(h)描绘了小动脉的结构;它有一个腔小于300μ米直径。小动脉血流控制毛细管床上通过收缩或扩张腔,因此,血管壁包含几个同心圆的平滑肌13]。小动脉的相对明显的三层结构还可以看到MPM的图像,这是符合H&E-stained形象。数据3(我)3(左)显示宋惠乔TPEF,覆盖宋惠乔/ TPEF和相应H&E-stained图像的小静脉,分别。小静脉有更大的比小动脉腔和薄墙,这是与减少静脉比动脉血压。静脉仍然有三个基本层(内膜、媒体、和动脉外膜)。墙上的小静脉由内膜内皮,薄的媒体和一些平滑肌细胞和弹性纤维,和一个非常薄的膜结缔组织组成的答辩(13]。数据3(m) -3(p)显示MPM和H&E-stained小静脉的图像。这是一个非常小的血管的微循环。小静脉从约50μm - 200μ米直径。与小静脉相比,小静脉腔直径小,血管壁的三层结构也是显而易见的。

3.4。MPM成像异常血管的肿瘤微环境

肿瘤血管表现出许多结构和功能异常在肿瘤微环境。他们在大小和形状是不规则的,缺乏传统的等级制度和动脉和静脉的识别特征16,17]。数据4(一)-4(p)显示宋惠乔TPEF,覆盖宋惠乔/ TPEF和相应H&E-stained图像异常的血管在肿瘤微环境中,分别。第一行图4显示MPM (a、b和c)和H&E-stained (d)的图像大量的微血管和巨噬细胞在肿瘤微环境。微血管(黄色箭头)和巨噬细胞(白色箭头)被TPEF信号检测。异常血管的肿瘤,肿瘤增长的重要性和在癌症检测和治疗程序,而巨噬细胞的密度是一个贫穷的预后标记对许多癌症,包括乳腺癌。肿瘤相关巨噬细胞(tam)是肿瘤转移的关键18,19]。他们促进血管生成,血管生成因子的合成,调节胶原纤维性颤动,促进肿瘤细胞活性(20.]。它可以明显看到MPM的图像有很多微血管周围巨噬细胞。因此,巨噬细胞入侵微环境的中心和重要的肿瘤治疗药物靶点21]。巨噬细胞的清晰视图数据5(一)和5(b)显示绿色矩形区域的放大图。巨噬细胞(白色箭头)规模大,以及丰富的泡沫在细胞质中。微血管(黄色箭头)非常清楚,因为有很多的红细胞在血管腔,这些细胞可以释放强大的TPEF信号。某些淋巴细胞(蓝色箭头)血管周围。这些细胞可以识别因为原子核几乎是充满整个细胞和细胞质中很少见,因此生产TPEF信号弱。因此,这些血管的形态学特征在肿瘤微环境中可以清楚地看到从MPM成像,可以清楚的区分出周围的细胞。MPM图片上面的各种组件对应H&E-stained图像。这些组件被证实由一位有经验的病理学家。

在数据4(e) -4(h),有许多血管(黄色箭头)在肿瘤细胞(粉色箭头)和血管的形态非常不同。与正常血管图3他们在大小和形状不规则,经常畸形和曲折的,薄墙。在肿瘤血管在许多方面不同于正常的血管。他们有不规则结构和功能异常。形状不规则的血管可以防止药物输送到肿瘤细胞,从而促进肿瘤进展(16,17,22]。从MPM的顶部图片,很明显,肿瘤细胞(粉色箭头)倾向于迁移到血管以及胶原纤维的方向(白色箭头)。在乳腺肿瘤,TPEF成像可以清楚地分辨单个肿瘤细胞和描述细胞的分布。胶原束宋惠乔成像清楚地揭示了线性化肿瘤微环境。放大图(数字5(c) -5粉色的矩形(d)),我们可以看到肿瘤细胞的形态特征和胶原蛋白更清楚。

数据4(我)4(l)描绘的微观结构异常肿瘤周围的血管。墙上的血管是不完整,缺乏必要的严格的内皮细胞屏障功能正常。正常血管的内皮细胞相对完整和作为选择性屏障,严格控制之间的物质交换血液和周围组织(23]。这个异常结构导致血管壁通透性增加,连续渗透提供了结构基础血浆和血液细胞参与炎症反应的病理组织。如数据所示4(我)4(左),有大量的红细胞在血管周围。出血的表现有缺陷的肿瘤血管壁屏障功能(24]。这些在肿瘤血管内皮间隙也可以作为肿瘤细胞进入流通渠道,形成转移(25]。根据这些结果,可以正确识别异常血管肿瘤MPM成像。

数据4(m) -4(p)显示血管(黄色箭头)入侵的肿瘤细胞在肿瘤微环境(白色箭头)。这表明肿瘤细胞转移或转移的可能性。直接从宋惠乔形象,胶原纤维(蓝色箭头)是与血管平行的边界。在船的另一边,一束束的胶原纤维(红色箭头)是垂直于血管的边界。同时,宋惠乔成像清楚地表明,基底膜(粉色箭头)的血管被摧毁了,这使得肿瘤细胞更容易侵入血管。肿瘤细胞优先入侵沿着笔直的胶原纤维,从而促进内渗(26]。与MPM的图像相比,胶原纤维在H&E-stained图像无法认清。这种能力来确定胶原纤维是一种利用MPM的成像。

量化形态学特征的差异之间的正常和异常血管,正常和异常的血管壁的厚度进行了计算。图6正常和异常的定量分析结果显示血管壁。异常血管的墙壁 μ米( ),而正常的血管 μ米( ),因为肿瘤血管血管稳定性差,质量差,薄墙(25]。两组之间的差异也非常显著( )。执行的统计分析是使用IBM SPSS统计24。

4所示。讨论

MPM成像有可能适用于术中label-free病理诊断(27]。它越来越广泛地应用于医学影像包括血管成像。在这项研究中,有几个内生荧光团如胶原蛋白、弹性蛋白纤维,内皮细胞和血管壁的平滑肌。内生荧光团的形态细节的血管壁明显MPM的图片所示。MPM可以清楚地显示血管壁层结构。然后,发射光谱的不同层血管壁。我们可以区分血管壁的三层结构的光谱信息和正确识别不同类型的血管通过MPM成像。可以看出,MPM有能力想象各种特性的血管肿瘤微环境,这可能为病理学家和外科医生提供辅助诊断指标。与传统的圆)染色法相比,MPM是区分胶原纤维更有效。

现在众所周知,肿瘤细胞之间的相互作用和它们的微环境对肿瘤进展和转移(很重要28]。在肿瘤微环境中,巨噬细胞是血管生成的重要推动者和巨噬细胞与肿瘤细胞相互作用导致肿瘤细胞入侵和出口到血管(20.]。同样,排列的胶原纤维指导肿瘤细胞内渗(26]。高血管渗透性可能促进癌症的转移和扩散。有通用的协议,在肿瘤血管网络在经济增长中发挥核心作用,肿瘤的诊断和治疗。没有血管,肿瘤不能超出临界大小或转移到其他器官。同样,没有血液运输,我们可能无法提供有效抗癌药物肿瘤区域(29日]。因此,需要先进的成像技术来监测病人血管的变化。各种成像技术可用于血管成像,如MRI、CT、宠物,和荧光成像。然而,这些成像技术仍然有一些缺点,包括低分辨率、灵敏度差,需要对比剂和外源荧光标记。MPM的优点是,它可以可视化血管在细胞和分子水平不使用这些外部标记。在这项研究中,MPM成像能准确识别血管和明显的显微组织观察血管肿瘤微环境的变化。

5。结论

总之,我们证明了label-free MPM是一种很有前途的技术,研究血管的形态学特性的墙。近年来,双光子microendoscopic成像技术的发展提供了可能性体内脑成像(30.]。如果多光子内镜技术的标准化,它将使人体的实时无创成像,从而避免不必要的活检。小型化的MPM内镜,MPM成像将提供准确的术中诊断血管形态学的体内。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Gangqin Xi和Ning曹了同样的工作。

确认

这项工作是由福建省卫生和教育研究的共同基金(WKJ2016-2-28),中国国家自然科学基金(批准号81671730),专项资金的中央政府指导地方科技发展(2017 l3009),并计划在大学长江学者和创新研究团队(IRT_15R10)。

引用

1. 解剖学和生理学、8 i Peate。”循环系统”,英国医疗杂志》的助理,12卷,不。2、62 - 67年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. n Dudvarski斯坦科维奇,m . Teodorczyk r . Ploen f .氧化锌碘仿糊和m·h·h·施密特”Microglia-blood容器交互:一把双刃剑在大脑疾病,”Acta Neuropathologica,卷131,不。3、347 - 363年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. 飞驒,k . n . Maishi d·安南,飞驒,y”的贡献肿瘤内皮细胞在癌症的发展过程中,“国际分子科学杂志》上,19卷,不。5,1272年,页2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. p . a . Campochiaro“视网膜和脉络膜的血管疾病的分子发病机制。”在视网膜和眼睛的研究进展49卷,第81 - 67页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. F.-K。陆,d . Calligaris o . i Olubiyi et al .,“Label-free神经外科病理学与受激拉曼成像,”癌症研究,卷76,不。12日,第3462 - 3451页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. d·m·麦克唐纳和p . l . Choyke”从显微镜成像的血管生成:诊所。”自然医学,9卷,不。6,713 - 725年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. p . k . Upputuri k . Sivasubramanian c . s . k .马克和m . Pramanik”最近的事态发展在血管成像技术在组织工程和再生医学,”生物医学研究的国际ID 783983条,卷。2015年,9页,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. j .最终r . Laham m . Post, t . lein和m·西蒙斯,“医疗成像技术评价治疗性血管生成策略,”当前的药物设计,8卷,不。16,1467 - 1496年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. 傅d, t, t·e·马修斯b . j . Chen g . Yurtserver和w·s·沃伦,“高分辨率体内血管成像没有标签,”光学信,32卷,不。18日,第2643 - 2641页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 林y, y, y连et al .,“识别两种常见类型的基于多光子显微镜乳腺良性疾病,”扫描卷,2018篇文章ID 3697063, 6页,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. w . l . Li江,杨y . et al .,“脏坏死在结直肠癌研究识别基于多光子显微镜,”《生物医学光学,19卷,不。6日,第066008条,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. 卓和j·陈,“间质改变作为上皮肿瘤恶化的定量光学生物标记,”扫描,36卷,不。3,285页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. j . a . Rhodin“血管壁的架构,”手册的生理的第2卷心血管系统,页1 - 31,美国Physiologial社会,马里兰州的贝塞斯达,1980。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. r·小“胶原代谢:比较影响胶原的胶原蛋白和疾病的疾病,”美国病理学杂志》上,卷98,不。1,第280 - 225页,1980。视图:谷歌学术搜索
15. 作者将和美国歌曲,“周血管形成和维护的角色,”Neuro-Oncology,7卷,不。4、452 - 464年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. d . Ribatti b·尼科大肠Crivellato, a . Vacca“肿瘤的血管网络的结构。”癌症的信,卷248,不。1、18 - 23,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. l . Claesson-Welsh“血管permeability-the必需品。”乌普萨拉医学科学杂志》上,卷120,不。3、135 - 143年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. b·d·罗宾逊·g·l·西卡Y.-F。刘et al .,“在人类乳腺癌转移的肿瘤微环境:一个潜在的预后标记与血性的传播,”临床癌症研究,15卷,不。7,2433 - 2441年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. e . n . Arwert A·s·哈尼d Entenberg et al .,“单向过渡从迁移到血管周的巨噬细胞需要肿瘤细胞内渗,”细胞的报道,23卷,不。5,1239 - 1248年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. j·w·波拉德,“巨噬细胞定义入侵微环境在乳腺癌,”《白细胞生物学,卷84,不。3、623 - 630年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. j . Condeelis和j·w·波拉德,“巨噬细胞:专性合作伙伴对肿瘤细胞迁移,入侵和转移,”细胞,卷124,不。2、263 - 266年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. h . Hashizume·巴s Morikawa et al .,“有缺陷的内皮细胞之间的开口解释肿瘤血管泄漏,”美国病理学杂志》上,卷156,不。4、1363 - 1380年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. k·l·费边和w . j . Storkus“免疫治疗针对肿瘤相关血管。”实验医学和生物学的发展卷,1036年,第211 - 191页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. p .巴h . Hashizume, d . m .麦当劳“癌症细胞异常血管的目标,“当前在遗传学和发展意见,15卷,不。1,第111 - 102页,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. a·c·达德利,“肿瘤内皮细胞,”冷泉港医学视角,卷2,不。第三条a006536, 2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. w·汉,陈,w .元et al .,“面向胶原纤维直接肿瘤细胞内渗,”美国国家科学院院刊》上,卷113,不。40岁,11208 - 11213年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. m . Jain n . Narula a Aggarwal et al .,“多光子显微镜:潜在的“光学切片”工具,实时评估肺肿瘤而不需要外源造影剂,”病理学和实验室医学档案,卷138,不。8,1037 - 1047年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. n Maishi和k .飞驒肿瘤内皮细胞促进肿瘤转移。”癌症科学,卷108,不。10日,1921 - 1926年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. p . Carmeliet和r·k·贾殷”,血管生成在癌症和其他疾病。”自然,卷407,不。6801年,第257 - 249页,2000年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. w·Piyawattanametha e·d·科克尔,l·d·伯恩斯等。”在活的有机体内大脑成像使用便携式2.9 g双光子显微镜基于微机电系统扫描镜,“光学信,34卷,不。15日,第2311 - 2309页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2019 Gangqinξet al。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。